专利名称：一种二甲四氯除草剂降解菌se08及其筛选方法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于环境污染生物修复领域，具体是一种二甲四氯除草剂降解菌SE08及其筛选方法和应用。
背景技术：
中国从1956年开始在稻田和烟田大规模使用苯氧羧酸类除草剂，其中二甲四氯除草剂因除草效果显著、价格低廉而被广泛应用。二甲四氯除草剂是激素型内吸传导选择性苯氧羧酸类除草剂，易被植物的根和叶部吸收，对植物有强烈的生理活性，低浓度时促进生长，高浓度时抑制生长。但是二甲四氯容易进入水生系统，对水生生物的毒性不容忽视。二甲四氯在土壤表面容易转移且存在污染地下水的可能性；另一方面，自20世纪70年代初以来，随着除草剂的广泛使用，杂草对除草剂产生的耐药性、抗药性问题凸显，自然界中也已产生越来越多不同类型的抗除草剂的物种，因此，消除环境中除草剂的残留危害具有重要意义。近年来，随着人们对生物修复技术研究的深入，利用微生物来降解环境中残留的除草剂已成为当今的热点。国内外学者在除草剂的微生物降解方面做了大量研究，但有关二甲四氯微生物降解的报道甚少。
发明内容
本发明所要 解决的一个技术问题是针对现有技术的不足而提供一种二甲四氯除草剂降解菌SE08，利用了该菌株降解环境中残留的除草剂，适用于降解土壤或水中的二甲四氯残留，本发明要解决的第二个技术问题是提供上述二甲四氯除草剂降解菌SE08的筛选方法。本发明要解决的第三个技术问题是提供上述二甲四氯除草剂降解菌SE08的应用。本发明的一个技术方案是:一种二甲四氯除草剂降解菌SE08，该降解菌为肠杆菌(Enterobacter sp.)，保藏编号为CGMCC N0.7016，保藏日期:2012.12.18，保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心。进一步地，上述二甲四氯除草剂降解菌SE08菌株的形态鉴定:该菌株为革兰氏阴性好氧菌，无芽孢无荚膜；在NA固体培养基上37°C培养24h，菌落的形状为椭圆，边缘整齐，表面光滑凸起，菌落为奶白色，不透明，体细胞呈短杆状，长2.(Γ2.5 μ m，宽0.6^0.8 μ m ;该菌株16S rRNA序列全长1076bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1。进一步地,NA固体培养基配方如下:牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,氯化钠5.0g,蒸懼水 1L,琼脂 20.0g，调节 ρΗ7.0-7.4，121°C 灭菌 30min。本发明的第二个技术方案是提供上述二甲四氯除草剂降解菌SE08的筛选方法，具体包括以下步骤:(I)取污染土样10.0g于三角瓶中，加入IOOmL含50mg/L 二甲四氯的无机盐培养液，25 37°C下，15(T220rpm振荡培养5天；(2)取出IOmL振荡液加入到90mL含125mg/L 二甲四氯的无机盐培养液，在25^37°C, 150^220rpm继续振荡培养5天，依次类推，提高二甲四氯浓度分别为250、500、750、1000mg/L，每隔5天，取出IOmL培养液加入到90mL含梯度升高浓度的二甲四氯无机盐培养液中，25 37°C下，15(T220rpm继续振荡培养5天；(3)取1000mg/L 二甲四氯无机盐培养液中的培养物，加入到含有浓度为20g/L琼脂的无机盐培养基中进行稀释涂布，30°C下培养5天； (4)挑取单菌落，然后在含250mg/L 二甲四氯和20g/L琼脂的无机盐培养基上采用平板划线法进行分离纯化，获得纯化的以二甲四氯为唯一碳源和能量生长的菌株。作为优选，所述无机盐培养液的配方如下=KH2PO40.5g，K2HPO40.5g，MgSO4.7Η200.2g，CaCl20.lg, NaCl0.2g 和 1.0mL 微量元素溶液，蒸馏水 IOOOmL,调节 pH 为7.0,121°C灭菌 30min。进一步地，所述的微量元素溶液配方为:ZnCl270mg，MnCl2.4H20100mg，HSb0360mg，CoCl2.6H20200mg, NiCl2.H2040mg, Na2MoO4.2H2035mg, CuCl2.H2020mg, CuSO4.5H2030mg,37%的浓盐酸0.9mL,蒸馏水1000mL。本发明的第三个技术方案是提供上述二甲四氯除草剂降解菌SE08在降解土壤或水中的二甲四氯的应用。本发明采用上述技术方案，具有以下优点:从湖南省郴州市烟区二甲四氯重污染土壤中经过初筛，然后再复筛及分离纯化得到的二甲四氯除草剂降解菌SE08，该降解菌可以有效地降解环境中的二甲四氯残留，适用于二甲四氯污染的土壤和水中的生物修复。
`图1为本发明的二甲四氯除草剂降解菌SE08的扫描电子显微镜图；图2为本发明的二甲四氯除草剂降解菌SE08的系统发育树；图3为本发明的二甲四氯除草剂降解菌SE08的基因全序列；图4为本发明的二甲四氯除草剂降解菌SE08生长曲线和二甲四氯降解动力学图；图5为本发明的二甲四氯除草剂降解菌SE08在不同初始二甲四氯浓度影响下的生长及二甲四氯降解图；图6为本发明的二甲四氯除草剂降解菌SE08在不同pH影响下的生长及二甲四氯降解图；图7为本发明的二甲四氯除草剂降解菌SE08在不同温度影响下的生长及二甲四氯降解图；图8为本发明的二甲四氯除草剂降解菌SE08在不同第二碳源葡萄糖添加量影响下的生长及二甲四氯降解图；图9为本发明的二甲四氯除草剂降解菌SE08在不同氮源添加量和5mg/L葡萄糖共培养条件下的生长及二甲四氯降解图。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于此。实施例1二甲四氯除草剂降解菌SE08的分离、纯化和鉴定
1、二甲四氯除草剂降解菌SE08的分离纯化取污染土样10.0g于三角瓶中，加入IOOmL含50mg/L 二甲四氯的无机盐培养液，在30°C，200rpm振荡培养5天；取出IOmL振荡液加入到90mL含125mg/L二甲四氯的无机盐培养液，在30°C，200rpm继续振荡培养5天，依次类推，提高二甲四氯浓度分别为250、500、750、1000mg/L，每隔5天，取出IOmL培养液加入到90mL含梯度升高浓度的二甲四氯无机盐培养液中，在30°C，200rpm继续振荡培养5天；取1000mg/L 二甲四氯无机盐培养液中的培养物在加入琼脂(20g/L)的无机盐培养基中进行稀释涂布，在30°C培养5天；挑取单菌落，然后在含250mg/L 二甲四氯和琼脂(20gL)的无机盐培养基上采用平板划线法进行分离纯化，获得纯化的以二甲四氯为唯一碳源和能量生长的菌株。将该菌株接入斜面培养，4°C斜面保存备用。2、二甲四氯除草剂降解菌SE08的形态结构观察及生理生化实验(I)形态鉴定该菌株为革兰氏阴性好氧菌，无芽孢无荚膜；在含NA固体培养基上37°C培养24h，其形态电镜扫描如图1所示，菌落的形状为椭圆，边缘整齐，表面光滑凸起，菌落为奶白色，不透明，体细胞呈短杆状，长2.0 2.5 μ m，宽0.6 0.8 μ m。(2)生理生化鉴定依据《伯杰氏细菌学鉴定手册》对二甲四氯降解菌SE08进行常规生理生化鉴定，鉴定结果为:该降解菌SE08能以二甲四氯为唯一碳源和能量生长，二甲四氯降解菌SE08接触酶试验为阳性，过氧化氢酶阴性，产吲哚试验阴性，甲基红试验反应阴性，柠檬酸利用试验为阴性，V-P试验为阳性，淀粉水解试验阴性，明胶液化试验为阳性，鸟氨酸脱羧酶为阳性，赖氨酸脱羧为阴性。(3) 二甲四氯降解 菌SE08的16S rRNA的PCR扩增和序列测定用试剂盒提取纯化后菌株的总RNA，采用细菌16S rRNA的通用引物进行16S rRNA的PCR扩增。测序及与GeneBank已知序列中进行同源性比较，其系统进化树见图2，基因全序列见图3。结果表明:该菌株16S rRNA序列全长1076bp，其核苷酸序列如SEQ IDN0.1 ;该菌株与Enterobactersp.菌株的相似性为99%，GeneBank登录号为N0.HM461219.1，结合其形态学，生理生化特征和16S rRNA比对结果,可以判定该菌株为肠杆菌属(Enterobactersp.)。实施例2降解菌生长和降解特性试验采用高效液相色谱(HPLC)分析测定无机盐培养液中二甲四氯的残留量，菌体生长量通过测定样品的OD6citol来确定。(I) 二甲四氯降解动力学和菌株SE08生长曲线:将3mL菌悬液(OD6tltlnm 0.3)加入到IOOmL含500mg/L 二甲四氯的无机盐培养液中，pH6.0，30°C条件下培养72h，结果见图4，培养36h，OD6tltlnm达最大为0.64，后期由于二甲四氯降解无法提供足够碳源和能量导致菌体死亡，OD6tltol有所下降，72h的OD6tltlnmS 0.64。随着菌体数量的增加，二甲四氯降解率逐渐增大，但培养60h后降解率变化不大但有略微增长，培养72h降解率达最大为68.5%,由此选择最佳培养时间为72h。
(2)不同初始二甲四氯浓度影响下的降解菌SE08生长及二甲四氯降解情况:将3mL 菌悬液(OD6tltlnm 0.3)加入到 IOOmL 含 125,250,500,750,1000,2000 和 3000mg/L 二甲四氯的无机盐培养液中，pH6.0，30°C条件下培养72h，结果见图5，在125、250、500mg/L二甲四氯的无机盐培养液中，菌体生长量和二甲四氯降解率随初始浓度的增加而增大，在500mg/L均达最大值，OD600nm和降解率分别为0.64和68.5%。当二甲四氯浓度大于750mg/L，降解率和菌体生长受到明显抑制，在3000mg/L时菌体基本不生长，二甲四氯降解率为0，但在2000mg/L时有少量菌体生长，这表明降解菌SE08表现出对二甲四氯较强的耐受能力。因此，选择500mg/L 二甲四氯为最佳初始浓度。(3)不同pH影响下的降解菌SE08生长及二甲四氯降解情况将3mL 菌悬液(OD6ticinm ^ 0.3)加入到 IOOmL 不同 pH 值 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的无机盐培养液(含二甲四氯500mg/L)中，30°C条件下培养72h，结果见图6，当pH为6、7、8条件下，菌体生长量和二甲四氯降解率都较大，当pH为6.0时，菌体生长和二甲四氯降解率同时达最大值，在PH为4、9、10的条件下，菌体生长量较小，因此菌株最适生长环境pH为6.0，其次为pH7和8。(4)不同温度影响下降解菌SE08生长及二甲四氯降解情况:将3mL菌悬液(OD600nm 一 0.3)加入到IOOmL含500mg/L 二甲四氯的无机盐培养液中，pH6.0，在不同温度20 V、25°C、30 V、35°C、40 V、45 V条件下培养 72h，结果见图 7，在 30°C、35°C、40°C条件下有较高的菌体生长量和降解率，在30°C时菌体生长量和二甲四氯降解率达最大，因此30°C为菌株最适培养温度，高温(45°C)或者低温(20°C、25°C)均会影响菌株的生长和降解能力。最终得到的二甲四氯降解菌株SE08最优生长条件是温度30°C、pH6.0、二甲四氯底物浓度500mg/L，在此条件下，不添加其他碳源和氮源，二甲四氯在无机盐培养液中培养72h小时可降解68.5%。(5)添加第二碳源葡萄糖和氮源酵母粉对降解菌SE08生长及二甲四氯降解的影响:从图8可以看出，添加第二到碳源葡萄糖能有效促进菌株的生长和加强二甲四氯降解，当葡萄糖添加量为5mg/L时，菌体生长量和降解率均达最大值，OD600nm和降解率分别为81.0%和0.95，当葡萄糖添加量为7.5mg/L时，菌体生长量和降解率与和添加葡萄糖5.0mg/L相当。当在无机盐培养液中添加第二碳源葡萄糖5g/L和不同酵母粉氮源添加量(1.0、
2.5,5.0,7.5mg/L)进行共培养时，如图9所示，酵母粉添加量1.0mg/L和2.5mg/L均能在一定程度上促进菌株生长和加强二甲四氯降解。在温度30°C、pH6.0、二甲四氯底物浓度500mg/L条件下,添加第二碳源葡萄糖5.0mg/L和氮源酵母粉2.5mg/L时,共培养72小时二甲四氯的降解率达最大值 83.8%，OD600nm为1.09。实验证明，降解菌SE08对高浓度二甲四氯有较好的耐受性，且有较高效的降解效率，这对于降低土壤和水中高浓度除草剂药害和毒性具有非常重要的意义。
权利要求
1.一种二甲四氯除草剂降解菌SE08,其特征在于,该降解菌为肠杆菌(Enterobactersp.)，保藏编号为CGMCC N0.7016，保藏日期:2012.12.18，保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的二甲四氯除草剂降解菌SE08，其特征在于，该菌株为革兰氏阴性好氧菌，无芽孢无荚膜；在NA固体培养基上37 V培养24h，菌落的形状为椭圆，边缘整齐，表面光滑凸起，菌落为奶白色，不透明，体细胞呈短杆状，长2.(Γ2.5μπι，宽0.6 0.8 μ m ;该菌株16S rRNA序列全长1076bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1。
3.根据权利要求2所述的二甲四氯除草剂降解菌SE08，其特征在于，所述NA固 体培养基配方如下:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1L，琼脂 20.0g，调节 ρΗ7.0-7.4，121°C灭菌 30min。
4.一种权利要求1所述的二甲四氯除草剂降解菌SE08的筛选方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤: (O取污染土样10.0g于三角瓶中，加入IOOmL含50mg/L 二甲四氯的无机盐培养液，25 37°C下，15(T220rpm振荡培养5天； (2)取出IOmL振荡液加入到90mL含125mg/L二甲四氯的无机盐培养液，在25 37°C，15(T220rpm继续振荡培养5天，依次类推，提高二甲四氯浓度分别为250、500、750、IOOOmg/L,每隔5天，取出IOmL培养液加入到90mL含梯度升高浓度的二甲四氯无机盐培养液中，25 37°C下，15(T220rpm继续振荡培养5天； (3)取1000mg/L二甲四氯无机盐培养液中的培养物，加入到含有浓度为20g/L琼脂的无机盐培养基中进行稀释涂布，30°`C下培养5天； (4)挑取单菌落，然后在含250mg/L二甲四氯和20g/L琼脂的无机盐培养基上采用平板划线法进行分离纯化，获得纯化的以二甲四氯为唯一碳源和能量生长的菌株。
5.根据权利要求4所述的二甲四氯除草剂降解菌SE08的筛选方法，其特征在于，所述无机盐培养液的配方如下=KH2PO40.5g，K2HPO40.5g，MgSO4.7Η200.2g，CaCl20.lg，NaCl0.2g和1.0mL微量元素溶液，蒸馏水lOOOmL，调节pH为7.0,121°C灭菌30min。
6.根据权利要求5所述的二甲四氯除草剂降解菌SE08的筛选方法，其特征在于，所述的微量元素溶液配方为:ZnCl270mg，MnCl2.4H20100mg, HSb0360mg, CoCl2.6H20200mg,NiCl2.H2040mg, Na2MoO4.2H2035mg, CuCl2.H2020mg, CuSO4.5H2030mg, 37 % 的浓盐酸 0.9mL,蒸懼水1000mL。
7.—种权利要求1所述的二甲四氯除草剂降解菌SE08在降解土壤或水中的二甲四氯的应用。
全文摘要
本发明属于环境污染生物修复领域，具体是一种二甲四氯除草剂降解菌SE08及其筛选方法和应用。二甲四氯除草剂降解菌SE08，为肠杆菌(Enterobacter sp.)，保藏编号为CGMCC No.7016，保藏日期2012.12.18，保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心。本发明还公开了上述二甲四氯除草剂降解菌SE08的筛选方法和应用。本发明从湖南省郴州市烟区二甲四氯重污染土壤中经过初筛，然后再复筛及分离纯化得到的二甲四氯除草剂降解菌SE08，该降解菌可以有效地降解环境中的二甲四氯残留，适用于二甲四氯污染的土壤和水中的生物修复。
文档编号C12N1/02GK103173377SQ20121055868
公开日2013年6月26日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者谭琳, 曾维爱, 郑雄志, 周志成, 李宏光, 胡秋龙, 谭济才, 江紫薇 申请人:湖南农业大学, 湖南省烟草公司郴州市公司