专利名称：一种同时检测醋醅中四种功能微生物的多重pcr技术的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种用于检测醋醅微生物群落中功能微生物的多重PCR技术。
背景技术：
我国食醋的生产历史悠久，但众多的食醋生产厂家的发酵过程都以传统的经验为主，工艺可控性较差，并且产品品质存在批次差异，尤其是风味差异较大。这主要是由于酿造过程中微生物复杂多样，对醋醅发酵过程中的微生物作用机制不清楚。中国食醋的酿造工艺是多菌种混合发酵工艺，通过多种微生物的代谢作用产生风味饱满、酸味柔和的食醋。食醋的生产中有两个主要的发酵阶段酒精发酵和醋酸发酵。在酒精发酵阶段，淀粉质原料如糯米、高粱等经过霉菌和酵母菌的一系列代谢，最终生成酒精；而在醋酸发酵阶段是包括醋酸菌、乳酸菌以及芽孢杆菌在内的众多细菌起主要的作用，该阶段是决定食醋风味和品质的关键步骤。前期研究结果表明醋酸菌、乳酸菌以及芽孢杆菌是醋酸发酵过程的功能微生物，并且其丰度之和在整个细菌群落中占到90%以上，但是对于功能微生物在发酵过程中的动态变化情况还不清楚，快速阐明发酵过程中醋酸菌、乳酸菌以及芽孢杆菌等功能微生物的动态变化对于控制食醋发酵过程以及提高产品的风味具有重要的生产意义。有鉴于此，探索和引入新的技术方法和手段以全面地了解传统酿造系统中的微生物种类，进而阐明酿造过程中微生物的作用机制，已成为重新认识和改造传统产业的迫切需求。多重PCR (multiplex PCR)又称多重引物PCR或复合PCR，是PCR技术的一种，是指在同一反应体系中加入两对或两对以上引物，同时扩增多个目的基因或DNA序列。多重PCR可以扩增一个物种的一个 片段也可以同时扩增多个物种的不同片段。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有食醋固态酿造分析技术的不足，提供了一种多重PCR技术用于同时检测食醋酿造过程中多种功能微生物，该方法简便高效，在同一 PCR条件下能对多种微生物进行同时检测。本发明的目的通过以下方案实现1、醋醅微生物群落中功能微生物的确定利用分子生态技术一DGGE解析醋醅中微生物群落的结构，并结合与食醋自身品质相关的理化参数确定食醋酿造过程中的功能微生物为一种醋酸菌，一种芽孢杆菌和两种乳酸菌。2、醋醅群落中功能微生物的纯培养采用微生物纯培养技术从醋醅中获得酿醋功能性微生物菌株。3、多重PCR技术的建立针对醋醅群落中的4种功能性微生物设计特异性引物，以纯菌基因组DNA为模板，对四重PCR的反应体系和反应程序进行优化，最终实现在同一 PCR条件下对醋醅微生物群落中的4种功能微生物同时进行检测。该方法简便、经济、高效，在同一 PCR反应管内能对多种微生物同时检测，是研究复杂微生物群落有效的技术手段之一。具体实施路线如下1、醋醅微生物群落总基因组DNA的提取称正常发酵过程的醋醅2-5g，采用液氮研磨、溶菌酶和蛋白酶酶解、氯仿-异戊醇抽提、乙醇洗涤、RNaseA消化等步骤提取总基因组DNA。2、合成细菌16S rDNA V3区引物Pl，P2，并以醋醅群落微生物总DNA为模板进行PCR扩增，得到细菌16S rDNA V3区的扩增片段，所述的引物P1、P2的序列为P1 :5’ -ATTACC GCG GCT GCT GG-3， ；P2 :5， -[CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGGGGG G]CC TAC GGG AGG CAG CAG-3’。3、利用变性凝胶梯度电泳(DGGE)对细菌16S rDNA V3区扩增片段进行分析，其电泳条件为8%聚丙烯酰胺凝胶，30% 50%变性梯度(100%变性剂浓度为7M尿素，40%甲酰胺)，上样量为200 ng，缓冲液为lxTAE，60°C，200V电压电泳3. 5-4 h, SYBRGreen I染色45min04、优势微生物的序列测定选择DGGE凝胶上10_20个最显著的条带，割胶回收进行序列分析，在NCBI中进行BLAST比对，初步确定优势微生物的种属。5、功能微生物的筛选以醋醅为筛选对象，采用3种不同的培养基(肉汤，GYC,MRS)对不同功能微生物进行分离，选择生长较快、菌落形态不同、且GYC平板上有透明圈的60-80个菌落，纯化后保存。所述的培养基组成为
肉汤培养基(g/100 mL):葡萄糖2. 5，蛋白胨1，牛肉膏1，酵母粉O. 5，氯化钠O. 3，琼脂
2.0，pH 7. 0-7. 2用前加入5 mL无水乙醇；
MRS培养基(g/100 m L):胰蛋白胨1，牛肉膏1，酵母粉0.5，磷酸氢二钾O. 2，乙酸钠
O.5，柠檬酸三铵O. 2，葡萄糖2，七水硫酸镁O. 058，一水硫酸锰O. 019，吐温80 O.1mL,pH 6. 2-6. 5，固体培养基加入琼脂1. 5-2. 0，用前加入5 mL无水乙醇；
GYC培养基(g/100 mL):葡萄糖1，无水乙醇3，酵母粉1，碳酸钙1.5。6、功能微生物的确定对上述获得的纯培养微生物进行酶切酶切分型，将分型结果不同的菌株进行16S rDNA测序，测序结果与DGGE获得的优势微生物进行比较，选择4株优势微生物用于多重PCR技术。7、针对上述4株功能微生物菌株设计特异性引物，其中功能微生物菌株包括一株芽孢杆菌、一株醋酸菌和两株乳酸菌，所述的功能微生物的特异性引物序列为下表所示。
权利要求
1.一种用于醋醅中四种功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于多重PCR技术按照以下步骤进行(O醋醅微生物群落总基因组DNA的提取称正常发酵过程的醋醅2-5g，采用液氮研磨、溶菌酶和蛋白酶酶解、氯仿-异戊醇抽提、乙醇洗涤、RNaseA消化步骤等提取总基因组 DNA ；(2)合成细菌16SrDNA V3区引物Pl，P2，并以醋醅群落微生物总DNA为模板进行PCR 扩增，得到细菌16S rDNA V3区的扩增片段；(3)利用变性凝胶梯度电泳(DGGE)对细菌16SrDNA V3区扩增片段进行分析，其电泳条件为8%聚丙烯酰胺凝胶，100%变性剂浓度为7M尿素、40%甲酰胺，采用30°/Γ50%变性梯度，上样量为200 ng，缓冲液为1XTAE，60°C，200V电压电泳3. 5-4 h，SYBRGreen I染色， 每15 min染色一次,共染3次；(4)优势微生物的序列测定选择DGGE凝胶上10-20个最显著的条带，割胶回收进行序列分析，在NCBI中进行BLAST比对，初步确定优势微生物的种属；(5)功能微生物的筛选以正常发酵的醋醅为筛选对象，采用肉汤、GYC、MRS3种不同的培养基对不同功能微生物进行分离，选择生长较快、菌落形态不同、且GYC平板上有透明圈的60-80个菌落，纯化后保存；(6)功能微生物的确定对上述获得的纯培养微生物进行酶切分型，将分型结果不同的菌株进行16S rDNA测序，测序结果与DGGE获得的优势微生物进行比较，选择4株优势微生物用于多重PCR技术；(7)针对上述4株功能微生物菌株设计特异性引物，其中功能微生物菌株包括一株芽孢杆菌、一株醋酸菌和两株乳酸菌；(8)对4株功能微生物的多重PCR条件进行组合优化包括反应体系的确定，反应条件的优化，最终使得4种微生物在同一 PCR条件下同时被检测出来；(9)利用上述确定的多重PCR条件，对发酵过程中醋醅样品中的功能微生物进行快速检测。
2.根据权利要求1中所述的一种用于醋醅微生物群落中功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于，所述步骤(2)中的引物序列如下所示Pl :5，-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’P2 :5，-[CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G]CC TAC GGG AGG CAG CAG-3，。
3.根据权利要求1中所述的一种用于醋醅微生物群落中功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于，所述步骤(5)中培养基如下所述肉汤培养基(g/100 mL)葡萄糖2. 5，蛋白胨1，牛肉膏1，酵母粉O. 5，氯化钠O. 3，琼脂2. O,pH 7. 0-7. 2，用前加 Λ 5 mL无水乙醇；MRS 培养基(g/100 mL)胰蛋白胨1，牛肉膏1，酵母粉0.5，磷酸氢二钾O. 2，乙酸钠O. 5，柠檬酸三铵0.2， 葡萄糖2，七水硫酸镁O. 058，一水硫酸锰O. 019，吐温80 O. lmL，琼脂1. 5-2. 0，pH,6.2-6. 5，用前加入5 mL无水乙醇；GYC 培养基(g/1OO mL) 葡萄糖1，无水こ醇3，酵母粉1，碳酸钙1. 5，琼脂1. 5-2. O。
4.根据权利要求1中所述的ー种用于醋醅微生物群落中功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于，步骤(7)中所述的特异性引物，其序列是如下表所示。
5.根据权利要求1中所述的ー种用于醋醅微生物群落中功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于，步骤(8)中所述的多重PCR的最优反应体系釆用50 u L体系，具体如下IXEx PCR buffer (含 dNTP) 10 u L ；Mg2+ (25 mM)4 虬；Ex Taq 酶(5 U/u L) 0.5 虬；正向引物 2 UL;反向引物 2 u L template DNAlO ng;ddH20 至 50 U し
6.根据权利要求1中所述的ー种用于醋醅微生物群落中功能微生物检测的多重PCR技术，其特征在于，步骤(8)中所述的多重PCR的最优反应条件如下预变性94°C 5 min ;变性94°C 30s，退火64-51°C 45s，延伸72°C lmin，共26个循环，其中退火温度每个循环降低·0.50C ;变性 94°C 30s，退火 51°C 45s，延伸 72°C lmin，共 15 个循环；终延伸 72°C IOmin0
全文摘要
本发明公开了一种用于检测醋醅中四种功能微生物的多重PCR技术，属于生物工程技术领域。该方法简便、经济、高效，在同一PCR反应管内能对多种微生物同时检测，是研究复杂微生物群落有效的技术手段之一。
文档编号C12Q1/04GK103045725SQ20121042571
公开日2013年4月17日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者许正宏, 史劲松, 陆震鸣, 陶京兰, 钱建瑛 申请人:江南大学