专利名称：山猪cast基因特异分子标记及应用的利记博彩app
山猪CAST基因特异分子标记及应用技术领域
本发明属于动物基因工程技术领域。技术背景
山猪(Shanzhu)是江苏省的特色地方猪品种，具有肉质优良、瘦肉率高、强健好养、 产仔数多、抗病抗逆性强等优良特性。随着引进猪种的冲击和大面积推广，山猪面临着优良基因流失和优良性状逐年退化的威胁。目前采用传统育种方法来保护该地方良种猪，并使之选育提闻。
传统育种方法大多利用杂种优势对山猪进行选育，但是受环境条件的干涉与影响大，以表型为基础的选择复杂，育种周期长，耗时耗力。利用DNA分子标记技术可以对山猪种质资源中重要经济性状基因进行分子作图与标记，准确地对育种目标进行选择，大大缩短育种周期，提高育种效率。但目前研究的DNA分子标记均不是山猪的特异变异点，限制了分子标记辅助选择技术在山猪育种研究中的应用。在山猪肉质相关基因的研究中，我们发现山猪的CAST基因与几乎所有国内外猪品种的CAST基因存在显著差异，即在山猪的CAST 基因中存在一个特有的小片段插入，其他猪品种CAST基因中均未发现该小片段插入。发明内容
本发明成功利用山猪CAST基因中特有的小片段插入，建立一种特异性检测山猪 CAST基因的分子标记辅助选择的方法，为山猪种质资源利用和分子标记辅助育种服务。
本发明所述的山猪CAST基因，它的序列如SEQ ID No. I所示。与几乎所有国内外猪品种的CAST基因相比，山猪CAST基因存在一个特有的小片段插入，即SEQ ID No. I中的第1032 - 1035的4个碱基CTTT。
本发明所述的山猪CAST基因特异分子标记，长度为435bp，其序列如SEQ ID No. 2 所示；其特异性引物为
F:5’-GTACTTTCTTTGAATTACAG-3’ (SEQ ID No. 5)
R:5，-GCAGATACACCCGTAACTG-3，(SEQ ID No. 6)。
本发明山猪是在江苏省南京市畜牧家禽科学研究所山猪扩繁基地采集。该猪种具有以下特点
a.形态特征山猪体型稍小，被毛全黑，脸面呈狮子头型、马头型或鲫鱼头型，皮肤较粗无皱褶，四肢有力，身体粗短。
b.肉质特征山猪经产母猪产仔数12-14头。生长速度为IOOkg体重日龄150-160 天，日增重800-850g。瘦肉率60%以上，IOOkg体重的活体背膘厚22-25mm，肌内脂肪3.0-3. 3%，无PSE肉、DFD肉，系水力(滴水损失％) ( 3，大理石纹评分3. 0-3.5，肉色评分3.0-4. 0，拿破率彡 76%, PH45 彡 6. 2-6. 6，PH24 彡 5. 5-5. 8，嫩度彡 3. 8kg。
本发明采用特异引物从山猪猪耳样本中扩增出山猪CAST基因第8外显子片段，再采用特异设计的引物(序列如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6)从第8外显子片段中扩增出山猪CAST基因的特有片段。
以GenBank中登录号为AY594692的序列为参照，山猪CAST基因的核苷酸序列特征是山猪CAST基因在AY594692序列的1031和1032之间存在特有的小片段CTTT插入， 其他猪品种均未发现该小片段插入。
一对用于检测权利要求2所述山猪CAST基因分子标记的特异性引物，该引物对的序列如 SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 所示。
本发明还公开了所述山猪CAST基因分子标记在育种目标选择中的应用。
用CAST基因进行山猪分子标记辅助选择的检测方法，是采用如SEQ ID No. 5和 SEQ ID No. 6所示特异引物对DNA样本进行PCR扩增，获得435bp的特异扩增条带的样本为目标样本。
通过上述方法制备的CAST基因分子标记，可有效检测山猪CAST基因在山猪与其他猪品种进行杂交所产生的各种杂交后代中的表现，使其对山猪分子标记辅助选择具有广泛的应用价值。如运用该检测技术对不同猪品种的CAST基因分子标记进行检测，结果显示，在90头山猪中，检测到89头山猪的CAST基因具有该特异的分子标记，检出率达到 98. 89% ;在50头山猪与其他猪品种进行杂交所产生的杂交Fl代群体中，检测到49头猪的CAST基因具有该特异的分子标记，检出率达到98% ;在40头山猪与其他猪品种进行杂交所产生的杂交F2代群体中，检测到28头猪的CAST基因具有该特异的分子标记，检出率达到70% ;在杜洛克猪、巴克夏猪等猪品种中未检测出该特异的分子标记。本发明制备的山猪 CAST基因特异分子标记可以准确地对育种目标进行选择。
本发明是基于动物基因工程技术的作为山猪分子标记辅助选择应用的CAST基因特异分子标记的制备及应用，具有对育种目标选择周期短，操作简单，受环境因素影响小， 选择具有很高的准确度等一系列优点，并且制备的CAST基因分子标记是山猪的特异变异点，可以为山猪分子标记辅助选择育种提供可靠的平台。
图I对不同猪品种的CAST基因分子标记检测部分图谱。I :杜洛克猪；2 :巴克夏猪;3、4 山猪;5、6 :杂交Fl代；7，8 :杂交F2代。
图2对不同猪品种的CAST基因分子标记检测部分图谱。1、2 :杂交Fl代；3、4 ■ 杂交F2代;5、6 :山猪；7 :杜洛克猪。
具体实施方式
实施例I山猪CAST基因的分子标记的建立
(I)提取山猪基因组DNA :采集山猪猪耳样本，置于含有O. 5mL 75%乙醇的I. 5mL 离心管中，4°C或-20°C保存，采用酚氯仿方法提取基因组DNA;
(2 )制备CAST基因部分片段采用引物序列F: 5 ’ -TGCGCTGAGCCACAAAGAGA-3， (SEQ IDNo. 3)和 R:5，-TGCAGGGCTGGTCACATCAG-3，(SEQ ID No. 4)对步骤(I)中获得的山猪基因组DNA进行CAST基因的PCR扩增，获得一条约1440bp的扩增条带，其序列如SEQ ID No. I 屮0 反应体系是2(^1^ 10X 缓冲液2 μ L，I. 5mmol/L MgCl2L 2 μ L，IOmmoI/L dNTP混合物0.4“1^，1(^11101/1引物各0.3 4 1^100叩/^14莫板0嫩 I. 2μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶O. 2 μ L ;PCR循环参数是94°C预热3min，然后以94°C变性30s，61 °C退火30s，72°C延伸 45s，进行30-35个循环，最后于72°C延伸7min。
(3 )制备山猪CAST基因的分子标记以步骤(2 )得到的PCR产物为模板，以 F:5’-GTACTTTCTTTGAATTACAG-3’ (SEQ ID No. 5)和 R:5’-GCAGATACACCCGTAACTG_3’ (SEQID No. 6)为引物对进行PCR扩增，获得435bp的特异扩增条带。PCR反应体系是20 μ L :10X 缓冲液 2 μ L，I. 5mmol/L MgCl2L 2 μ L, IOmmoI/L dNTP 混合物 O. 4 μ L, 10 μ mol/L 引物各O.3μ L，lOOng/μ L模板DNA I. 2μ L,5U/y L Taq DNA聚合酶0. 2 μ L ;PCR循环参数是94°C 预热3min，然后以94°C变性30s，61°C退火30s，72°C延伸45s，进行30个循环，最后于72°C 延伸7min。PCR产物可直接测序(上海生工生物工程股份有限公司提供测序服务)后即得山猪CAST基因特异分子标记，其序列如SEQ ID No. 2所示。
实施例2
采集山猪、杜洛克猪、巴克夏猪等猪品种猪耳样本，置于含有O. 5mL 75%乙醇的1.5mL离心管中，-20°C保存，采用酚氯仿方法提取基因组DNA。采用引物序列 F:5’-GTACTTTCTTTGAATTACAG-3’ (SEQ ID No. 5)和 R:5’-GCAGATACACCCGTAACTG_3’ (SEQID No. 6)对分别上述获得的基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系如实施例I步骤(3)。结果如图I、图2，在90头山猪中，检测到89头山猪的CAST基因具有该特异的分子标记(435bp 的扩增条带)；检出率达到98. 89%。而杜洛克猪、巴克夏猪等猪品种中未检测出该特异的分子标记。
实施例3
提取50头山猪与其他猪品种进行杂交所产生的杂交Fl代的基因组DNA，采用引物序列 F:5，-GTACTTTCTTTGAATTACAG-3’ (SEQ ID No. 5)和 R:5，-GCAGATACACCCGTAACTG-3， (SEQID No. 6)对杂交Fl代的基因组DNA进行PCR扩增，获得435bp的扩增条带(图I、图 2)。PCR反应体系如实施例I步骤(3)。结果在50头山猪与其他猪品种进行杂交所产生的杂交Fl代群体中，检测到49头猪的CAST基因具有该特异的分子标记，检出率达到98%。
实施例4
提取40头山猪与其他猪品种进行杂交所产生的杂交F2代的基因组DNA，采用引物序列 F:5，-GTACTTTCTTTGAATTACAG-3’ (SEQ ID No. 5)和 R:5，-GCAGATACACCCGTAACTG-3， (SEQID No. 6)对杂交F2代的基因组DNA进行PCR扩增，获得435bp的扩增条带(图I、图 2)。PCR反应体系如实施例I步骤(3)。结果在40头山猪与其他猪品种进行杂交所产生的杂交F2代群体中，检测到28头猪的CAST基因具有该特异的分子标记，检出率达到70%。
权利要求
1.山猪CAST基因，其特征在于，它的序列如SEQID No. I所示。
2.山猪CAST基因分子标记，其特征在于，它的序列如SEQID No. 2所示。
3.一对用于检测权利要求2所述山猪CAST基因分子标记的特异性引物，其特征在于该引物对的序列如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。
4.权利要求2所述山猪CAST基因分子标记在育种目标选择中的应用。
5.一种山猪CAST基因特异分子标记检测方法，包括以下步骤是采用如SEQ ID No. 5 和SEQ ID No. 6所示特异引物对DNA样本进行PCR扩增，获得435bp的特异扩增条带的样本为目标样本。
全文摘要
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种作为猪分子标记辅助选择应用的分子标记的制备及应用。本发明制备的分子标记从山猪CAST基因中克隆得到，所述的分子标记的核苷酸序列SEQ ID No.2所示，该分子标记是山猪的特异变异点。本发明还公开了扩增该分子标记所用的引物以及用于山猪CAST基因特异分子标记检测的方法，为山猪分标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
文档编号C12N15/11GK102925450SQ201210468540
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者许晓风, 王薇, 薛文达, 章熙霞, 金邦荃, 马飞 申请人:南京师范大学