专利名称：一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法。
背景技术：
病毒诱导的基因沉默与传统的研究植物基因功能的方法相比，具有简便高效、周期性短、不需要对植物进行转化和可以沉默基因家族等特点，并且可以在物种间和物种内不同遗传背景的植物间进行基因功能的比较。自1995年Kumagai等首次利用重组烟草花叶病毒(tobaccomosaic virus,TMV)在本氏烟中成功沉默了植物内源八氢番爺红素脱氢酶基因以来，多种VIGS载体相继得到开发和应用。TRV是目前应用最广的VIGS载体.它是由TRVl与TRV2两条RNA病毒链组成，TRVl用于辅助载有靶基因片段的TRV2在植物体内移动。TRV病毒载体有病毒症状较轻、沉默效率高且持久、各种组织均可产生沉默等优点，因而已被广泛应用。尽管VIGS技术具有很多优越性，但还有其内在固有的局限性:VIGS很少能够完全沉默或抑制靶基因的表达，而且沉默水平因不同的植物种类和实验方法而不同，因此，应结合植物种类使用正确的方法获得最大沉默效率。影响VIGS沉默效率有多种因子:1.VIGS载体中插入的目的片段，在VIGS载体中插入的目的片段序列和大小均影响VIGS沉默效率。一般插入目的片段大小以300 500bp为宜，否则片段太大会导致载体病毒移动受阻和外源片段丢失且插入片段与目的基因至少要有连续23bp完全相同，两者序列同源性越高，连续一致序列越长，VIGS效果越好。2.植物培育条件，植物培育条件直接影响病毒侵染和增殖以及植物生长，因此VIGS沉默效果的好坏与植物培育条件密切相关。其中以温度影响最大，同一载体 在不同寄主上沉默适温不同。就TRV而言，相对低温有利于它介导的基因沉默，在番茄上需要低于21°C，而在拟南芥和本氏烟上则以22 25°C最佳。高于28°C几乎完全抑制TRV介导的VIGS ;相对湿度低有利于TRV介导的VIGS，不利的环境条件可能导致促发VIGS的siRNA的产生和积累，从而阻止VIGS产生。3.寄主生育期，寄主生育期对基因沉默效率影响较大，一般在较小的苗期时进行VIGS诱导接种，基因沉默效率较高，太大和太小都不容易进行有效沉默。研究认为病毒的初始积累量对沉默效率影响较大，因此不同生育期可能对病毒的侵染和增殖有较大影响，从而影响VIGS沉默效率。4.VIGS载体的植物导入方法，VIGS载体的植物导入方法直接影响病毒的初始积累量，进而影响基因沉默的起始，因而显著影响VIGS沉默效率。不同病毒载体病毒的接种方法不同，目前常用的接种方法主要包括机械接种、金属粒子轰击和农杆菌介导的接种。农杆菌介导的方法首先是将VIGS载体导入农杆菌，再以农杆菌液对植物进行接种，是一种简便、高效、劳动量少的导入方法。就TRV病毒载体而言，在不同植物上农杆菌接种方法，农杆菌菌株以及农杆菌接种液的制备也各不相同。基于VIGS技术的优越性，VIGS已发展成一项可以快速高通量研究植物基因功能的主要技术之一，得到广泛应用，但VIGS很少能够完全沉默或抑制靶基因的表达，即使靶基因很少的转录本也可能产生功能蛋白，从而干扰对沉默表型的观察，而且沉默效率因不同的植物种类和实验方法而不同，因此对沉默效率的评价以及提高沉默效率成为VIGS技术的关键。
发明内容
本发明的目的克服现有技术中的缺陷，提供一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，利用本发明所述的方法获得的沉默植株，获得病毒诱导醋栗番茄内源基因最佳沉默体系。其具体技术方案为:一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，包括以下步骤:(I)重组病毒质粒TRV2-PDS的构建与转化农杆菌；(2)醋栗番茄幼苗培养；(3)接种农杆菌浸染液于醋栗番茄幼苗；(4)病毒诱导醋栗番茄PDS基因沉默。步骤(I)中，获得所述重组病毒质粒TRV2-PDS为pTRV2载体与408bp PDS基因片段通过Sac I和Xho I酶切位点连接，连接产物转化DH5a大肠杆菌，于含有卡那霉素的LB平板上37°C静置培养12-16h，获得单克隆菌落，单克隆菌落在含卡那霉素的LB液体培养基中37°C、200rpm/min震荡培养12_16h，扩繁得到的单克隆菌液通过裂解法提取重组质粒，重组质粒经过Sac I和Xho I双酶切验证，获得TRV2-PDS重组质粒。步骤(I)中，TRV2-PDS重组质粒转化农杆菌的方法为冻融法，转化的农杆菌菌株为GV3101，在含有卡那霉素、庆大霉 素、利福平抗生索的LB平板上28 °C静置培养36_48h，筛选出含有TRV2-PDS质粒的阳性单克隆菌落。步骤⑵中，所述的番茄幼苗特征为，播种后12-14d，子叶展平，真叶刚刚冒出。步骤(3)中，农杆菌浸染液的准备过程为:步骤(I)获得的含有TRV2-PDS质粒的阳性单克隆农杆菌菌落，在含抗生素的LB液体培养基中28°C、200rpm/min震荡培养24-36h，取培养液以1: 25比例稀释于诱导培养基中，继续培养至OD6tltl为0.5-0.8，取培养产物25ml于离心管中，以5000rpm离心，获得的菌体用MgCl2+MES(10mM，PH5.6)等体积悬浮，再离心，重新悬浮并调节为0D_2.0、OD6003.0，用上述方法准备TRVl菌液，将TRVl与TRV2或TRV2-PDS菌液等体积混合液用于浸染番茄幼苗。步骤(3)中，所述的接种方法为注射法或摩擦法。步骤(3)中，所述的醋栗番茄幼苗为步骤(2)培养所得，且接种后在人工气候箱中培养，培养条件为21-23°C、相对湿度50%，光周期为16L-8D。步骤(4)中，基因沉默现象在浸染后12d出现，表现为接种植株出现白化或黄化现象，TRV2-PDS病毒载体成功诱导醋栗番茄PDS基因沉默。本发明还进一步提出了病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的评价方法，包括以下评价指标:沉默频率，沉默效力，沉默效果。本发明还提供了上述评价指标的计算方法:所述沉默频率为，含有TRV-PDS重组质粒的农杆菌接种的醋栗番茄植株中，出现白化或黄化症状的植株所占的比例。即
权利要求
1.一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)重组病毒质粒TRV2-PDS的构建与转化农杆菌； (2)醋栗番茄幼苗培养； (3)接种农杆菌浸染液于醋栗番茄幼苗； (4)病毒诱导醋栗番茄PDS基因沉默。
2.根据权利要求1所述的提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，其特征在于，步骤(I)中，获得所述重组病毒质粒TRV2-PDS为pTRV2载体与408bp PDS基因片段通过Sac I和Xho I酶切位点连接，连接产物转化DH5 α大肠杆菌，于含有卡那霉素的LB平板上37°C静置培养12-16h，获得单克隆菌落，单克隆菌落在含卡那霉素的LB液体培养基中37°C、200rpm/min震荡培养12_16h，扩繁得到的单克隆菌液通过裂解法提取重组质粒，重组质粒经过Sac I和Xho I双酶切验证，获得TRV2-PDS重组质粒。
3.根据权利要求1所述的提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，其特征在于，步骤(I)中，TRV2-PDS重组质粒转化农杆菌的方法为冻融法，转化的农杆菌菌株为GV3101，在含有卡那霉素、庆大霉素、利福平抗生素的LB平板上28 °C静置培养36_48h，筛选出含有TRV2-PDS质粒的阳性单克隆菌落。
4.根据权利要求1所述的提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的番茄幼苗特征为，播种后12-14d，子叶展平，真叶刚刚冒出。
5.根据权利要求1所述的提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，其特征在于，步骤(3)中，农杆菌浸染液的准备过程为:步骤(I)获得的含有TRV2-PDS质粒的阳性单克隆农杆菌菌落，在含抗生素的LB液体培养基中28°C、200rpm/min震荡培养24_36h，取培养液以1: 25比例稀释于诱导培养基中，继续培养至0D_为0.5-0.8，取培养产物25ml于离心管中，以5000rpm离心,获得的菌体用MgCl2+MES (IOmM, PH5.6)等体积悬浮,再离心,重新悬浮并调节为0D6002.0、0D6003.0，用上述方法准备TRVl菌液，将TRVl与TRV2或TRV2-PDS菌液等体积混合液用于浸染番茄幼苗。
6.根据权利要求1所述的提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的接种方法为注射法或摩擦法。
7.根据权利要求1所述的提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的醋栗番茄幼苗为步骤(2)培养所得，且接种后在人工气候箱中培养，培养条件为21-23°C、相对湿度50%，光周期为16L-8D。
8.根据权利要求1所述的提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，其特征在于，步骤(4)中，基因沉默现象在浸染后12d出现，表现为接种植株出现白化或黄化现象，TRV2-PDS病毒载体成功诱导醋栗番茄PDS基因沉默。
全文摘要
本发明公开了一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，本发明综合考虑了影响VIGS沉默效率的多方面因素，通过不同接种方法与接种农杆菌菌液浓度，结合沉默效率沉默频率、沉默效力、沉默效果，评价方法得到了醋栗番茄病毒诱导基因沉默的最优体系，适宜的接种方法与浓度提高了沉默效率。用本发明方法评价VIGS沉默效率时间短、速度快、效率高，可应用于其他植物病毒诱导基因沉默优化体系的评价，为快速验证基因功能提供了有效的方法。
文档编号C12N15/63GK103146743SQ20121051035
公开日2013年6月12日 申请日期2012年11月18日 优先权日2012年11月18日
发明者梁燕, 李翠, 张振才 申请人:西北农林科技大学