专利名称：转基因玉米ga21品系的lamp检测引物及方法
技术领域：
本发明提供了一种转基因玉米GA21品系的LAMP检测引物及方法。
背景技术：
随着全球转基因产品的日益增多，以及越来越多的转基因作物特异品系获得商品化生产，检测特异性品系已成为国际上转基因成分检测的发展趋势。目前，检测转基因特异品系的方法主要有普通PCR方法和实时荧光PCR方 法。普通PCR方法，具有耗时长，操作繁琐，灵敏度不够，容易产交叉污染，质控复杂，假阳性、假阴性比例偏高等缺点。实时荧光PCR方法则具有成本昂贵、技术要求高、需要大型的仪器设备等缺点，均已经不能满足食品中转基因成分的日常监管和食品生产行业内部质控的需求。因此，目前急需建立能够普遍适用于检验检疫一线的基层实验室的快速、简便、准确的转基因品系检测方法。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4飞条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件￠3 °C左右)保温30 — 60分钟，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物(焦磷酸镁)，形成乳白色沉淀，通过观察浊度，或加入显色液观察颜色变化来判定结果。LAMP技术具有简便、高效、特异、快速等优点，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，在灵敏度、特异性能媲美甚至优于普通PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。LAMP技术在食源性致病微生物的快速检测中已得到广泛应用，但在转基因产品检测上的应用研究很少。目前，国内采用LAMP技术对转基因成分的研究尚处于起步阶段，且主要应用于启动子、外源基因的检测，极少应用于转基因特异品系的检测。目前未见转基因玉米GA21品系的LAMP检测方法的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种普遍适用于基层实验室的快速、简便、准确、特异检测转基因玉米GA21品系的LAMP检测引物及方法。本发明首先提供了一种转基因玉米GA21品系的LAMP检测引物，所述LAMP检测引物如下
外引物 F3 :5，-GCT GTA GTT GTT GGC TGT-3’
外引物 B3 :5，-CCT TTT AAC TGA TGT TTT CAC TT-3，
内引物 FIP :5’-TGG GGG ATC CAC TAG TTC TAG AGG TGG AAA GTT CCC AGT TGA-3’内引物BIP 5' -GCA GGT CGA GGT CAT TCA TAT GGA CCA GGT AAT CTT ACC TTT G-3’环引物 LF :5’-CTG CAC TTC CTC TTT AGC ATC C-3’
环引物 LB :5’ -CTT GAG AAG AGA GTC GGG ATA GTC-3’。本发明还提供了一种转基因玉米GA21品系的LAMP检测方法，利用所述的LAMP检测引物，以fei DNA聚合酶大片段启动环介导等温扩增，通过观察浊度，或加入显色液观察颜色变化来判定检测结果。环介导等温扩增的反应条件为63°C温育lh，80°C保温5min ;反应体系为10XThermoPol 缓冲液 2. 5μ ，10 Mmol/L 外引物 F3 O. 5μ ，10 Mmol/L 外引物 Β3 O. 5μ ，40Mmol/L 环引物 LF 0. 5μ Α0 Mmol/L 环引物 LB O. 5μ Α0 Mmol/L 内引物 FIP I. 0μ ,40Mmol/L 内引物 BIP I. OM-L, 10 mmol/L dNTPs 3. 5M-L, 5 mol/L 甜菜喊 4. OM-L, 150 mmol/L硫酸镁 I. 0μ ,8 υ/μ Bst DNA 聚合酶大片段 I. Ομ , 100 ng/μ DNA 模板 2. Ομ , ddH20 7μ 。本发明建立的LAMP检测方法的优点①快速、高效扩增约I h即可完成，且产率高；②简便在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，通过观察浊度或加入显色液观察颜色变化就可判定检测结果，不需要特殊的、昂贵的仪器设备，操作非常简便；③高特异性采用六个区段、四条或六条引物，扩增特异性高，保证了结果的准确性。国内外还未见转基因玉米GA21品系的LAMP检测引物及方法的报道，本发明首次 设计、筛选到了转基因GA21品系的LAMP检测引物，并建立了 LAMP检测方法。
图I为GA21品系外源基因的序列，加框部分是mepsps基因，阴影部分是linker基因，加下划线部分是r-act基因。图2为GA21品系在植物基因与外源基因组合连接处的序列。图3为3套引物反应温度的测试结果，A. setl引物；B. set2引物；C. set3引物；Γ6.反应温度分别为60. 0°C、61. 2°C、61. 9°C >63. 3°C >64. 1°C、64. 8°C。图4为3套引物在反应温度为63°C的特异性测定结果，A. setl引物；B. set2引物；C. set3引物；I. ddH20 ；2.非转基因玉米；3.非转基因小麦；4.非转基因大豆；5.5% GA21标准品。图5为LAMP方法的特异性试验结果，Al 7分别为ddH20、非转基因大米、非转基因小麦、非转基因玉米、非转基因大豆、非转基因番茄、非转基因马铃薯；Bfe分别为 转基因玉米Mon89034品系、转基因玉米Tcl507品系、转基因玉米Mir604品系、转基因玉米Mon810品系、转基因玉米Btll品系、5%GA21标准品。图6为LAMP法灵敏度测定实时监控结果，I. 0. 1% GA21 ；2. 1% GA21 ；3. 5%GA21 ；4. 0. 5% GA21 ；5. 0. 05% GA21 ；6. 0. 01% GA21 ；7.非转基因玉米。图7为LAMP法灵敏度测定结果，I.非转基因玉米；2. 0. 01% GA21 ；3. 0. 05%GA21 ；4. 0. 1% GA21 ；5. 0. 5% GA21 ；6. 1% GA21 ；7. 5% GA21。图8为送检样品中GA21品系的LAMP检测结果，ΑΓ Ο分别为ddH20、非转基因玉米、真空玉米棒、冷冻甜玉米、奶香味韩味玉米(进口)、辣味韩味玉米、玉米淀粉、黄大豆、油豆腐、脱脂大豆10分别为香干、正康鸡蛋豆奶、正康草莓豆奶、大米、白稞干、米粉干、小麦、面粉、饼干、马铃薯淀粉；Cf 10分别为薯片、番茄酱、进口转基因玉米酒糟柏、进口转基因玉米I、进口转基因玉米2、进口转基因玉米3、进口转基因玉米4、进口转基因玉米5、0. 1% GA21、5% GA21。
具体实施方式
I试验材料
5%、1%、0. 1%GA21标准品购自北京世纪奥科生物技术有限公司。非转基因玉米、真空玉米棒、冷冻甜玉米、奶香味韩味玉米(进口)、辣味韩味玉米、玉米淀粉、黄大豆、油豆腐、脱脂大豆、香干、正康鸡蛋豆奶、正康草莓豆奶、大米、白稞干、米粉干、小麦、面粉、饼干、马铃薯淀粉、薯片、番茄酱、进口转基因玉米酒糟柏、进口转基因玉米I、进口转基因玉米2、进口转基因玉米3、进口转基因玉米4、进口转基因玉米5由本实验室收集。采用CTAB法提取试验材料的DNA，_20°C保存备用。2主要试剂、耗材
dNTPs溶液(每种核苷酸浓度10 mmol/L)购自厦门泰京公司'Bst DNA聚合酶大片段(8 U/μυ及lOXThermolPol缓冲液为美国NEB公司产品；甜菜碱(5mol/L)、硫酸镁溶液(lmol/L)为Sigma公司产品；SYBR Green I荧光染料(10000X )为厦门百维信生物科技有 限公司产品；LAMP专用薄壁管、稳定液购自广州华峰生物科技有限公司。3主要仪器与设备
冷冻混合研磨仪、涡旋仪、水浴锅、台式离心机、生物安全柜、梯度PCR仪、实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司的7500)。4 LAMP引物的设计
根据GA21品系特异性序列(图1)，设计了 2套引物。根据GA21品系在植物基因与外源基因组合连接处(图2)设计了 I套引物。所有引物(表I)由广州迪澳生物科技有限公司设计，委托上海生工公司合成。用ddH20将外引物稀释至lOMmol/L，环引物、内引物稀释至40Mfflol/L。按外引物环引物内引物体积比为I :1 2的比例混匀内、外、环引物(配制第3套引物混合液时，用ddH20代替另一条环引物)，作为引物混合液，分别标记为Setl、Set2和set30
表I LAMP引物
权利要求
1.一种转基因玉米GA21品系的LAMP检测引物，其特征在于所述LAMP检测引物如下外引物 F3 :5，-GCT GTA GTT GTT GGC TGT-3’外引物 B3 :5，-CCT TTT AAC TGA TGT TTT CAC TT-3，内引物 FIP :5’-TGG GGG ATC CAC TAG TTC TAG AGG TGG AAA GTT CCC AGT TGA-3’内引物BIP :5，-GCA GGT CGA GGT CAT TCA TAT GGA CCA GGT AAT CTT ACC TTT G-3’环引物 LF :5’-CTG CAC TTC CTC TTT AGC ATC C-3’ 环引物 LB :5’ -CTT GAG AAG AGA GTC GGG ATA GTC-3’。
2.—种转基因玉米GA21品系的LAMP检测方法，其特征在于利用权利要求I所述的 LAMP检测引物，以ifei DNA聚合酶大片段启动环介导等温扩增，通过观察浊度，或加入显色液观察颜色变化来判定检测结果。
3.根据权利要求2所述的转基因玉米GA21品系的LAMP检测方法，其特征在于环介导等温扩增的反应条件为63°C温育lh，80°C保温5min ;反应体系为10 X ThermoPol缓冲液 2. 5μ ，10 Mmol/L 外引物 F3 O. 5μ ，10 Mmol/L 外引物 Β3 O. 5μ Α0 Mmol/L 环引物 LF.0.5μ Α0 Mmol/L 环引物 LB O. 5μ Α0 Mmol/L 内引物 FIP I. 0μ ,40 Mmol/L 内引物 BIP.1.Ομ , 10 mmol/L dNTPs 3. 5μ ,5 mol/L 甜菜碱 4· Ομ ，100 mmol/L 硫酸镁 L Ομ ，8 υ/μ Bst DNA 聚合酶大片段 I. Ομ , 100 ng/μ DNA 模板 2· Ομ , ddH20 7μ 。
全文摘要
本发明提供了一种转基因玉米GA21品系的LAMP检测引物及方法。所述LAMP检测引物如SEQ ID NO1-6，利用所述的LAMP检测引物，以BstDNA聚合酶大片段启动环介导等温扩增，通过观察浊度，或加入显色液观察颜色变化来判定检测结果。本发明提供的一种普遍适用于基层实验室的快速、简便、准确、特异检测转基因玉米GA21品系的LAMP检测引物及方法，快速、高效、简便，扩增特异性高，保证了结果的准确性。
文档编号C12N15/11GK102965445SQ20121053089
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者邵碧英, 陈文炳, 曾莹, 缪婷玉, 彭娟 申请人:福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心