专利名称：一种用于检测辣椒疫霉的引物及其检测试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明主要涉及 一种用于检测疫霉菌的通用分子引物、检测辣椒疫霉的特异性分子引物及其检测试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术：
辣椒疫霉能引起辣椒、南瓜、西葫芦等多种作物发病，俗称“死秧病”，常引致辣椒等作物死苗、烂果，一般死株率为15% — 30%，严重时高达60%以上，甚至毁种，严重影响辣椒等作物的产量与品质。该病于1918年在美国最早发现，Leonian于1922年分离并定名为Phytophthora capsici Leon。我国于60年代初始见于新疆，70年代偶尔发生，80年代中期以来连年发生，且很快由新疆经甘肃、青海等省迅速蔓延开来，现在陕西、江西、上海、湖南、安徽等全国大部分地区该病的危害都非常严重，特别是近年来，随着我国农业产业结构的调整，设施农业大量发展，辣椒种植面积不断扩大，该病在我国有逐年加重的趋势。这种严峻的形势要求尽快建立一套快速灵敏的检测方法用于辣椒疫病的早期诊断，为辣椒疫病的防治提供依据。传统检测植物病害的方法为通过直接观察植物组织的发病症状，分离得到病原物后再进行形态学鉴定。然而直接观察会遗漏潜育期或隐症的病害，以致延误病害的防治，导致病害的爆发。辣椒疫霉菌引起的病害很容易与腐霉菌和镰刀菌引起的病害症状相混淆。因此对于辣椒疫霉诊断来说，分离得到病原菌的纯培养是必要的。而得到辣椒疫霉菌的纯培养后的鉴定工作依然困难重重，且辣椒疫霉与其他疫霉种之间形态差异较小，采用形态学为主要分类依据的传统鉴定方法很难对疫霉菌进行准确的鉴定，也难以快速及时地进行病害的诊断。费时费力，而且要求操作者具备丰富的疫霉菌分离、形态学鉴定知识，对基层植保工作者具有一定的难度。因此，开发出快速灵敏、易操作、易普及的检测方法对于控制由辣椒疫霉菌弓I起的病害具有十分重要的意义。从聚合酶链式反应(PCR)发明以来，便以其快速灵敏的特性成为动植物病原物检测的重要方法。跟传统的检测方法相比较，PCR技术具有高度的特异性及灵敏度，且耗时短等优点，更可通过实时定量PCR技术对植物病毒、细菌、真菌及卵菌进行定量检测。发展分子检测方法的基础是寻找合适的病原菌分子靶标，目前广泛采用的植物疫病菌分子检测靶标是核糖体基因ITS序列，该序列在许多疫霉种间缺乏足够的多态性。此外，elicitin基因也被用来作为疫霉菌检测的标靶，Ras家族相关的编码基因Yptl被广泛用于疫霉菌的分子检测，线粒体编码基因Cbzl、Cbz2和可能编码储存蛋白的Zpr基因分别作为橡树疫霉iP.ramorum )和樟疫霉iP.cinnamomi )检测的革巴标。本发明旨在寻找辣椒疫霉中新的分子检测靶标。Yktep是一个细胞存活必须的R-SNARE蛋白，Ykt6在真核生物的进化上非常保守，将不同物种中的Ykt6氨基酸序列进行比对分析，结果表明，在系统进化上疫霉和植物及藻类在亲缘关系上比真菌更近，这与疫霉的分类地位完全符合。由此我们将Ykt6作为一个新的分子检测靶标，通过序列比对分析设计出了一对疫霉潜在的通用分子检测引物，并在此基础上设计了辣椒疫霉特异性的分子检测引物。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测疫霉菌的通用分子检测引物、检测辣椒疫霉的特异性分子检测引物及其检测试剂盒。本发明是通过以下技术方案实现的:
一种用于检测辣椒疫霉的分子引物及 其检测试剂盒，所述的检测辣椒疫霉的特异性引物为:
上游(20bp) PcyktF: AGATGGTATGTCGCTATGAC 下游(20bp) PcyktR: ACATTTCGTAACGTCAACAT 所述的用于检测疫霉菌的通用引物为:
上游(2lbp) PyktF:AGAGTTGCTGCGCCAGGATGG下游(2lbp) PyktR:GTCTTGGACAACACGGCGGTG所述的检测试剂盒为:
检测溶液 I 包括:25mmol Tris.Cl (PH 8.3)、125mmol KC1、3.75 mmol MgCl2'
0.25mmoldNTPs、疫霉属的通用引物 PyktF/PyktR 各 I u mol、0.lmgBSA、Taq DNA 聚合酶50U，加入超纯水制备成ImL检测溶液。保存期限为I年。检测溶液II 包括:25mmol Tris.Cl (PH 8.3)、125mmol KC1、3.75 mmol MgCl2'
0.25mmoldNTPs、疫霉属的通用引物 PcyktF/PcyktR 各 liimol、0.1mgBSA> Taq DNA 聚合酶50U，加入超纯水制备成ImL检测溶液。保存期限为I年。所述的检测试剂盒的使用方法为:
当直接使用辣椒疫霉特异性引物进行检测时，提取待检测物DNA，取5 y L溶液作为反应模板，取试剂盒II中的溶液IOii L,另取IOii L去离子水加入200 ii L反应小管中，混匀后PCR扩增，程序为94°C变性3分钟，94°C变性30秒；58°C退火30秒；72°C延伸30秒；32个循环，最后72 °C延伸5分钟；
当使用套式PCR进行检测时，提取待检测物DNA，取5 ii L溶液作为反应模板，取试剂盒I中的溶液IOii L,另取IOii L去离子水加入200 ii L反应小管中，混匀后PCR扩增,程序为94°C变性3分钟，94°C变性30秒；58°C退火30秒；72°C延伸30秒；32个循环，最后72°C延伸5分钟。将反应结束后的PCR产物用水稀释5倍后取5 u L，取试剂盒II中的溶液10 u L，另取10 ii L去离子水加入200 u L反应小管中，混匀后PCR扩增，程序为94°C变性3分钟，94°C变性30秒；58°C退火30秒；72°C延伸30秒；32个循环，最后72°C延伸5分钟；
扩增产物的电泳检测:取IOuL PCR扩增产物，在1% (质量体积比)的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为120V，20分钟后在紫外光下检测结果。如果存在分子量约为282bp的条带，则证明所检病原为辣椒疫霉。本发明的优点是:
本发明提供了疫霉菌的通用分子检测引物及辣椒疫霉的特异性引物，以及含有该引物的试剂盒。本发明通过序列比对，找到了一个潜在的疫霉属通用检测引物，通过实验验证，该引物可在实验提供的16个不同疫霉种扩增出一条约630bp (不同种间大小有差异)大小的条带，为其它疫霉种的分子检测提供了一个潜在的分子靶标。
本发明中所设计的一对辣椒疫霉检测引物特异性高，在对14个不同疫霉种和12个其它真菌进行检测时，只有辣椒疫霉能特异性的检测出一条282bp的电泳条带，且在辣椒疫霉菌株中的检出率达到100%。可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境准确地检测出辣椒疫霉。利用套式PCR方法，本发明最低可以检测出Ifg DNA含量的样品，即相当于可以检测出一个游动孢子和一个卵孢子，检测灵敏度高。
图1.疫霉属通用引物PyktF、PyktR PCR验 证结果，1.卞豆疫霉iPhytophthoraso Jae) ^2.辣傲备霉{Phytophthora capsi ci )>3.恶备霉{Phytophthora cactorum)、
4.燒、他後霉{Phytophthora cryptogea )^.烟草疫霉从ora nicotianae、、
6.掠榈疫霉 iPhytoph thora palmi vora )、7.瓜类疫霉 iPhytoph thora me I on is)、8.掘氏後霉 iPhytophthora drechsleri)、9.蒸枝疫霉 iPhytophthora Iitchii )、10.芒麻疫霉 iPhytoph thora boehmeriae )> 11.致病疫霉 iPhytoph thora infes tans )、12.苜猜疫^ (.Phytophthora medicagini5)> 13.墙疫霉(^Phytophthora cinnamomi)> 14.$(.Phytophthora parasi)> 15-18.腐霉属(Phythium.spp)、19.禾谷键刀菌(/7W1Sari應graminearum)>20.尖抱键刀舊 QFusarium oxysporum)^21.稻痕病菌(Magnaportheoryzae)>22.辣椒炭疽病菌capsici)>23.油菜菌核病菌(5b7<9ro(i/ iasclerotiorum)>24.1Botrytis cinerea)。图2.辣椒疫霉特异性引物(PcyktF、PcyktR)的验证，1-4、分离自不同地区的辣椒疫霉菌株、5.大豆疫霉、6恶疫霉、7.隐地疫霉、8.烟草疫霉、9.棕榈疫霉、10.瓜类疫霉、
11.掘氏疫霉、12.荔枝疫霉、13.苎麻疫霉、14.致病疫霉、15.苜蓿疫霉、16.樟疫霉、17.寄生疫霉、18-20.腐霉属、19.禾谷镰刀菌、20.尖孢镰刀菌、21.稻瘟病菌、22.辣椒炭疽病菌、23.油菜菌核病菌。图3.使用疫霉通用引物(PyktF、PyktR)和辣椒疫霉特异性引物(PcyktF、PcyktR)进行套式PCR扩增进行灵敏度验证。对应的辣椒疫霉DNA浓度分别为lng、lOOpg、10pg、lpg、lOOfg、10fg、lfg、100ag、IOag
图4.辣椒疫霉特异性引物(PcyktF、PcyktR)对土壤中卵孢子的PCR检测，1.阳性对照，2-3，发病田块土壤中卵孢子的分离结果。4，没有发病的田块土壤分离结果6.阴性对照图5.辣椒疫霉特异性引物(PcyktF、PcyktR)对发病植株的PCR检测，1.阳性对照，2-4.发病植株,5.健康植株,6.阴性对照
图6.辣椒疫霉特异性引物(PcyktF、PcyktR)对污染河水中游动孢子的PCR检测，1.阳性对照，2-3，污染河水中的检测结果。4，没有污染的水中检测结果6.阴性对照。
具体实施例方式实施例1
(I)土壤中残留辣椒疫霉卵孢子的检测结果:
土壤中卵孢子的富集:取待检土壤样品20-100克，研碎，先后采用200目筛网去除较大土粒，然后经过400、500、800目筛网过滤，同时用3-10升水反复冲洗，从800目筛网上收集卵孢子，用Iml水悬浮。由于卵孢子不能透过800目筛网，这样处理可以达到使卵孢子富集的效果。卵孢子DNA的提取:将用无菌水悬浮的卵孢子转移到1.5 mL的离心管中，在12000r.min-1转速下离心5分钟，吸出上清液，留15 y L液体吸打混匀后吸入研钵中，液氮研磨后取粉末于小管中，CTAB法提取基因组，方法如下，加900 ii L 2% CTAB提取液和90 U I 10%SDS，漩涡混匀，于60°C水浴I h，中间每10 min上下颠倒几次，12000 rpm离心10 min，取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，12000 rpm离心10 min ;将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混勻，12000 rpm离心5 min。上清转移至新管中,加等体积甲醇沉淀，12000 rpm离心10 min，倾去上清，沉淀用70%乙醇洗涤一次，室温晾干。加适量灭菌超纯水(含20 ug/ml RNase)，37°C处理I h后，用于后备实验。PCR扩增及电泳检测(图4)，参见试剂盒使用指南。(2)辣椒感病植株的检测结果:
发病植株DNA的提取:将有水浸状病斑 的辣椒叶片或根茎部位用70%酒精消毒后，用液氮研磨后取少量粉末，采用CTAB法提取基因组(方法见上)。也可使用碱裂解法快速提取DNA，方法如下，取一段发病的植株组织，每毫克组织加入10 W 0.5 M NaOH，充分研磨后转移至1.5 ml的EP管中，12000 rpm离心5 min，取上清用于后续PCR扩增实验。PCR扩增及电泳检测(图5)，参见试剂盒使用指南。(3)辣椒疫霉污染水源中游动孢子的检测结果:
游动孢子的富集及DNA提取:辣椒疫霉在有水膜的环境下能够形成孢子囊并释放大量游动孢子，是再侵染的重要途径。取辣椒疫霉污染水源500mL，在5000g的离心力下离心20min,倒去上清液，沉淀的游动孢子用100 u L水悬浮，转入1.5mL离心管，加入0.05g石英砂，涡旋震荡10秒后，2000r.min-1离心5分钟后取上清用于后续PCR扩增。
权利要求
1.一种用于检测辣椒疫霉的引物及其检测试剂盒，其特征在于所述的辣椒疫霉分子检测引物为: 上游(20bp) PcyktF: AGATGGTATGTCGCTATGAC 下游(20bp) PcyktR: ACATTTCGTAACGTCAACAT, 所述的疫霉属通用引物为:上游(2 lbp) PyktF:AGAGTTGCTGCGCCAGGATGG 下游(21bp) PyktR:GTCTTGGACAACACGGCGGTG 所述的检测试剂盒为: 检测溶液 I 包括:25mmol Tris.Cl (PH 8.3)、125mmol KC1、3.75 mmol MgCl2'`0.25mmoldNTPs、疫霉属的通用引物 PyktF/PyktR 各 I u mol、0.lmgBSA、Taq DNA 聚合酶50U，加入超纯水制备成ImL检测溶液；保存期限为I年； 检测溶液 II 包括:25mmol Tris.Cl (PH 8.3)、125mmol KC1、3.75 mmol MgCl2'`0.25mmoldNTPs、辣椒疫霉疫霉特异性引物 PcyktF/PcyktR 各 I y mol、0.1mgBSA, Taq DNA聚合酶50U，加入超纯水制备成ImL检测溶液；保存期限为I年； 所述的检测试剂盒的使用方法为: 当直接使用辣椒疫霉特异性引物进行检测时，提取待检测物DNA，取5 y L溶液作为反应模板，取试剂盒II中的溶液IOii L,另取IOii L去离子水加入200 ii L反应小管中，混匀后PCR扩增，程序为94°C变性3分钟，94°C变性30秒；58°C退火30秒；72°C延伸30秒；32个循环，最后72 °C延伸5分钟；` 当使用套式PCR进行检测时，提取待检测物DNA，取5 ii L溶液作为反应模板，取试剂盒I中的溶液IOii L,另取IOii L去离子水加入200 ii L反应小管中，混匀后PCR扩增,程序为94°C变性3分钟，94°C变性30秒；58°C退火30秒；72°C延伸30秒；32个循环，最后72°C延伸5分钟；将反应结束后的PCR产物用水稀释5倍后取5 u L，取试剂盒II中的溶液10 u L，另取10 ii L去离子水加入200 u L反应小管中，混匀后PCR扩增，程序为94°C变性3分钟，94°C变性30秒；58°C退火30秒；72°C延伸30秒；32个循环，最后72°C延伸5分钟； 扩增产物的电泳检测:取IOuL PCR扩增产物，在1% (质量体积比)的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为120V，20分钟后在紫外光下检测结果；如果存在分子量约为282bp的条带，则证明所检病原为辣椒疫霉。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测辣椒疫霉的引物及其检测试剂盒，其特征在于辣椒疫霉特异性检测引物为上游(20bp) PcyktF: AGATGGTATGTCGCTATGAC、下游(20bp) PcyktR: ACATTTCGTAACGTCAACAT，疫霉菌通用引物为上游(21bp)PyktFAGAGTTGCTGCGCCAGGATGG、下游(21bp)PyktRGTCTTGGACAACACGGCGGTG。本发明找到了一个潜在的疫霉属通用检测引物，通过实验验证，该引物可在实验提供的14个不同疫霉种扩增出一条约630bp(不同种间大小有差异)大小的条带，为其它疫霉种的分子检测提供了一个潜在的分子靶标。
文档编号C12N15/11GK103103255SQ20121047250
公开日2013年5月15日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者戚仁德, 赵伟, 汪涛 申请人:安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所