专利名称：一种构建混合菌体系发酵稻草秸秆生产乙醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种构建混合菌体系发酵稻草秸杆生产乙醇的方法。
背景技术：
当今，世界各国的经济社会发展对石油资源的依存度较高，而石油具有不可再生性，长期必将影响到社会的可持续发展。中国是石油消费大国，但国内石油资源却相对贫乏。开发利用新能源和可再生能源已成为世界共识，并成为我国调整、优化能源结构的国家战略。乙醇汽油因具有燃烧充分、污染产物少、可起到一定的防爆作用等优点而受到推崇，燃料乙醇工业面临新机遇。基于我国人多地少的国情，粮食作物显然不再适于作为开发燃料乙醇的原料来源，但作为农业大国，我国农作物秸杆(生物质)年产量居世界之首，约为
7.4亿吨/年，其中可作为燃料乙醇生产原料的秸杆约占农作物秸杆总量的20%，达1. 4亿吨，能为我国生产燃料乙醇提供稳定的原料来源。利用生物质为原料生产燃料乙醇，既是缓解能源危机的现实需要，可以有效解决当前能源紧缺问题，也是保护生态环境的必然选择，必将大大减少废弃物对环境的污染，还可以缓解传统方法利用淀粉转化乙醇所造成的粮食危机，对我国经济社会的可持续发展具有重大的现实意义和深远的历史意义。稻草秸杆的主要成分是木质素(含量约为20% 25%)、半纤维素(含量约为25% 30%)和纤维素(含量约为30% 35%)。稻草秸杆酶解糖化前需要去除木质素的空间阻碍作用，传统预处理方法中，物理方法耗能大、效果差，化学方法易造成二次污染。微生物酶处理法具有无污染、成本低等优势，微生物降解木质素依赖于木素过氧化物酶和漆酶的共同作用。研究发现产木质素降解酶能力强的微生物较少，不同菌株的木质纤维素降解酶系有差异，混菌发酵可以弥补菌种之间的差异，充分发挥各酶之间的协同作用。研究表明一种绿色木霉n'riofe)产漆酶能力非常强,所产漆酶能使添加了 O. 04%愈创木酚的PDA培养基中的愈创木酚发生聚合，产生红褐色化合物，形成红褐色氧化带，因此氧化带的大小可以标明产漆酶能力的大小。绿色木霉培养2 d即可在愈创木酚-PDA培养基中形成直径达3. O 4. O cm的红褐色氧化带。相比之下，常用于秸杆预处理的平菇培养7 d才在愈创木酹-PDA培养基中形成直径达3. O cm的红褐色氧化带。研究发现里氏木霉(Jrichoderma reesei)产木素过氧化物酶能力非常强,所产木素过氧化物酶能使添加了
O.01%苯胺蓝的PDA培养基发生褪色反应，形成透明圈，因此透明圈的大小可以标明产木素过氧化物酶能力的大小。里氏木霉培养2 d可在苯胺蓝-PDA培养基上形成直径达4. O cm的透明圈，3 d即可使整个平板完全褪色。相比之下，常用于秸杆预处理的平菇培养4 d才在苯胺蓝-PDA培养基上形成直径达2. O 3. O cm的透明圈。里氏木霉和绿色木霉具有互补的木质素降解酶系，二者混合培养可以达到较好的稻草秸杆预处理效果，而且二者的纤维素酶、半纤维素酶活也较强。天然半纤维素水解产物的85% 90%是木糖。以植物纤维素原料中的木糖发酵生产乙醇，能实现原料的充分利用，提高秸杆转化乙醇的效率，降低生产成本。传统的乙醇生产菌株酿酒酵母iSaecharomyces cerevisiae)不能发酵木糖,但是一些酵母可以发酵木糖产乙醇，如热带假丝酵母iropica/is)、管囊酵母{Pachysoleri tannophilus) >树干毕赤酵母(Pichia、休哈塔假丝酵母{Candida shehatae)和耐热甲基营养
酵母Qhnsenula poIymorpha)等。稻草稻杆酶解糖化液中主要含葡萄糖和木糖,酿酒酵母和能发酵木糖产乙醇的酵母混合发酵稻草糖化液能够有效提高稻草秸杆的乙醇转化率。乙醇发酵强度直接影响着秸杆转化乙醇的效率，而乙醇发酵强度主要决定于酵母菌的种类和细胞浓度。传统的游离型酵母菌在发酵产乙醇过程中，存在起初酵母菌细胞浓度偏低、细胞增殖时期较长和产物收集阶段酵母菌流失等问题。20世纪60年代发展起来的固定化细胞技术具有可连续与重复使用、可实现细胞高密度培养、产物分离简单等特点。固定化方法包括包埋法、化学结合法、物理吸附法，其中包埋法是应用很广的一种固定化方法，其所形成的固定化微环境非常适合酵母菌的厌氧发酵，而且具有乙醇得率高、乙酸耐受性强、耐高糖浓度和抗污染能力强等优势。海藻酸钙作为应用最为广泛的一种固定化载体，是由氯化钙溶液钙化水溶性海藻酸钠(SA)后形成的不溶性固定化凝胶，其制备方法简单、价格低廉，但培养基中的磷酸盐会逐渐使海藻酸钙凝胶破裂和解体而出现使用寿命短的问题，而且作为一个交联紧密的大分子，海藻酸钙与水分子的结合不是很理想，含水率不是很高(70. 1%)0近年来，聚乙烯醇(PVA)因其独特结构(分子链上含有大量的羟基)所赋予的强力黏结性、皮膜柔韧性、平滑性、耐磨性等而广泛地被用做固定化包埋剂，但与此同时强大的附聚倾向使得颗粒之间相互黏结，含水率较低(40. 5%)0王孝华等研究发现亲水性聚合物SA和PVA复合交联后形成网状结构，其中的网孔使水分子易进入聚合物中，含水率大幅度提高(80. 6% )，而且复合材料的扯断伸长率从原来的80%和280%提高到400%，弹性和韧性大幅度提高。此外，SiO2作为一种无机物可与有机的SA和PVA以化学键结合，林松柏等的研究表明SA - SiO2化学键构建了有序的固定化酶包埋环境；不仅如此，SiO2作为原子型晶体，强度较高，添加至凝胶颗粒中可增加强度，宋向阳等的实验证明海藻酸钠溶液中添加SiO2后耐磷酸缓冲液 的效果较好。本发明所涉及的SA-PVA-SiO2共固定化技术综合以上研究的优点，为发酵葡萄糖产乙醇的酿酒酵母iSaccharomyces cererisiae)和发酵木糖产乙醇的热带假丝酵母构建了良好的生长及发酵微环境,使得稻草秸杆酶解糖化液中的葡萄糖和木糖都能得到有效转化，提高了稻草秸杆的乙醇转化率。经共固定化可实现该混菌体系多次重复用于发酵稻草秸杆糖化液产生乙醇。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种构建混合菌体系发酵稻草秸杆生产乙醇的方法，具有乙醇发酵转化率高、低能耗和无污染的优点。本发明是这样来实现的，其工艺步骤包括
①菌株选择里氏木霉(Trichodermareesei )、绿色木霉(Trichoderma viride )、酿酒酵母cereFisiae)、热带假丝酵母tropicalis )；
②混菌体系I的构建将里氏木霉与绿色木霉以2 I的比例按6%接种量接入稻草发酵培养基中，34°C，120 rpm摇床培养4 d，使得纤维素酶达到最大酶活，与此同时微生物所产木质素降解酶可实现对秸杆的初步预处理，而且这种预处理伴随后续原位酶解的全过程。稻草发酵培养基的配方为稻草粉6 g，麸皮3 g，豆饼粉3 g，玉米粉2 g，KH2PO4 O. 5g, CaCl2 O. 3 g，水 100 mL。
③原位酶解糖化混合发酵4 d后，提高混菌发酵温度至50°C，菌体失活，停止对葡萄糖的消耗，木质素降解酶系始终伴随纤维素酶解过程发挥预处理作用，为纤维素的酶解扫清障碍，里氏木霉和绿色木霉所产木质纤维素酶在原位实现高效酶解糖化，持续72 h后得到稻草秸杆酶解糖化产物；
④稻草糖化液的制备4层纱布过滤酶解糖化产物，4000rpm离心25min，取上清液121°C灭菌30 min作为后续批次发酵稻草糖化液。所得稻草糖化液中还原糖浓度为22. 74g/L，其中己糖含量约占81. 71%，戊糖含量约占18. 29% ；
⑤混菌体系II的构建取浓度为O.1 g/mL的酿酒酵母菌悬液(细胞个数达到4. 84 X IO8个/mL)0. 5 mL和浓度为O.1 g/mL热带假丝酵母菌悬液(细胞个数达到3. 43 X IO8个/mL)
O.5 mL与20 mL的包埋剂(2% SA,6% PVAU % SiO2溶液)混合均匀后，转入20 mL注射器中，滴入100 mL3% CaCl2、5% H3BO3溶液中，得到直径为3 5 mm的固化小球，4°C条件下过夜处理；
⑥共固定化混合酵母菌颗粒批次发酵稻草糖化液产乙醇取上述共固定化小球20mL,接种入30 mL稻草糖化液中，28 °C,90 rpm摇床培养4 h后，将发酵醪液倾倒出来，重新换上新鲜稻草糖化液进行下一个批次的发酵。发酵醪液的乙醇含量为4. 97 5. 05 g/L,乙醇生产速率可达2. 170 g/(L · h)；
本发明的技术效果是本发明具有能耗低，对设备要求低，不带来酸碱的污染问题，原料预处理成本低，纤维素酶成本低，构建的混菌体系II经共固定化技术处理后能反复使用，从而具有高效利用稻草糖化液中的还原糖，乙醇发酵强度高等优势；本发明还具有如下优点①本发明在木质纤维素的生物预处理方面取得了显著成效。本发明中所构建的混菌体系I里氏木霉和绿色木霉不仅具有互补的木质素降解酶活，而且纤维素、半纤维素酶活较强。因此该混菌体系降解纤维素、半纤维素所得还原糖可有助于菌株的生长，菌株生长过程中所分泌的漆酶、木素过氧化物酶又可以对稻草秸杆实现初步的生物预处理，而且该生物预处理始终伴随酶解糖化的整个过程，使得在原位酶解糖化过程中能够凸显该二元体系预处理成本低而且环保等优越 性。②本发明实现了纤维素酶的低成本开发利用。里氏木霉和绿色木霉混合培养，达到产纤维素酶高峰时，通过提高温度使得微生物失活，终止其对还原糖的消耗，细胞内的纤维素酶充分地释放出来，同时达到纤维素酶的最适糖化温度，微生物所产纤维素酶在原位实现高效酶解糖化，较一般研究使用提取纯化的微生物酶而言，省去了纤维素酶提取纯化的高额费用，实现了低成本化。③本发明所构建的利用葡萄糖产乙醇和利用木糖产乙醇的混菌体系II实现了稻草糖化液的高效乙醇转化，使得稻草糖化液中的各类还原糖可以得到充分的产醇利用，而且共固定化混合酵母菌可实现酵母的高密度培养和循环使用，缩短发酵周期。
图1为本发明实施例中降解前稻草样品结构的扫描电镜图。图2为本发明实施例中经混菌发酵后的稻草样品结构的扫描电镜图。图3为本发明实施例中发酵前共固定化小球切面的扫描电镜图。图4为本发明实施例中批次发酵后共固定化小球切面的扫描电镜图。图5为本发明工艺流程示意图。
具体实施例方式下面通过实施例并结合附图对本发明做详细阐述
实施例按照工艺流程如图5，1.构建混菌体系I酶解糖化稻草秸杆
(O菌体细胞的制备从菌种保藏斜面分别挑取一接种环里氏木霉ACCC32412(.Trichoderma reesei ACCC32412)和绿色木霉 ACCC31931 (.Trichoderma virideACCC31931)菌体，分别接种于装有50 mL PDA液体培养基的250 mL三角瓶中，28°C，120rpm振荡培养24 h,即得种子液；
(2)混菌体系I的构建取里氏木霉ACCC32412种子液2 mL、绿色木霉ACCC31931种子液I mL —齐接入初始pH为5. 5的50 mL稻草发酵培养基(稻草粉6 g，麸皮3 g，豆饼粉3g，玉米粉 2 g, KH2PO4 O. 5 g, CaCl2 O. 3 g，水 IOOmL)中，置于 34。。，120 rpm 条件下混合培养4 d。微生物在培养过程中产木质纤维素酶，进行稻草秸杆的初步降解；通过附图1和附图2对比可以看出，经此处理后稻草秸杆降解非常充分。2.微生物酶的原位酶解糖化
混菌体系I发酵产酶4 d后，提高体系温度至50°C，菌体因高温而失去活性，停止对还原糖的消耗，细胞内的酶被充分地释放出来，同时所产纤维素酶的酶解效果达到最佳状态，木质素降解酶系也始终伴随纤维素酶解过程发挥木质素降解的预处理作用，为纤维素的酶解扫清障碍，里氏木霉ACCC32412和绿色木霉ACCC31931所产木质纤维素酶在原位实现高效酶解糖化，持续72 h，得到稻草秸杆酶解糖化产物。3.稻草糖化液的制备
用4层纱布过滤上述酶解糖化产物，4000 rpm离心25min，上清液即为稻草糖化液。糖化液中还原糖浓度为22. 74 g/L，其中己糖含量约占81. 71 %，戊糖含量约占18. 29%.将糖化液于121°C灭菌30 min即得后续批次发酵培养基。4.构建混菌体系II发酵稻草糖化液产乙醇
(O酵母菌细胞的制备从菌种保藏斜面分别挑取一接种环酿酒酵母CGMCC2. 346(Saccharomyces cerevisiaeCQWZC2. 346 )和热带假丝酵母 ACCC21256 (CancIidatropicalis ACCC21256)菌体，分别接入100 mLPDA液体培养基中，30°C，120 rpm摇床培养48 h，即得酵母菌细胞培养物；
(2)菌悬液配制与细胞计数分别取上述酵母菌细胞培养物4000rpm离心25 min,收集沉淀，用无菌生理盐水配成浓度为O.1 g/mL的菌悬液。血球计数法算出酿酒酵母CGMCC2. 346菌悬液的细胞个数达4. 84 X IO8个/mL，热带假丝酵母ACCC21256菌悬液的细胞个数达3. 43 X IO8个/mL ；
(3)共固定化混合酵母菌的制备和活化分别取上述酿酒酵母CGMCC2.346菌悬液O. 5mL和热带假丝酵母ACCC21256菌悬液O. 5 mL与20 mL的包埋剂(2% SA、6% PVA、I % SiO2溶液)混合均匀后，转入20 mL注射器中，滴入100 mL3% CaCl2,5% H3BO3溶液中，得到直径为3 5 mm的固化小球,置于4°C冰箱过夜后,用无菌生理盐水洗漆2 3次,接入50 mLPDA液体培养基中，进行活化培养(30°C，120 rpm活化24 h后，换新鲜PDA液体培养基，继续活化24 h)，置4°C冰箱备用；得到的共固定化小球切面如附图3 ；(4)共固定化混 合酵母批次发酵稻草糖化液产乙醇取20 mL SA-PVA-SiO2共固定化混合酵母接入30 mL发酵培养基中，橡胶塞塞紧瓶口，28°C，90 rpm培养4 h后，倾倒出发酵醪液，用无菌生理盐水洗涤小球2 3遍，添加新鲜发酵培养基，进行下一个批次的发酵，实验共进行4个批次。重铬酸钾比色法测得发酵醪液中乙醇含量达4. 97 5. 05 mg/mL，乙醇生成速率可达2. 170 g/(L · h)，批次发酵后共固定化小球切面如附图4。
权利要求
1.一种构建混合菌体系发酵稻草秸杆生产乙醇的方法，其特征在于所述方法的过程是(1)制备稻草发酵培养基；(2)利用绿色木霉与里氏木霉混合发酵稻草，协同分泌木质纤维素降解酶，包括木素过氧化物酶、漆酶和纤维素酶；(3)通过变温工艺实现稻草秸杆的原位酶解糖化，从而制备出稻草糖化液；(4)再利用SA-PVA-SiO2共固定化技术将酿酒酵母和热带假丝酵母进行混菌共固定化包埋，该共固定化混合酵母菌颗粒能多批次发酵稻草糖化液。
2.如权利要求1所述的一种构建混合菌体系发酵稻草秸杆生产乙醇的方法，其特征在于所述的稻草发酵培养基的配方为稻草粉6 g，麸皮3 g，豆饼粉3 g，玉米粉2 g, KH2PO4O. 5 g, CaCl2 O. 3 g，水 100 mL。
3.如权利要求1所述的一种构建混合菌体系发酵稻草秸杆生产乙醇的方法，其特征在于所述的混合发酵是指将里氏木霉与绿色木霉以2 I的比例按6%接种量接入稻草发酵培养基中，34°C，120 rpm摇床培养4 d，使得纤维素酶达到最大酶活，与此同时微生物所产木质素降解酶可实现对秸杆的初步预处理，而且这种预处理伴随后续原位酶解的全过程。
4.如权利要求1所述的一种构建混合菌体系发酵稻草秸杆生产乙醇的方法，其特征在于所述的木素过氧化物酶为里氏木霉所分泌。
5.如权利要求1所述的一种构建混合菌体系发酵稻草秸杆生产乙醇的方法，其特征在于所述的漆酶为绿色木霉所分泌。
6.如权利要求1所述的一种构建混合菌体系发酵稻草秸杆生产乙醇的方法，其特征在于所述的纤维素酶为里氏木霉和绿色木霉共同分泌。
7.如权利要求1所述的一种构建混合菌体系发酵稻草秸杆生产乙醇的方法，其特征在于所述的变温工艺是指里氏木霉与绿色木霉混合发酵4 d后，提高混菌体系温度至50°C，菌体失活，停止对还原糖的消耗，木质素降解酶系始终伴随纤维素酶解过程发挥预处理作用，为纤维素的酶解扫清障碍，微生物所产木质纤维素酶在原位实现高效酶解糖化，持续72h后得到稻草秸杆酶解糖化产物。
8.如权利要求1所述的一种构建混合菌体系发酵稻草秸杆生产乙醇的方法，其特征在于所述的SA-PVA-SiO2共固定化混合酵母菌颗粒制备方法如下(I)取浓度为O.1 g/mL的酿酒酵母悬液O. 5 mL和浓度为O.1 g/mL的热带假丝酵母悬液O. 5 mL与20 mL的包埋剂混合均匀，其中，酿酒酵母悬液中细胞个数达到4. 84X 108个/mL，热带假丝酵母悬液中细胞个数达到3. 43 X IO8个/mL，包埋剂含有2 %海藻酸钠、6 %聚乙烯醇和I % SiO2溶液；(2 )将混合溶液转入20 mL注射器中，滴入100 mL的3% CaCl2和5% H3BO3的溶液中，得到直径为3 5 mm的共固化小球，4°C条件下过夜处理。
9.如权利要求1所述的一种构建混合菌体系发酵稻草秸杆生产乙醇的方法，其特征在于所述的共固定化混合酵母菌的多批次发酵是指取活化后的共固定化小球20 mL，接种入30 mL稻草糖化液中，28 °C,90 rpm摇床培养4 h后，将发酵醪液倾倒出来，重新换上新鲜稻草糖化液，共固定化混合酵母菌再进行下一个批次的发酵，发酵醪液的乙醇含量为4. 97 .5.05 g/L，乙醇生产速率可达2. 170 g/(L · h)。
10.如权利要求1所述的一种构建混合菌体系发酵稻草秸杆生产乙醇的方法，其特征在于所述的稻草糖化液中还原糖浓度为22. 74 g/L，其中己糖含量占81.71%，戊糖含量占.18. 29%。
11.如权利要求1或10所述的一种构建混合菌体系发酵稻草稻杆生产乙醇的方法,其特征在于所述的稻草糖化液的制备方法为用4层纱布过滤权利要求7所述酶解糖化产物，4000 rpm离心25 min,取上清液121°C灭菌30 min。
全文摘要
一种完全利用微生物技术实现稻草秸秆转化成乙醇的方法，它采用具有产高效纤维素酶及互补木质素降解酶系特性的绿色木霉和里氏木霉混合发酵稻草秸秆，实现纤维素酶和木质素降解酶的同步产生，达到微生物预处理稻草秸秆效果，并且通过变温工艺实现微生物所产木质纤维素降解酶对稻草秸秆的原位酶解糖化作用；最后，采用SA-PVA-SiO2固定化工艺对能发酵己糖产乙醇的酿酒酵母和能发酵戊糖产乙醇的热带假丝酵母进行混合共固定化包埋，构筑酵母菌适宜发酵产乙醇的微环境，提高了产乙醇的效率，低能耗，不污染，生产周期短，并实现了酵母菌的循环重复利用。
文档编号C12P39/00GK103060418SQ20121051700
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者徐尔尼, 巫小丹, 徐颖宣 申请人:南昌大学