专利名称：一种深海细菌多糖的低成本制备方法
技术领域：
本发明涉及一种深海细菌多糖的低成本制备方法，特别是一种用乳酪加工副产品乳清液和豆柏制备深海细菌多糖的方法，属于生物技术技术领域。
背景技术：
细菌胞外多糖包括荚膜多糖和粘液多醣，具有安全无毒、理化性质独特、用途广泛、易与菌体分离及可通过深层发酵实现工业化生产等优良性质而倍受关注。与植物多糖相比，它们种类繁多，生产周期短，不受季节、地域和病虫害条件的限制。细菌多糖的这些生产环节上的优势和产品优越的物化特性为其带来了巨大的市场价值，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。目前，世界上微生物多糖产量的年增长率在10%以上，一些新型多糖产量的年增长率在30%以上，其中细菌胞外多糖占有很大的份额。已经投产的细菌胞外多 糖主要有黄原胶(xanthan gum)、结冷胶(gellan gum)和热凝多糖(curdlan)等,这类多糖作为胶凝剂、增稠剂、润滑剂、絮凝剂、悬浮剂、成膜剂、保鲜剂和乳化剂等广泛应用于食品、制药、石油和化工等多个领域。地球上80%的生物存在于海洋，因此海洋生物资源总量巨大。目前的研究表明，海洋微生物因其独特的生活环境，分泌的胞外多糖具有特殊结构，预示着可能具有潜在用途。对于海洋微生物分泌的胞外多糖国内外已经有一些研究，但总体开发利用程度仍然很低。细菌Zunongwangia profunda SM-A87是从南冲绳海槽1245m深的海底沉积物中分离得到。我们的研究表明，该菌株能够以乳糖为碳源分泌大量的胞外多糖。对SM-A87分泌的胞外多糖的结构和性质的研究表明，该多糖具有新颖的结构和独特的性质，该多糖能够在高盐和高温下保持稳定，具有很好的流变学性质，在化妆品、污水处理和石油开采等方面都具有很好的应用潜力。但是利用乳糖和蛋白胨进行该多糖发酵成本较高，这严重影响了该多糖的开发应用。因此，发明Zunongwangia profunda SM-A87胞外多糖的低成本发酵技术将为该多糖的应用开发奠定基础。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种深海细菌多糖的低成本制备方法。本发明技术方案如下一种深海细菌多糖的低成本制备方法，步骤如下(I)将深海细菌(Zunongwangia profunda) SM-A87菌株接种于液体种子培养基，在15 20°C条件下振荡培养2 3天，获得种子培养液；所述液体种子培养基组分如下，均为重量份蛋白胨O. 8 1. O份，酵母粉O. 5 O. 75份，人工海水100份，pH为7. 5 8. O ;(2)按3 5%的体积百分比将步骤(I)制得的种子培养液接种于发酵培养基，在15 20°C、溶解氧饱和度高于30%的条件下，培养20 30h，然后调整发酵温度为8 12°C，继续培养8 10天，在继续培养期间补加乳清浓缩液，制得发酵液；
所述发酵培养基组分如下，乳清为体积份，单位以毫升计，其余均为重量份，单位以克计乳清60. 9份，豆柏1. O份，NaCl 2. 9份，人工海水100份，pH为8. O。(3)向步骤(2)制得发酵液中加入1. 5 3倍体积的无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤、烘干，制得粗多糖；(4)将步骤(3)制得的粗多糖溶于水中，配成重量体积百分比为O. 5 1%的溶液，单位g/L ;加入碱性蛋白酶使溶液中碱性蛋白酶的浓度为5 10U/mL的碱性蛋白酶，在45 50°C、180 200rpm的条件下,酶解5 6h ;再加入1. 5 3倍体积的无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤、烘干，制得深海细菌胞外多糖。
根据本发明优选的,所述步骤(I)中的深海细菌(Zunongwangia profunda)SM_A87菌株是在温度为15 20°C条件下，于固体培养基活化培养2 3天后制得的。根据本发明进一步优选的，上述固体培养基组分如下，均为重量份蛋白胨O. 8 1. O份，酵母粉O. 5 O. 75份、琼脂1. O 1. 5份，人工海水100份，pH 为 7. 5 8. O ;根据本发明优选的，所述步骤(2)中补加的乳清浓缩液，由配制发酵培养基的乳清通过浓缩5倍后获得，每次补加的乳清浓缩液的量为发酵培养基体积的10%。根据本发明优选的，所述步骤(2)中补加乳清浓缩液的次数为两次，补加乳清浓缩液的时间为继续培养的第4天和第6天。根据本发明优选的，所述步骤(3)和步骤(4)中的醇沉，温度为3 6°C，时间为20 40min。根据本发明优选的，所述步骤(3)和步骤(4)中的烘干，温度为55 60°C，时间为24 30h。上述深海细菌(Zunongwangia profunda) SM-A87购自中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，菌种保藏号CCTCC NO :AB206139T。有益效果1、本发明用乳酪加工副产品乳清液代替乳糖，用豆柏代替蛋白胨，进行细菌菌株SM-A87胞外多糖发酵，发酵成本降低70%以上。2、本发明采用分批补料发酵，使菌株SM-A87胞外多糖的产量达到17. 2g/L，与乳糖发酵罐补料相比胞外多糖的产量提高了 50. 9%。3、乳清液是乳酪加工副产品，一些乳制品加工厂直接作为废水排放，会造成严重的环境污染，本发明用乳清液进行细菌SM-A87胞外多糖发酵，可以大量利用乳清液，不仅降低发酵成本，而且具有很好的环境效益和社会效益。
图1、乳清浓度与深海细菌胞外多糖产量和发酵液粘度的关系图；图2、豆柏浓度与深海细菌胞外多糖产量和发酵液粘度的关系图；图3、NaCl浓度与深海细菌胞外多糖产量和发酵液粘度的关系图；图4、发酵时间与发酵液粘度、深海细菌胞外多糖产量和菌体浓度关系的曲线图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。实施例中所述深海细菌(Zunongwangia profunda)SM_A87购自中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉市武昌珞珈山武汉大学，菌种保藏号CCTCC N0:AB206139To
碱性蛋白酶购自丹麦诺维信公司；配制人工海水的海盐购自美国Sigma公司；乳清购自山东省农科院畜牧兽医研究所山东兴牛乳业公司；培养基其他配制原料均为本领域常用原料，可市场购得。实施例1:一种深海细菌多糖的制备方法，步骤如下(I)将深海细菌(Zunongwangia profunda) SM-A87菌株接种于液体种子培养基，在20°C条件下振荡培养3天，获得种子培养液；所述液体种子培养基组分如下，均为重量份蛋白胨O. 8份，酵母粉O. 75份，人工海水100份，pH为8.0 ;(2)按5%的体积百分比将步骤(I)制得的种子培养液接种于发酵培养基，在20°C、溶解氧饱和度高于30%的条件下，培养20h，然后调整发酵温度为12°C，继续培养8天，在继续培养期间补加乳清浓缩液，制得发酵液；所述发酵培养基组分如下，乳清为体积份，单位以毫升计，其余均为重量份，单位以克计乳清60. 9份，豆柏1. O份，NaCl 2. 9份，人工海水100份，pH为8. O。(3)向步骤(2)制得发酵液中加入3倍体积的无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤、烘干，制得粗多糖；(4)将步骤(3)制得的粗多糖溶于水中，配成重量体积百分比为1%的溶液，单位g/L ;加入碱性蛋白酶使溶液中碱性蛋白酶的浓度为5U/mL的碱性蛋白酶，在50°C、180rpm的条件下，酶解5h ;再加入3倍体积的无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤、烘干，制得深海细菌胞外多糖。所述步骤(I)中的深海细菌(Zunongwangia profunda) SM-A87菌株是在温度为20°C条件下，于固体培养基活化培养2天后制得的。根据本发明进一步优选的，上述固体培养基组分如下，均为重量份蛋白胨0. 8份，酵母粉0. 75份、琼脂1. O份，人工海水100份，pH为8. O ;所述步骤(2)中补加的乳清浓缩液，由配制发酵培养基的乳清通过浓缩5倍后获得，每次补加的乳清浓缩液的量为发酵培养基体积的10%。所述步骤(2)中补加乳清浓缩液的次数为两次，补加乳清浓缩液的时间为继续培养的第4天和第6天。所述步骤(3)和步骤(4)中的醇沉，温度为3°C，时间为40min。所述步骤(3)和步骤(4)中的烘干，温度为60°C，时间为24h。经检测，深海细菌胞外多糖产率为76. 1%。实施例2
一种深海细菌多糖的制备方法，步骤如下(I)将深海细菌(Zunongwangia profunda) SM-A87菌株接种于液体种子培养基，在15°C条件下振荡培养3天，获得种子培养液；所述液体种子培养基组分如下，均为重量份蛋白胨1. O份，酵母粉O. 5份，人工海水100份，pH为7. 5 ;(2)按3%的体积百分比将步骤(I)制得的种子培养液接种于发酵培养基，在15°C、溶解氧饱和度高于30%的条件下，培养30h，然后调整发酵温度为8°C，继续培养10天，在继续培养期间补加乳清浓缩液，制得发酵液；所述发酵培养基组分如下，乳清为体积份，单位以毫升计，其余均为重量份，单位以克计 乳清60. 9份，豆柏1. O份，NaCl 2. 9份，人工海水100份，pH为8. O。(3)向步骤(2)制得发酵液中加入1. 5倍体积的无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤、烘干，制得粗多糖；(4)将步骤(3)制得的粗多糖溶于水中，配成重量体积百分比为O. 5%的溶液，单位g/L ;加入碱性蛋白酶使溶液中碱性蛋白酶的浓度为10U/mL的碱性蛋白酶，在45°C、200rpm的条件下，酶解6h ;再加入1. 5倍体积的无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤、烘干，制得深海细菌胞外多糖。所述步骤(I)中的深海细菌(Zunongwangia profunda) SM-A87菌株是在温度为15°C条件下，于固体培养基活化培养3天后制得的。上述固体培养基组分如下，均为重量份蛋白胨1. O份，酵母粉0. 5份、琼脂1. O份，人工海水100份，pH为7. 5 ;根据本发明优选的，所述步骤(2)中补加的乳清浓缩液，由配制发酵培养基的乳清通过浓缩5倍后获得，每次补加的乳清浓缩液的量为发酵培养基体积的10%。根据本发明优选的，所述步骤(2)中补加乳清浓缩液的次数为两次，补加乳清浓缩液的时间为继续培养的第4天和第6天。根据本发明优选的，所述步骤(3)和步骤(4)中的醇沉，温度为6°C，时间为20min。根据本发明优选的，所述步骤(3)和步骤(4)中的烘干，温度为55°C，时间为30h。经检测，深海细菌胞外多糖产率为76. 1%。试验例I乳清和乳糖发酵深海细菌SM-A87对生产胞外多糖的影响实验，步骤如下(l)500mL三角瓶分别加入52. 2mL，56. OmL, 60. 9mL和65. 2mL乳清，用去离子水稀释至IOOmL,加入O. 762g的蛋白胨，0. 75g酵母粉，3g海盐，ρΗ8· 0，115°C灭菌30min,以乳糖
蛋白胨培养基作为对照。上述乳糖蛋白胨培养基组分如下，均为重量份蛋白胨0.887份，酵母粉0.5份，乳糖3. 221份，人工海水100份，pH为8. O ;(2)将深海细菌(Zunongwangia profunda)SM_A87菌株划线接种于固体培养基,在20°C条件下活化培养3天，然后接种于IOOmL液体种子培养基中，在20°C、200rpm的条件下振荡培养2天，然后按5% (v/v)的接种量接种于步骤(I)制得的培养基中，10°C培养8天。上述固体培养基组分如下，均为重量份
蛋白胨I份，酵母粉O. 5份、1. 5份琼脂，人工海水100份，pH为7. 5 8. O ;根据本发明优选的，所述步骤(I)中的液体种子培养基组分如下，均为重量份蛋白胨I份，酵母粉O. 5份，人工海水100份，pH为7. 5 8. O ;结果如图1所示，在乳清含量为60. 9%时，深海细菌SM-A87菌株胞外多糖产量最高，胞外多糖的最终产量达到7. 5±0. lg/L，粘度达到6359±161mPa · s，与对照组很接近，这说明可以用乳清代替乳糖用于深海细菌SM-A87胞外多糖的发酵。目前，乳糖市场价在6000元/吨以上，而乳清作为奶酪制作的废料大多直接排放，不仅十分浪费而且由于 其中含有大量的糖分等高营养物质，极易造成环境的富营养污染，用乳清代替乳糖可以大大节省深海细菌胞外多糖的生产成本，利于其大规模工业生产。试验例2 豆柏、蛋白胨和酵母粉发酵深海细菌SM-A87对生产胞外多糖的影响实验，步骤如下(I) 500mL三角瓶中加入60. 9mL乳清，用去离子水稀释至IOOmL,分别加入O. 5、
O.6,0. 7,0. 8g的豆柏，3g海盐，ρΗ8· 0,115°C灭菌30min,以乳糖蛋白胨培养基作为对照。上述乳糖蛋白胨培养基组分同试验例I。(2)深海细菌SM-A87菌株活化、接种和发酵方法同实施例1。结果如图2所示，用豆柏代替蛋白胨和酵母粉发酵深海细菌SM-A87，胞外多糖的产量和发酵液粘度高于对照组，其中胞外多糖产量在豆柏浓度为10g/L时最高，达到
11.0±0. 4g/L，发酵液粘度达到11589±519mPa · S。以上结果说明了用豆柏代替原来培养基中的蛋白胨和酵母粉是完全可行的，这不仅显著降低了深海细菌SM-A87胞外多糖的生产成本，而且还进一步提高了胞外多糖的产量。试验例3 用NaCl代替海盐发酵深海细菌SM-A87对生产胞外多糖的影响实验，步骤如下(l) 500mL三角瓶中加入60.9mL乳清和1. Og豆柏，用去离子水稀释至IOOmL，分别加入2. 8,2. 9,3. 0,3. 1,3. 2g NaCl,ρΗ8· 0,115°C灭菌30min，以乳糖蛋白胨培养基作为对照。上述乳糖蛋白胨培养基组分同实验例I。(2)深海细菌SM-A87菌株活化、接种和发酵方法同实施例1。结果如图3所示，在NaCl浓度为2. 9%时，胞外多糖产量最高，达到9. 0±0. lg/L,此时发酵液粘度达到6807±553mPa *s，均高于对照组。由此说明，可用价格较低的NaCl代替海盐对深海细菌SM-A87进行发酵，从而进一步降低生产成本。试验例4 发酵罐分批补料发酵深海细菌SM-A87对生产胞外多糖的影响实验，步骤如下(I)将平板活化后的深海细菌SM-A87菌株接种于IOOmL液体种子培养基中，在20°C、200rpm的条件下震荡培养2天，然后按5% (v/v)的接种量接种于5L发酵培养基中，在20°C、溶解氧饱和度80 100%的条件下，培养24h，然后调整发酵温度为10°C，继续培养9天，并在培养的第4天和第6天分别补加由乳清液浓缩5倍得到的乳清浓缩液500mL，制得发酵液，发酵过程中发酵时间与发酵液粘度、深海细菌胞外多糖产量和菌体浓度关系如图4所示；
上述液体种子培养基组分同实施例1 ;根据本发明优选的，上述发酵培养基组分如下，乳清为体积份，其余均为重量份乳清60. 9份，豆柏1. O份，NaCl 2. 9份，人工海水100份，pH为8. O。(2)向步骤(I)制得发酵液中加入2倍体积的无水乙醇，在4°C条件下醇沉30min，IOOOOrpm离心IOmin,取沉淀,无水乙醇洗漆、6(TC烘干24h,制得粗多糖；(3)将步骤(3)制得的粗多糖溶于水中，配成重量体积百分比为1%的溶液，单位为g/L ;加入碱性蛋白酶使溶液中碱性蛋白酶的浓度为5U/mL的碱性蛋白酶，在50°C、200rpm 的条件下，酶解5h ;再加入2倍体积的无水乙醇，在4°C条件下醇沉30min，IOOOOrpm离心IOmin,取沉淀，无水乙醇洗涤、60 V烘干24h，制得深海细菌胞外多糖。
权利要求
1.一种深海细菌多糖的低成本制备方法，其特征在于，步骤如下 (1)将深海细菌SM-A87菌株接种于液体种子培养基，在15 20°C条件下振荡培养2 3天，获得种子培养液； 所述液体种子培养基组分如下，均为重量份 蛋白胨0.8 1.0份，酵母粉0.5 0. 75份，人工海水100份，pH为7. 5 8.0 ; (2)按3 5%的体积百分比将步骤(I)制得的种子培养液接种于发酵培养基，在15 20°C、溶解氧饱和度高于30%的条件下，培养20 30h，然后调整发酵温度为8 12°C，继续培养8 10天,在继续培养期间补加乳清浓缩液,制得发酵液； 所述发酵培养基组分如下，乳清为体积份，单位以毫升计，其余均为重量份，单位以克计 乳清60. 9份，豆柏1. 0份，NaC12. 9份，人工海水100份，pH为8. O。
(3)向步骤(2)制得发酵液中加入1.5 3倍体积的无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤、烘干，制得粗多糖； (4)将步骤(3)制得的粗多糖溶于水中，配成重量体积百分比为0.5 1%的溶液，单位g/L ;加入碱性蛋白酶使溶液中碱性蛋白酶的浓度为5 10U/mL的碱性蛋白酶，在45 50°C、180 200rpm的条件下,酶解5 6h ;再加入1. 5 3倍体积的无水乙醇醇沉,分离取沉淀，无水乙醇洗涤、烘干，制得深海细菌胞外多糖。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的深海细菌SM-A87菌株是在温度为15 20°C条件下，于固体培养基活化培养2 3天后制得的。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述固体培养基组分如下，均为重量份 蛋白胨0. 8 1. 0份，酵母粉0. 5 0. 75份、琼脂1. 0 1. 5份，人工海水100份，pH为 7. 5 8. O。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中补加的乳清浓缩液，由配制发酵培养基的乳清通过浓缩5倍后获得，每次补加的乳清浓缩液的量为发酵培养基体积的10%。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中补加乳清浓缩液的次数为两次，补加乳清浓缩液的时间为继续培养的第4天和第6天。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(4)中的醇沉，温度为3 6°C，时间为20 40min。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(4)中的烘干，温度为55 60°C，时间为24 30h。
全文摘要
本发明涉及一种深海细菌多糖的低成本制备方法，步骤如下(1)将深海细菌SM-A87菌株接种于液体种子培养基，振荡培养，获得种子培养液；(2)将种子培养液接种于发酵培养基，培养，然后调整发酵温度继续培养并补加乳清浓缩液，制得发酵液；(3)向发酵液中加入无水乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤、烘干，制得粗多糖；(4)将粗多糖溶于水中，加入碱性蛋白酶，酶解，乙醇醇沉，分离取沉淀，无水乙醇洗涤、烘干，制得深海细菌胞外多糖。本发明用乳酪加工副产品乳清液代替乳糖，用豆粕代替蛋白胨，进行细菌菌株SM-A87胞外多糖发酵，发酵成本降低70%以上。
文档编号C12P19/04GK102994587SQ201210519759
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者张玉忠, 刘升波, 陈秀兰, 秦启龙, 苏海楠, 宋晓妍, 周百成 申请人:山东大学