用于从疫苗离析和量化抗原的方法

用于从疫苗离析和量化抗原的方法
【专利摘要】本公开涉及在缺乏可用抗原标准品的情况下开发用于量化疫苗组合物中的抗原的改进方法。更具体地说，本公开提供了从疫苗组合物分离抗原的快速和稳健方法，包括在没有去污剂和没有烷基化的情况下溶解抗原、使用酸化防止抗原亚型再次结合、用色谱法离析抗原亚型和用氨基酸分析量化所洗脱的抗原的步骤。本公开的方法适于用于各种抗原，由此在迄今为止疫苗制造的领域中提供改进方法。
【专利说明】用于从疫苗离析和量化抗原的方法
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2011年4月21日提交的序列号61/477，835的美国临时专利申请的权益，该临时申请以引用的方式整体并入本文。
[0003]领域
[0004]本公开通常涉及疫苗领域及用于在没有已知标准品的情况下离析和测量疫苗中的抗原含量的方法。
[0005]背景
[0006]流感病毒基于其核蛋白抗原和基质蛋白抗原之间的抗原性差异通常分为三类:A、B和C。取决于两种主要病毒表面糖蛋白:血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性质，流感病毒进一步分为亚型。HA和NA均携带抗原表位。产生针对HA和NA的抗体与抵抗人类和动物中的感染和/或疾病相关联。针对流感接种疫苗的功效很大程度上由疫苗中的免疫原性HA的量来决定。因此，A型和B型流感病毒的主要的抗原决定簇是HA而对流感接种疫苗的功效很大程度上由疫苗中的免疫原性HA的量即抗原含量来决定。
[0007]迄今为止，抗原含量用世界卫生组织合作中心(以下称为“WHO”)提供的国际标准品来测量，其用于测定抗原值例如疫苗的HA含量。然而，通常，当标准品不可用时，例如当病毒抗原的不同季节菌株存在抗原性差异(即较低同源性)或当存在病毒的大流行爆发而对于其尚无可用标准品时，疫苗由疫苗制造商制备。
[0008]这种大流行病爆发发生在2009年4月，当墨西哥、美国和几个其它国家中A型流感/加利福尼亚/07/2009 HlNl大流行病爆发时，组合来自人类、猪和禽流感的基因的新型流感菌株进化，最初称为“猪流感”。在此特定的情况下，在WHO具有用于Hl抗原的可用标准品之前，需要疫苗。在2009年9月，美国食品和药品管理局批准了针对2009年HlNl流感病毒的四种疫苗。然而在开发这些疫苗的时候，仍然没有可用的WHO标准品来量化新疫苗中的HA。
[0009]数十年来，已经使用具有由世界卫生组织(WHO)合作中心提供的国际标准品的单向辐射免疫扩散(SRID或SRD)对流感疫苗的HA含量进行了测定。这些国际标准用于测定抗原值例如疫苗的HA含量。在SRID中，流感病毒颗粒被去污剂破坏，并且被呈递使其在载有抗体的琼脂糖凝胶中在室温下免疫扩散三天。在凝胶染色时，测量抗原-抗体复合物的沉淀区域的直径，并且通过使用用具有已知HA含量的这种亚型的整个病毒参考批次获得的校准曲线，计算某亚型的病毒制剂的抗原含量。然而，SRID是费力且低通量的测定法。此外，特别对于未经纯化的(过程中的)流感病毒，灵敏度、准确度和精确度相对较低。
[0010]Kapteyn等(Vaccine 24:3137-44, 2006 ;“Kapteyn”)公开了用于量化流感病毒培养中的HA以及用于鉴定来自三价疫苗中的单个流感菌株的HA的RP-HPLC测定法。然而，Kapteyn的方法不在没有标准品的情况下量化HA。另外，Kapteyn使用去污剂溶解抗原和烷基化以防止具有活性巯基基团的蛋白质重新结合并形成复合物。实际上，在Kapteyn的方法中，HA通过使用强去污剂溶解膜而被完全离析。Kapteyn的方法也没有被描述适于量化来自福尔马林灭活的流感菌株的HA。[0011]因此，迄今为止本领域没有公开用于准确地和有效地测定粗制或纯化HA样品中的HA抗原浓度的方法，特别是在不用去污剂或烷基化试剂处理的样品中以及在缺少由WHO合作中心提供的HA蛋白标准品下。显然，在可从WHO合作中心得到抗原标准品之前，在本领域中非常需要用于在疫苗制造中可靠离析和量化包括病毒抗原诸如HA抗原的抗原的稳健、准确和快速的方法。下面的公开描述了此类方法的详情。
[0012]概述
[0013]开发本文描述的方法以在缺乏可用抗原标准品的情况下提供测量疫苗中的抗原含量的装置。因此，本发明解决本领域中涉及在不需要国际标准品的情况下、在疫苗开发和制造过程期间快速和准确量化疫苗中的抗原浓度的一个或多个需要。因此，本文提供的方法允许疫苗制造商在不等待WHO开发和提供标准品的情况下更快地生产疫苗，该疫苗可以被传递给公众。
[0014]更具体地说，本发明在不使用标准品的情况下提供离析和准确量化疫苗抗原的快速和稳健方法，其是准确且可重复的。本公开适于用于各种抗原，由此在迄今为止疫苗制造的领域中提供改进方法。
[0015]本发明提供了用于从疫苗组合物离析抗原的方法，该方法包括以下步骤:(a)在没有去污剂和没有烷基化试剂的情况下溶解疫苗组合物中的抗原；和(b)通过分级分离离析抗原或抗原亚型。
[0016]在一些方面中，溶解步骤通过还原进行。在一些方面中，还原包括用二硫苏糖醇处理疫苗组合物。在一些方面中，还原包括约5分钟至约20小时的孵育时间。在其它方面中，还原包括约30分钟至约2小时的孵育时间。在更具体的方面中，还原包括约I小时的孵育时间。在另外的方面中，还原包括约20°C至约100°C的孵育温度。在各种方面中，还原包括约50°C至约90°C的孵育温度。在某些方面中，还原包括约85°C的孵育温度。在进一步的方面中，还原步骤是受pH控制的。在各种方面中，还原在约pH 6至约pH 11的pH下进行。在特定方面中，还原在约PH 7至约`pH 10的pH下进行。在附加方面中，溶解步骤还包括用离液剂变性。在各种方面中，离液剂是盐酸胍、脲、硫脲、锂、高氯酸盐或硫氰酸盐。在另外的方面中，还原还通过酸化抗原或抗原亚型来进行，以防止在分离的抗原亚型之间形成二硫键。在各种方面中，用磷酸、盐酸、硫酸、三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸或甲酸进行酸化。
[0017]在一些方面中，分级分离通过色谱法进行。在各种方面中，色谱法是高效液相色谱法(HPLC)、反相HPLC (RP-HPLC)、离子交换HPLC (IEX-HPLC)、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法(HIC)或尺寸排阻色谱法(SEC)。在示例性方面中，色谱法是反相(RP)-HPLC。
[0018]本发明还提供用于量化疫苗组合物中的抗原或抗原亚型含量的方法。此类方法包括上文所述的的用于从疫苗组合物离析抗原的所有方法(具有量化抗原或抗原亚型的另一步骤)。在示例性方面中，量化步骤在不使用抗原标准品的情况下进行。在各种方面中，量化步骤包括通过氨基酸分析量化抗原。在一些方面中，抗原是病毒的或细菌的。在某些方面中，抗原是血凝素(HA)。在特定方面中，HA来自流感病毒疫苗组合物、麻疹病毒疫苗组合物、副流感病毒疫苗组合物或腮腺炎病毒疫苗组合物。在一些方面中，疫苗组合物是流感病毒疫苗组合物。在另外的方面中，流感病毒疫苗组合物提供对选自由A型流感和B型流感组成的组的流感病毒的防护作用。在各种方面中，抗原亚型是A型流感HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HA10、HA11、HA12、HA13、HA14、HA15 和 HA16 与 B 型流感 HA 的任一种。在某些方面中，抗原亚型是4型流感撤亚型撤1、撤2、撤3、撤5、撤7、撤9、撤10或B型流感HA。在示例性方面中，A型流感HA亚型是HAl。在另外的方面中，流感疫苗组合物提供对选自由 A 型流感 HlNl、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2、H10N7和B型流感组成的组的流感类型的防护作用。在各种方面中，该方法量化抗原含量，其相对标准偏差(RSD)小于约2.5%。在更具体的方面中，RSD为约2.2%。在进一步更具体的方面中，RSD为约1.3%ο
[0019]上述概述并非意图定义本公开的每个方面，并且附加方面在其它部分例如下列详述中有所描述。整个文件旨在作为统一的公开相关联，并且应当理解，涵盖本文所述特征的所有组合，即使这些特征的组合并不一起存在于本文件的同一句子、或段落或章节中。本发明的其它特征和优势根据下列详述将变得明显。然而，应该理解，虽然指示本公开的具体实施方案，但是该详述和具体实施例仅通过说明的方式给出，因为从此详述中，本公开的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得明显。
[0020]详述
[0021]本公开提供了用于在缺少国际标准品例如世界卫生组织(WHO)国际标准品下在疫苗开发和制造中离析和制备抗原以及测定抗原浓度的新方法，WHO国际标准品是具有确定生物活性的生物参考制剂。该方法包括在现有技术上的改进，即通过在不使用去污剂和不使用烷基化的情况下溶解来自疫苗组合物中的病毒的抗原。溶解的抗原然后通过分级分离来分离和通过定量氨基酸分析来量化。
[0022]WHO国际标准品的适时可用性充当世界范围内疫苗制造中生物学测量的比较的基础。然而，当新病毒爆发且标准品需要制备时，这些WHO国际标准品不是现成的。迄今为止，问题是，响应于新病毒的爆发，疫苗制造商被迫迅速开发和生产新疫苗，同时等待WHO国际标准品的递送以量化其新疫苗中的抗原。通过提供用于量化抗原而不需要WHO国际标准品的新方法，本公开的方法提供了这个问题的解决方案。
`[0023]迄今为止，用于分离和回收源于病原体的抗原的方法的另一问题是，使抗原与其它蛋白分离不是最优的。在本领域中，所关注的抗原蛋白峰的分辨率较差，回收率低且不是定量的，以及样品制备时间较长。本公开通过使用色谱法离析样品中的抗原来解决许多这些问题，该样品在不使用去污剂以及(在示例性方面中)在没有烷基化的情况下被变性和还原以保护抗原上的巯基基团。因此，样品制备时间大大减少以及副反应较少。使用色谱法离析抗原后，抗原浓度在不使用国际标准品的情况下被量化。在更特定的方面，进行定量氨基酸分析作为抗原量化的替代方法。
[0024]来自现有技术的待解决的问题是提供准确、快速和稳健的方法，该方法可应用于抗原的高通量分离、纯化和量化。在更特定的方面，待解决的问题是在不使用去污剂、无需烷基化以及无需抗原标准品的情况下提供此类方法。本文描述的方法显示，血凝素(HA)抗原、特别是主决定簇HAl与存在于制剂中的其它蛋白质分离得非常好并且具有高纯度，并通过将它与其它(已知)值、内标比较或通过定量氨基酸分析，允许本领域技术人员来测定存在于制剂中的抗原的量。
[0025]更具体地说，本公开涉及用于分离HA抗原的新方法，该方法包括在没有去污剂的情况下应用可溶性抗原制剂并且(在一方面中)在色谱柱上分级分离该抗原的步骤。在某些方面中，本公开还包括从该柱上洗脱HA抗原，而在甚至进一步的方面中，通过AAA量化抗原。
[0026]在详细解释本公开的任何实施方案之前，然而，应当理解，本公开在其申请中不限于下面描述中陈述的或附图和实施例所示的部件的结构和布置的细节。本文使用的部分标题仅用于编制目的，并且不被解释为限制所描述的主题。此申请中所列的全部参考文献以引用的方式明确地并入本文。
[0027]本公开包含其它实施方案并且以各种方式实践或执行。此外，应当理解，本文使用的用语和术语是为了描述的目的且不应被视为限制性的。术语“包括”、“包含”或“具有”及其变化意指涵盖其后列出的项目和其等同物以及附加项目。
[0028]定义[0029]除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
[0030]下列缩写词贯穿使用。
[0031]AA 氨基酸
[0032]AAA 氨基酸分析
[0033]DNA 脱氧核糖核酸
[0034]EDTA 乙二胺四乙酸
[0035]HA血凝素
[0036]HA1-16 血凝素亚型 1-16
[0037]HPLC 高效液相色谱法
[0038]HIC 疏水相互作用色谱法
[0039]IEX-HPLC 离子交换 HPLC
[0040]kDa千道尔顿
[0041]LC-MS/MS 液相色谱串联质谱法
[0042]MALDI/T0F 基质辅助激光解析电离/飞行时间质谱法
[0043]MVB单价原液
[0044]RSD相对标准偏差
[0045]RP-HPLC 反相 HPLC
[0046]SDS十二烷基硫酸纳
[0047]SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0048]SEC尺寸排阻色谱法
[0049]SRD单向辐射免疫扩散
[0050]UV紫外线
[0051]这里注意，如本说明书和所附的权利要求书所用的，除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一种/ 一个(a)”、“一种/ 一个(an)”和“该(the) ”包括复数指示物。
[0052]如本文所用的，除非另外说明，否则下列术语具有归于它们的含义。
[0053]术语“多肽”和“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地使用，是指通过肽键链接的氨基酸残基的聚合物。“蛋白质”一般指大的多肽。“肽”一般指短的多肽。
[0054]还需要明确理解，本文所引用的任何数值包括较低值至较高值的所有值，即，所列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能组合被认为在本申请中明确规定。例如，若浓度范围规定为约1%至50%，则数值诸如2%至40%、10%至30%或1%至3%等意图明确列举在此说明书中。上面所列的值仅仅是特别预期的实例。
[0055]在各种方面中，范围在本文表示为“约(about)”或“大约(approximately)”一个特定值和/或至“约”或“大约”另一特定值。术语“几乎”也可以与术语“大约”互换使用。当数值通过利用先前的“约”表示为近似值时，应当理解，某些变化量包括在该范围内并且包括公开或引用值的值+/_10%、+/-5%和+/-1.0%。
[0056]“流感”是指正粘液病毒科(Orthmyxoviridae)家族中流感病毒A、B和C三种类型的任一类型。只有A型和B型流感导致季节性暴发。经由通过血凝素(HA)结合到通常在哺乳动物的鼻、咽喉和肺中以及鸟类的小肠中的上皮细胞的表面上的唾液酸糖，流感病毒感染其宿主。
[0057]A型流感类具有一个物种，A型流感病毒。基于HA蛋白(H1-16)和神经氨酸酶蛋白(N1-9)的血清学特性，A型流感被分为亚型或血清型。根据血凝素和神经氨酸酶的组合命名流感亚型,例如HxNy。已在人类中证实的、通过已知的人类大流行病死亡的数量排序的亚型包括但不限于 H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3 和 H10N7。B 型流感类具有一个物种，B型流感病毒。B型流感比A型变异速率慢2-3倍并因此遗传差异小，只有一种B型流感血清型。C型流感类具有一个物种，C型流感病毒，其感染人类、犬和猪，有时导致严重疾病和区域流行病。然而，C型流感比其它类型少见。
[0058]术语“抗原”或“抗原亚型”是指能够被选择性结合试剂诸如抗体结合并另外能够用于在对象中产生能够结合每个抗原的表位的抗体的分子或分子的一部分。在各种方面中，抗原具有一个或多个表位。在示例性方面中，HA是抗原。HA是负责将病毒结合到被感染的细胞的抗原糖蛋白。迄今为止鉴定出至少有17种不同的HA抗原，标记为HA1-HA16或者可选地A型流感的H1-H16，以及B型流感的至少一种已知HA抗原。H1、H2和H3通常发现于人类A型流感中，和B型流感HA抗原通常发现于人类B型流感中。本公开包括分离和量化所有已知和未知的HA病毒蛋 白质的方法，所述HA病毒蛋白质包括但不限于HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HA10、HA11、HA12、HA13、HA14、HA15、HA16 和 B 型流感 HA的任一种。
[0059]术语“抗原含量”或“抗原浓度”是指抗原的量，即疫苗样品中抗原的浓度。
[0060]术语“疫苗”或“疫苗组合物”是指改善对特定疾病(例如，流感)的免疫力的生物制剂。术语“疫苗”或“疫苗组合物”在本文可互换使用来描述所有疫苗配方，包括疫苗研发和制造中涉及的入流_、上游-和下游-过程的制剂。
[0061 ] 术语“标准品”或“国际标准品”或“国际参考标准品”或“抗原标准品”指的是由管理机构例如由世界卫生组织(WHO)或WHO合作中心提供的、具有确定生物活性的生物参考制剂。
[0062]“相对标准偏差”、“RSD”或“％RSD”是变异系数的绝对值。它通常表示为百分数。有时所用的类似术语是相对方差，其是变异系数的平方。而且，相对标准误差是通过标准误差除以估值然后乘以100获得、被表示为百分数的统计估值的可靠性的量度。RSD广泛用于分析化学以表达测定法的精确度和可重复性。RSD=(数组X的标准偏差)X 100/(数组X的平均值)。
[0063]本文使用的部分标题仅用于编制目的，并且不被解释为以任何方式限制所描述的主题。
[0064]从疫苗离析抗原
[0065]本公开包括用于从疫苗组合物离析抗原(包括但不限于HA抗原)的方法。在示例性实施方案中，流感病毒疫苗从卵源材料或来自细胞培养的病毒材料的上游、入流或下游过程获得。来自疫苗组合物的抗原然后在没有去污剂的情况下溶解。
[0066]抗原溶解，也称为病毒裂解，包括使用化学或物理方法破坏病毒来离析一种或多种抗原用于进一步离析和量化。在示例性方面中，溶解步骤在不使用去污剂的情况下通过还原来进行。在本文描述的方法中不使用去污剂，因为它们结合蛋白质并改变其性质，即去污剂污染离析的抗原并干扰抗原浓度的精确测定所需的色谱分离。
[0067]因此，抗原溶解通过不是去污剂且可还原蛋白质二硫键的任何还原剂进行。合适的还原试剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、三[2-羧乙基]膦盐酸盐(TCEP)、Protein-S-S-Reductant?(G Biosciences'、，Maryland Heights, MO)、β-疏基乙醇、β-疏
基乙胺、硫代丙基-琼脂糖、硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硫代磷酸钠、亚硫酸盐和亚硫酸盐生成剂、二硫赤藓糖醇、三丁基膦、谷胱甘肽、巯基乙酸盐、2，3- 二巯基丙醇或过甲酸。在各种方面中，盐酸胍或另一离液剂诸如但不限于脲、硫脲、锂、高氯酸盐和硫氰酸盐也用于溶解反应缓冲液中。离液剂使蛋白质变性但不能沉淀蛋白质。用于进行蛋白质还原的化合物和方法是本领域技术人员熟知的。本文实施例中更详细描述了具体还原溶液和条件。
[0068]在示例性方面中，还原缓冲液或还原剂将HA分子之间的二硫键还原成相应的亚单位例如HAl和ΗΑ2并从病毒释放例如HAl。在某些方面中，以约lmM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、llmM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM或500mM的浓度使用DTT。在更特定的方面中，以例如范围从约20mM至约IOOmM的浓度使用 DTT。`
[0069]在示例性方面中，还原包括约5分钟至约20小时、约10分钟至约10小时或约30分钟至约2小时的孵育时间。在某些方面中，孵育时间为约I小时。因此，孵育时间为5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约I小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时、约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约9.5小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时或约20小时。本文实施例中更详细描述了具体还原时间。
[0070]在其它方面中，还原包括约20°C至约100°C的孵育温度。在特定方面中，还原包括约50°C至约90°C的孵育温度。在更特定的方面中，还原包括约85°C的孵育温度。因此，孵育温度为约 20°C、约 25°C、约 30°C、约 35°C、40°C、约 45°C、约 50°C、约 55°C、约 60°C、约650C，约70 V，约75°C、约80 V、约85°C、约90 V、约95°C或约100°C。本文实施例中更详细描述了具体还原温度。
[0071]在另一方面中，还原抗原是受pH控制的。在各种方面中，还原反应在约pH 6至约pH 11的pH下进行。在特定方面中，pH为约pH 7至约pH 10。在更特定的方面中，pH为约
7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9-,9.0-,9.1-,9.2-,9.3-,9.4-,9.5-,9.6-,9.7-,9.8-,9.9 和 10.0。
[0072]在示例性方面中，在没有烷基化的情况下进行还原。烷基化保护还原后蛋白质的巯基基团并防止游离半胱氨酸的逆反应。因此，烷基化通常用于防止分离的HA抗原例如HAl和HA2与其它蛋白质的重新结合和/或复合物形成。然而，使用烷基化试剂如4-乙烯基吡啶降低蛋白纯度，如本文实施例中更详细描述的。因此，为了防止分离的抗原例如HAl和HA2与其它蛋白质的重新结合和/或复合物形成，在不使用烷基化试剂的情况下保护所有蛋白质的疏基基团。
[0073]在示例性方面中，为了在进一步不使用烷基化试剂的情况下防止分离的抗原与其它蛋白质的重新结合和/或复合物形成，通过酸化的质子化来保护还原的蛋白质巯基基团。酸化防止二硫键形成，因为对于二硫键形成，巯基基团需要至少部分地呈离子形式。酸化是简单而有效的处理方法，其中监测并调节PH以防止抗原沉淀。在各种方面中，用磷酸、盐酸、硫酸、三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸或甲酸进行酸化。在示例性方面中，用磷酸进行酸化；然而，使用磷酸酸化不是限制性的，因为使用本领域中所有其它的酸化方法。酸化的方法是本领域熟知的并且在本文中不作进一步的阐述。本文实施例中更详细描述了具体酸化溶液和条件。
[0074]抗原分级分离
[0075]在还原和酸化后，抗原通过分级分离离析。在示例性方面中，分级分离通过色谱法进行。使用本领域已知的任何合适类型的色谱法。例如，此类合适类型的色谱法包括但不限于高效液相色谱法(HPLC)、反相HPLC (RP-HPLC)、离子交换HPLC (IEX-HPLC)、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法(HIC)或尺寸排阻色谱法(SEC)。
[0076]在一些方面中，抗原分级分离通过RP-HPLC进行。因此，合适类型的反相柱包括但不限于具有从C2到C18不等的各种改性的、多孔、非多孔或整体式的硅胶柱或基于聚合物的柱。适用于分析目的的柱直径通常是，但不限于，约75 μ m至约5_的范围，取决于流速，流速可以不同地从约0.1 μ 1/min`变化至约5ml/min。对于足够量的抗原的离析,通常使用具有约Imm至约IOmm的直径的柱。用通常含有调节剂(诸如但不限于盐酸、硫酸、三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸、甲酸、磷酸和磷酸盐缓冲液)的含水溶剂与有机溶剂(诸如但不限于乙腈、甲醇、乙醇、丁醇、丙醇、异丙醇和四氢呋喃)的混合物，从反相柱分离并洗脱蛋白质。用于蛋白质的反相HPLC的方法是本领域熟知的并且在本文不作进一步的阐述，因为它们可以通过本领域技术人员进行。本文实施例中更详细描述了具体的反相HPLC方法和条件。
[0077]如本文实施例中描述的，通过色谱法进行的抗原分级分离提供了极好的线性度和精确度，且相对标准偏差(RSD)较低。线性度，即获得直接与样品中分析物的浓度(量)成比例的试验结果的能力(在一定范围内)，在任何分析程序中是重要的。分析程序的精确度表达在多个指定条件下从均一样品的多次采样获得的一系列测量之间的一致接近度(分散程度)。在各种方面中，在三个层面:可重复性、中间精确度和可再现性上考虑精确度。
[0078]抗原量化
[0079]在不使用国际标准品的情况下，在通过分级分离进行离析之后用于量化抗原或抗原亚型的方法被包括在本公开中。用于量化分级分离的抗原的合适方法包括但不限于氨基酸分析(AAA)、氮测定(凯氏)、质谱法以及同位素稀释质谱法。[0080]在示例性方面中，抗原浓度使用AAA进行测定。AAA指的是用于测定氨基酸组合物和/或基于抗原和氨基酸的分子量来量化组合物中抗原的浓度的方法。使用本领域技术人员已知的常规技术进行AAA。AAA不仅是适用于精确测定蛋白质量的工具，而且还提供有关相对氨基酸组合物和游离氨基酸的详细信息。参见氨基酸分析协议:分子生物学方法(Amino Acid Analysis Protocols:Methods in Molecular Biology),第159卷(由 Cooperet al等人编辑，?.2001 Humana Press Inc., Totawa, NJ)。相对氨基酸组合物给出蛋白质的特征图，其通常足够用于鉴定蛋白质。它通常用作决策支持用于选择用于蛋白质片段化的蛋白酶。[0081]通常，AAA包括水解，然后分离、检测和量化。水解或“酸水解”通常通过酸性条件实现。例如，标准程序是用6M盐酸(24小时，Il(TC)水解。该标准程序是时间要求和温度之间的折衷，并可以通过本领域技术人员来调整。在示例性方面中,进行水解时间研究以确定用于HA的最佳水解的时间。然而，对于根据本公开的方法量化的每个单独的抗原，水解时间可以被优化。用于AAA的程序是本领域熟知的且用于AAA的产品是商业可得的(AccQ标记试剂盒(Waters, No WAT052880)和Sigma-Aldrich)。在一些实施方案中，使用ZorbaxEclipse AAA HPLC柱。本领域普通技术人员知晓进行AAA的各种方法。本文实施例中更详细描述了具体AAA程序。
[0082]基于特定抗原的已知序列，计算每个抗原分子的理论氨基酸数并随后计算每次注射的抗原摩尔量。在样品制备期间，计算或测量抗原的分子质量和应用的稀释因子允许计算样品中的抗原浓度，表示为μ g抗原/mL样品。
[0083]在示例性方面中，本文下面提供了计算HA浓度的公式。
[0084]nμA1=nAA/xAA
[0085]nμ1..血凝素HAl的摩尔量[μ mol]
[0086]nAA…单个氨基酸的摩尔量(由氨基酸分析产生的结果)[μ mol]
[0087]xAA…单个氨基酸的数量/血凝素HAl分子
[0088]nμA1=nHA[0089]1?…血凝素的摩尔量[μ mol]
[0090]IHha=IIha^Mha
[0091]IIha…血凝素的摩尔量[μ mol]
[0092]1?…HA 的质量[μ g]
[0093]Mha…血凝素的分子质量(计算或测定的)[μ g* μ moF1]
[0094]Cha=Hiha^dfZv1
[0095]Cha…血凝素的浓度[μ g/ml]
[0096]DF…稀释因子
[0097]Vi…注射体积[ml]
[0098]在本公开的示例性实施方案中，HA的量化基于HAl的峰面积，HAl与其它疫苗组分很好地分离。本公开的应用性已经证实用于包括但不限于HlNl、H3N2、H5N1、H9N2的不同A型流感亚型和B型流感，强烈表明本文公开的方法可以广泛应用于不同HA抗原。本公开已经对于来自流感的HA进行了详细描述，但不限于仅使用来自流感的HA。本公开还可应用于来自其它病毒的HA抗原并应用于其它抗原或抗原亚型的分离和量化。[0099]测定本文所述的疫苗组合物中抗原浓度的方法测量抗原浓度，RSD小于约5%、小于约4%、小于约3%、小于约2.9%、小于约2.8%、小于约2.7%、小于约2.6%、小于约2.5%、小于约2.4%、小于约2.3%、小于约2.2%、小于约2.1%、小于约2.0%、小于约1.9%、小于约1.8%、小于约1.7%、小于约1.6%、小于约1.5%、小于约1.4%、小于约1.3%、小于约1.2%、小于约1.1%和小于约1.0%。在示例性方面中，取决于抗原浓度，本文描述的方法测量抗原浓度，RSD为约2.2%和约1.3%ο
[0100]本文引用的每个出版物、专利申请、专利和其它参考通过引用以与本公开不相抵触的程度整体并入。
[0101]应理解，本文所述的实施例和实施方案仅为了举例说明的目的，并且本领域技术人员将想到根据本发明的各种修改或变化，这些均包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请为了所有目的据此通过引用整体并入。
实施例
[0102]本公开的附加方面和细节根据下列实施例将是明显的，这些实施例旨在是说明性的而非限制性的。
[0103]实施例1:
[0104]开发和优化用于离析和量化疫苗中的HA的方法
[0105]本文所述的实验的目的是开发新HPLC方法，该方法基于当没有标准试剂可从WHO或其它地方得到时HA (即HAl)的测量结果来测量A型流感/加利福尼亚/07/2009 (HlNl)的疫苗制剂的总HA含量。
[0106]评估A型流感/加利福尼 亚/07/2009 (HlNl)的以下批次的新产品:
[0107]表1:试验和参考项目

蛋白质含量
___( g/ml)
[0108]I__小规模批次__149
2__大规模批次__530
3__大规模批次__373
[0109]通过反相HPLC量化HA
[0110]如下优化样品制备条件。未稀释的样品或用去离子水稀释的样品与相同体积的还原缓冲液(6M盐酸胍、266mM Tris/HClUmM EDTA、pH 8.3、40mM 二硫苏糖醇)混合。将样品在85°C下孵育I小时，然后加入10%(v/v)8.5%磷酸以中止反应并防止逆反应，即防止由游离半胱氨酸形成二硫键。将18，407g样品离心10分钟以除去任何颗粒物质。使用相同的HPLC条件。
[0111]使用装备有四元泵和二极管阵列检测器的Agilent HPLC系统。使用以下梯度，在Jupiter 5 μ C4柱(150x2mm)上通过反相HPLC分离蛋白质:
[0112]洗脱液A:0.1%三氟乙酸的水溶液[0113]洗脱液B:乙腈中0.085%三氟乙酸
[0114]洗脱液C:甲醇
[0115]样品和标准品通过分离方法注射，用20%洗脱液B以0.4ml/分钟的流速等度洗脱IOmin0随后进行用于洗脱蛋白质的方法:
[0116]表2:用于HPLC分析的梯度
[0117]
【权利要求】
1.一种用于从疫苗组合物离析抗原的方法，所述方法包括以下步骤: (a)在没有去污剂和没有烷基化试剂的情况下溶解所述疫苗组合物中的所述抗原；以及 (b)通过分级分离来离析所述抗原或抗原亚型。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶解步骤通过还原进行。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述还原包括用二硫苏糖醇处理所述疫苗组合物。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述溶解步骤还包括用离液剂变性。
5.根据权利要求2-4的任一项所述的方法，其中所述还原还通过酸化所述抗原或抗原亚型来进行，以防止在分离的抗原亚型之间形成二硫键。
6.一种用于量化包括抗原的疫苗组合物中的抗原或抗原亚型含量的方法，所述方法包括权利要求1-5的任一项所述的方法以及量化所述抗原或抗原亚型的另一步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述量化步骤在不使用抗原标准品的情况下进行。
8.根据权利要求6所述 的方法，其中所述量化步骤使用抗原标准品进行。
9.根据权利要求7-8的任一项所述的方法，其中所述量化步骤包括通过氨基酸分析量化抗原。
10.根据权利要求3-9的任一项所述的方法，其中所述还原包括约5分钟至约20小时的孵育时间。
11.根据权利要求3-10的任一项所述的方法，其中所述还原包括约30分钟至约2小时的孵育时间。
12.根据权利要求3-11的任一项所述的方法，其中所述还原包括约I小时的孵育时间。
13.根据权利要求3-12的任一项所述的方法，其中所述还原包括约20°C至约100°C的孵育温度。
14.根据权利要求3-13的任一项所述的方法，其中所述还原包括约50°C至约90°C的孵育温度。
15.根据权利要求3-14的任一项所述的方法，其中所述还原包括约85°C的孵育温度。
16.根据权利要求4-15的任一项所述的方法，其中所述离液剂是盐酸胍、脲、硫脲、锂、高氯酸盐或硫氰酸盐。
17.根据权利要求4-16的任一项所述的方法，其中所述酸化用磷酸、盐酸、硫酸、三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸或甲酸进行。
18.根据权利要求1-17的任一项所述的方法，其中分级分离通过色谱法进行。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述色谱法是高效液相色谱法(HPLC)、反相HPLC (RP-HPLC)、离子交换HPLC (IEX-HPLC)、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法(HIC)或尺寸排阻色谱法(SEC)。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述色谱法是反相(RP)-HPLC。
21.根据权利要求1-20的任一项所述的方法，其中所述抗原是病毒的或细菌的。
22.根据权利要求1-21的任一项所述的方法，其中所述抗原是血凝素(HA)。
23.根据权利要求1-22所述的方法，其中所述HA来自流感病毒疫苗组合物、麻疹病毒疫苗组合物、副流感病毒疫苗组合物或腮腺炎病毒疫苗组合物。
24.根据权利要求1-23的任一项所述的方法，其中所述疫苗组合物是流感病毒疫苗组合物。
25.根据权利要求23-24的任一项所述的方法，其中所述流感病毒疫苗组合物提供对选自由A型流感和B型流感组成的组的流感病毒的防护作用。
26.根据权利要求1-25的任一项所述的方法，其中所述抗原亚型是A型流感HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HA10、HA11、HA12、HA13、HA14、HA15 和 HA16 与 B 型流感HA的任一种。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述抗原亚型是A型流感HA亚型HA1、HA2、HA3、HA5、HA7、HA9、HAlO 或 B 型流感 HA。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述A型流感HA亚型是HAl。
29.根据权利要求26-28的任一项所述的方法，其中所述流感疫苗组合物提供对选自由 A 型流感 HlNl、H1N2、H2N2、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2、H10N7 和 B 型流感组成的组的流感病毒的防护作用。
30.根据权利要求5-29的任一项所述的方法，其中所述方法量化抗原含量，其相对标准偏差(RSD)小于约2.5%。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述RSD为约2.2%。
32.根据权利要求30-31的任`一项所述的方法，其中所述RSD为约1.3%。
【文档编号】C12N7/00GK103502263SQ201280018905
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年4月18日 优先权日:2011年4月21日
【发明者】米歇尔·格兰因戈尔, 马丁·卡利沃达 申请人:巴克斯特国际公司, 巴克斯特医疗保健股份有限公司