专利名称：一种蛋白激酶抑制激动剂的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白激酶，尤其是涉及一种蛋白激酶抑制激动剂的筛选方法。
背景技术：
蛋白激酶负责体内蛋白的磷酸化，它通过调控可逆的蛋白磷酸化，进而实现对细胞信号转导的调控，在生命系统中发挥着重要的作用。蛋白激酶与一系列的癌症、糖尿病、炎症等重大疾病的发生和发展紧密相关。蛋白激酶抑制激动剂可以作为潜在的抗癌、 抗肿瘤治疗药物，因此对它的研究成为目前国际上的研究热点([I]. Cohen，P.，Protein kinases—the majordrug targets of the twenty-first century Nat Rev Drug Discov 2002，I (4)，309-315. )D
蛋白的磷酸化最早被作为调控糖原代谢的机理进行研究。直到1978年，Ray Erikson发现劳氏肉瘤病毒的转化因子是一种蛋白激酶，随后在1981年，Monique Castagna发现佛波酯是蛋白激酶C的激动剂，研究者逐渐认识到非正常磷酸化与疾病的关联，自此蛋白激酶的抑制剂/激动剂开始成为药物开发的靶点。截至目前，美国FDA已批准上市了 13个小分子蛋白激酶抑制剂药物，I个核酸适配体蛋白激酶抑制剂药物和5个抗 体药物。
蛋白激酶活性的测定方法
蛋白激酶活性测定反应中的三个基本组分为蛋白激酶，蛋白激酶底物(多肽或蛋白)，三磷酸腺苷(ATP)。蛋白激酶活性测定中的核心问题是测定有多少磷酸基团通过蛋白激酶的酶促反应被转移到蛋白激酶底物上([2]. von Ahsen, 0. ; Bomer, U.，High-through put screeningfor kinase inhibitors. Chembiochem 2005，6 (3)，481-490.)。
最早发展的激酶活性测定方法应用激酶向底物蛋白或多肽转移磷酸基团的性质，以Y位放射性标记的ATP (32P，33P)作为激酶反应物。反应终止后，通过一定的分离技术，将蛋白底物与小分子放射性ATP分离，通过测定蛋白底物中放射性核素的引入量来测定抑制剂的抑制活性。([3] (a)Huang, K. P. ; Robinson, J. C. , A rapid and sensitive assay method for proteinkinase. Anal Biochem 1976，72，593-9;(b) de la Houssaye, B. A. ;Masaracchia, R. A. , Standardization of the assay for the catalytic subunit of cyclic AMP—dependentprotein kinase using a synthetic peptide substrate. Anal Biochem 1983, 128(1), 54-59.)此方法由于只标记所有蛋白激酶都使用的底物ATP而且这种同位素标记并不改变ATP的生物化学性质，所以理论上适用于所有蛋白激酶活性的测定，目前仍作为实验室研究的通用方法。但由于所用试剂半衰期短(32P为14. 3天，33P为 25. 4天)，放射性强，操作步骤繁杂，需进行放射性材料的分离和废弃物处理，本方法不适于进行激酶抑制激动剂的高通量筛选。一些在此基础上新近发展的同位素测定技术部分克服了一些缺陷。如闪烁迫近分析法(SPA)通过使用人工合成的底物，在反应结束后，于放射性磷酸基团附近引入一个SPA基团，不需进行分离，将引入底物的磷酸基团的放射性信号通过能量转移，转变成光信号进行测量；或将闪烁剂及底物同时固定于96孔板上，由于只有引入底物的磷酸基团在空间上靠近闪烁剂，而未反应的ATP仍在溶液中，只有引入底物的磷酸基团的放射性信号被转化成光信号。由于所有激酶都使用ATP，放射性计数只能测定总放射性活性，不能区分其是否来自同一底物，所以本方法只能使用纯化的酶和底物进行测定。
另一大类激酶分析方法是通过磷酸化引起底物化学或物理性质的改变进行分析， 分别概述如下
I.应用均相时间分辨突光技术(Homogeneous time-resolved fluorescence, HTRF)进行激酶活性分析。合成的底物被磷酸化后，经稀土元素标记的磷酸化抗体进行识别，再加入识别磷酸化基团邻近位点的另一个荧光受体基团。利用稀土元素荧光光谱的时间分辨性质，受激发的稀土元素荧光供体向邻近的荧光受体进行能量转移， 通过控制荧光信号采集的延迟时间，可实现均相溶液的磷酸化水平检测。本方法受专利保护，针对不同激酶需合成特别的底物多肽，检测过程需使用稀土元素标记的磷酸化抗体如 Invitrogen 开发的LanthaScreen'
2.应用荧光能量转移进行激酶活性的分析。与上述方法类似，底物磷酸化后可结合一个荧光供体基团，或通过磷酸化后底物自身的构象发生改变，使供体基团与受体基团间发生由于距离接近而产生的能量转移，如使用CFP/YFP融合底物蛋白进行细胞内分析的方法，供体基团吸光后发出单线态氧激发受体基团的Alphascreening'*技术等。突光蛋白融合方法，本底荧光强度高，磷酸化后信号弱，更适用于细胞内的激酶 活性分析。 Alphascreeningt技术可用于均相混和物分析，但一次只能进行一个激酶的筛选，且受专利保护，同时也需使用标记的抗体。
3.应用荧光偏振进行激酶活性分析。如IMAP 技术通过磷酸化引起的底物荧光偏振的变化进行测量。由于多数蛋白激酶底物并不含有或只有很弱的荧光，而且磷酸基团的引入并不能显著改变底物的荧光偏振，所以此方法只能使用专利保护的人工合成底物，并用能结合磷酸化基团的纳米颗粒来放大偏振信号。
4.通过磷酸化后底物其他物理化学性质的改变进行分析。如Peptag 技术通过特定荧光多肽磷酸化前后底物电荷的差异通过电泳进行分离和分析。PiOlluOT 技术通过特定荧光多肽磷酸化前后对蛋白水解酶活性的影响进行分析。Lawrence小组发展了一种基于环境敏感荧光团的方法，通过磷酸化后磷酸基团对邻近荧光基团化学环境的改变来检测磷酸化水平。Imperiali小组通过改进上述方法，可实现三个激酶的同时检测。([11] · Shults, M. D. ; Janes, K. A. ; Lauffenburger, D. A. ; Imperiali, B. , A multiplexed homogeneousfluorescence-based assay for protein kinase activity in cell lysates. Nat Methods2005, 2 (4)，277-283)另外，其他通用的分离分析技术，如毛细管电泳，反相色谱等也可用于激酶活性的分析。总的来说，这类方法需要针对特定的一个激酶合成一种特殊的底物或内标，不能建立通用的简便方法，不易进行高通量筛选。
激酶活性还可通过酶促反应中消耗的ATP量或生成的ADP量来测定。激酶反应后，通过耦合荧光素酶反应，将ATP的能量转化成化学发光信号。在一定范围内，化学发光的强度与ATP的含量相关。由于在激酶生化参数的测定中，为保证激酶反应处于线性范围内，所用的ATP量大大过量于消耗的ATP量，使检测灵敏度降低。荧光素的化学发光时间较短，在加入后必须马上进行分析，且只能进行单个激酶的分析。5
另一种通用的方法是酶联免疫吸附法。激酶底物被固定在微孔板上的孔里，经过酶反应后，用特异性识别磷酸化底物的抗体来识别磷酸化产物。检测信号通过荧光基团或辣根过氧化氢酶标记的二级抗体来进行放大和检测。理论上，通过标记不同的荧光基团， 可进行多个激酶的同时检测，但由于抗体的交叉反应，一般仅进行单一激酶活性的测定。 本方法虽可在溶液工作站的辅助下进行一定通量的筛选，但无法克服酶联免疫分析的固有限制，如反应在固液界面进行，底物固定后可能改变其生物化学性质，反应平衡慢，洗板操作耗时长。为克服由于底物被固定到板上引起的反应动力学的改变，一种改进的方法是首先在溶液中进行反应，然后通过特定的抗体将底物固定于板上，再通过特异性的磷酸化抗体进行磷酸化水平的测定。另一种改进的方法是将底物通过化学偶连或抗体吸附固定于微珠上，通过微珠自身的编码信息，在流式细胞仪的辅助下同时读取底物的种类和磷酸化水平。本方法虽然可缩短每个激酶的测定时间，并能进行多个激酶的同时测定，但需要针对每个激酶使用专利保护的特定微珠。同时，所有使用抗体进行的分析技术都存在由于抗体质量不稳定造成的分析结果的不稳定性。
另一类是通过使用Y位特殊功能基团标记的ATP，如 Y -S-ATP, Y-Biotin-ATP, Y - 二茂铁-ATP在磷酸基团转移过程中将特殊功能基团转移到底物上，通过引入的功能基团引起底物性质的改变，进而进行测量。如巯基，或生物素结合纳米金后引起的电位改变，生物素修饰的与亲和素修饰的金纳米颗粒结合后，颜色的改变等。这类方法的一个显而易见的问题是，一个大体积功能基团的引入显著改变了 ATP 的生化性质，进 而对激酶生化参数的测定产生不可忽视的影响。发明内容
本发明的目的在于为了克服现有的蛋白激酶抑制激动剂的筛选方法存在放射性污染，需使用特殊合成的非天然底物或特殊抗体的不便，修饰底物或修饰ATP造成的测定不准确，以及难于进行多个激酶的同时测定等问题，提供基于稳定同位素标记的 Y-[18O4]-ATP和质谱的一种蛋白激酶抑制激动剂的筛选方法。
本发明的另一目的在于提供一种蛋白激酶抑制激动剂的抑制参数的测定方法。
所述蛋白激酶抑制激动剂的筛选方法的具体步骤如下
Dy- [18O4] -ATP 的合成
在氮气保护下，以H218O和PCl5为起始原料，在O 100°C范围内，搅拌O. 5 24h,使其生成H3P18O4,合成的H3P18O4可直接使用，或加入碱转化为氧18同位素标记的磷酸一氢盐，磷酸二氢盐，正磷酸盐或其他形式的磷酸盐,合成的各种形式的磷酸盐也可通过离子交换树脂，或直接由H3P18O4与常见的有机碱反应，转化为氧18同位素标记的有机碱的磷酸盐，二磷酸腺苷(ADP)或其盐形式，在DMSO，DMF等有机溶剂条件下，与I 20当量上述各种氧18同位素标记的磷酸无机盐或有机盐，经缩合剂如羰基二咪唑或二环己基碳二亚胺缩合，在0-150°C条件下反应O. I 24h，得到包含Y-[18O4]-ATP的混合物，包含 Y-[18O4]-ATP的混合物经色谱分离后，得到纯度大于95%的Y -[18OJ-ATP ；
在步骤I)中，所述磷酸盐的阳离子包括碱金属或碱土金属，所述碱金属可选自铵盐，钾，钠，锂，铯，镁等中的一种；所述常见的有机碱可选自吡啶，乙二胺，三乙胺，正丁胺，氨基丁三醇等中的一种；所得的Y-[18OJ-ATP可经离子交换或沉淀法转化为常见的钠6盐，锂盐，镁盐，铵盐等常见无机盐或三乙胺。
2)应用合成的Y -[18OJ-ATP进行激酶抑制激动剂筛选
对特定激酶，按其性质和适宜反应条件配置反应溶液，适宜反应条件包括缓冲液成分，盐离子浓度，蛋白或多肽底物种类和浓度，激酶的浓度及其他必要成分。设置两组除ATP外完全相同的反应，一组使用适于所选激酶活性浓度的Υ-[1604]-ΑΤΡ，另一组使用相同浓度的Y-[18OJ-ATP ;在其中一组中加入候选抑制剂，定义为抑制组，在另一组中加入相同体积的对照溶液(与溶解抑制剂的溶液相同，但不含抑制剂)，定义为对照组；根据不同激酶的性质，抑制组和对照组在相同条件下反应相同时间后，同时终止反应，终止后，抑制组和对照组反应物按固定比例混合，比值为R，混合物经纯化或直接进行质谱分析，在理论产物分子量附近搜索相应的重荷磷酸化产物峰，根据对照组和抑制组所使用的 ATP种类，分别对产物峰进行指认，定义为抑制组产物峰和对照组产物峰，根据所用质谱的种类和定量标准，对两组峰的峰高或峰面积进行积分后求比值，当抑制组产物峰/对照组产物峰比值显著小于R时，候选药物为相应激酶的抑制剂；当抑制组产物峰/对照组产物峰比值显著大于R时，候选药物为相应激酶的激动剂。
在同时进行多个激酶的筛选时，抑制组和对照组中加入多个激酶和激酶的底物， 选择的反应条件保证每个激酶都保持一定的活性。数据分析中，对某一激酶的活性根据其相应的磷酸化底物进行单独分析，其他步骤同上。
所述蛋白激酶抑制激动剂的抑制参数的测定方法的具体步骤如下
抑制组与对照组的设置与上述相同，抑制参数通过抑制剂在不同浓度的下的抑制率通过非线性拟合求得。具体操作中可只设置一个对照组，包含不同浓度抑制剂的抑制组与来自同一对照组的产物进行一定比例的混合，可进一步减小误差。
该方法使用的Y -[18OJ-ATP无放射性，与正常的ATP具有完全相同的生化活性， 无须针对特定的激酶使用特殊合成的多肽或蛋白底物，不需要使用除蛋白激酶反应必须的缓冲液，底物外的其它任何试剂，无需合成的内标。在多个底物多肽在质谱中质量不重合的情况下，可进行多个激酶的同时筛选。重荷磷酸化底物与轻荷磷酸化底物质量差距大(一个磷酸化位点差距6Da)，且对质谱仪要求不高。所用的Y-[18OJ-ATP和磷酸化后的底物不含荧光或放射性基团，性质稳定，可在反应后长期保存，进行多次分析。由于选用的基质辅助激光解析型质谱仪对盐的耐受性较好，多数情况下反应产物可不经纯化，直接进行分析。反应操作中不涉及复杂的分离纯化步骤，所使用的溶液转移，混合等操作可由溶液工作站完成，适于与质谱自动进样器联用后进行自动化的高通量筛选。
图I是合成的Y - [18O4] -ATP的色谱分离图。
图2是应用Y -[18OJ-ATP进行单个激酶抑制剂筛选的原理示意图。
图3是应用Y -[18OJ-ATP针对多个激酶进行抑制剂筛选的原理示意图。
图4是以Kemptide为底物进行蛋白激酶A抑制剂H89进行抑制率(Ki)测定的拟合曲线图。其中H89的化学结构如插图所示，底物的磷酸化产物为LRRApSLG，所有数据点为三次测定的平均值，非线性拟合的抑制率为48± 12nM。
图5是以GST-ATF2为底物进行蛋白激酶p38抑制剂SB203580抑制率(Ki )测定的拟合曲线图.其中SB203580的化学结构如插图所示，水解后的磷酸化产物为NDSVIVADQpTPpTPTR，所有数据点为三次测定的平均值，非线性拟合的抑制率为 O. 444 ± O. 07uM。
图6是以Hela细胞裂解液作为蛋白激酶A来源，Kemptide为底物进行蛋白激酶 A抑制剂H89抑制活性范围筛选，不同抑制剂浓度下的轻核磷酸化Kemptide和重核磷酸化 Kemptide质谱积分面积比较柱状图。
图7是以建立的方法进行蛋白激酶A，蛋白激酶G和蛋白激酶CK2抑制剂同时筛选的抑制率柱状图。
图8是以蛋白激酶A为模型进行小分子化合物库高通量筛选的结果。每一个圆点对应于96孔板中的一个位置，代表一个位置化合物的测定结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明的具体技术方案是
I.通过化学合成和分离，合成与正常ATP结构完全相同，但与Y位磷原子相连接的氧原子被替换成非放射性的18O稳定同位素的Y-[18OJ-ATP, Y-[18O4]-ATP的分子结构式如下
2.在激酶抑制剂/激动剂的活性筛选或抑制/激活参数测定中，设置两个平行的反应，分别命名为对照组和测定组；对照组和测定组中所用的反应条件，缓冲溶液，蛋白或多肽底物浓度，激酶用量完全相同，所不同的是在对照组中使用正常的Y-[16OJ-ATP,在抑制组中使用合成的y-[18o4]-atp并加入所需测定的候选抑制剂；反应完成后，等量混合两组中的反应物，在加入质谱所用的基质后，进行质谱测定，测量的分子质量为正常的轻核16O 同位素磷酸化底物[M]及重核18O同位素磷酸化底物[M+6];若抑制剂无效，两个质谱峰强度及面积在误差范围内一致，若抑制剂有效，重荷18O同位素磷酸化底物[M+6]的峰强度及面积被降低，反之若激动剂有效，18O同位素磷酸化底物[M+6]的峰强度及面积被增强。在实际测定中，抑制组也可使用正常的Y _ [16O4] -ATP，而在对照组中使用Y - [18O4] -ATP。
3.在测定某一物质对多个激酶的抑制或激活效果时，只要激酶的反应能互相兼容，每一个激酶对其相应的底物的磷酸化是特异性的，并且所有的底物质量峰在质谱中不重合，就可将所有激酶及其相应底物混合到一起，就可如上所述，分别设置对照组和抑制组进行测定；如图2和3所示，抑制剂/激动剂对某一激酶的作用效果，可以通过在质谱中观测相应的底物的磷酸化底物峰进行判断。在实施例六中，同时对蛋白激酶A，蛋白激酶G 和蛋白激酶CK2进行测定，并能由此判断某一抑制剂的特异性。测定结果如图7所示，IuM KT5823是蛋白激酶G的特异性抑制剂，IuM H89可同时抑制蛋白激酶A和蛋白激酶G的活H18O-P1eO-P-O-OH8
权利要求
1.一种蛋白激酶抑制激动剂的筛选方法，其特征在于其具体步骤如下1)Y-[18O4]-ATP 的合成 在氮气保护下，以H218O和PCl5为起始原料，在O 100°C范围内，搅拌O. 5 24h，使其生成H3P18O4,合成的H3P18O4可直接使用，或加入碱转化为氧18同位素标记的磷酸一氢盐，磷酸二氢盐，正磷酸盐或其他形式的磷酸盐，合成的各种形式的磷酸盐也可通过离子交换树脂，或直接由H3P18O4与常见的有机碱反应，转化为氧18同位素标记的有机碱的磷酸盐，二磷酸腺苷(ADP)或其盐形式，在DMSO，DMF等有机溶剂条件下，与I 20当量上述各种氧18同位素标记的磷酸无机盐或有机盐，经缩合剂如羰基二咪唑或二环己基碳二亚胺缩合，在0-150°C条件下反应O. I 24h，得到包含Y-[18OJ-ATP的混合物，包含Y-[18O4]-ATP的混合物经色谱分离后，得到纯度大于95%的Y -[18OJ-ATP ； 2)应用合成的Y-[18OJ-ATP进行激酶抑制激动剂筛选 对特定激酶，按其性质和适宜反应条件配置反应溶液，适宜反应条件包括缓冲液成分，盐离子浓度，蛋白或多肽底物种类和浓度，激酶的浓度及其他必要成分。设置两组除ATP外完全相同的反应，一组使用适于所选激酶活性浓度的Y-[16OJ-ATP,另一组使用相同浓度的Y-[18OJ-ATP ;在其中一组中加入候选抑制剂，定义为抑制组，在另一组中加入相同体积的对照溶液(与溶解抑制剂的溶液相同，但不含抑制剂)，定义为对照组；根据不同激酶的性质，抑制组和对照组在相同的条件下反应相同时间后，同时终止反应，终止后，抑制组和对照组反应物按固定比例混合，比值为R，混合物经纯化或直接进行质谱分析，在理论产物分子量附近搜索相应的重荷磷酸化产物峰，根据对照组和抑制组所使用的ATP种类，分别对产物峰进行指认，定义为抑制组产物峰和对照组产物峰，根据所用质谱的种类和定量标准，对两组峰的峰高或峰面积进行积分后求比值，当抑制组产物峰/对照组产物峰比值显著小于R时，候选药物为相应激酶的抑制剂；当抑制组产物峰/对照组产物峰比值显著大于R时，候选药物为相应激酶的激动剂。
2.如权利要求I所述的一种蛋白激酶抑制激动剂的筛选方法，其特征在于在步骤I)中，所述磷酸盐的阳离子包括碱金属或碱土金属。
3.如权利要求2所述的一种蛋白激酶抑制激动剂的筛选方法，其特征在于所述碱金属选自铵盐，钾，钠，锂，铯，镁中的一种。
4.如权利要求I所述的一种蛋白激酶抑制激动剂的筛选方法，其特征在于在步骤I)中，所述常见的有机碱选自吡啶，乙二胺，三乙胺，正丁胺，氨基丁三醇中的一种。
5.如权利要求I所述的一种蛋白激酶抑制激动剂的筛选方法，其特征在于在步骤I)中，所得的Y-[18OJ-ATP经离子交换或沉淀法转化为常见的钠盐，锂盐，镁盐，铵盐常见无机盐或三乙胺。
6.如权利要求I所述的一种蛋白激酶抑制激动剂的筛选方法，其特征在于在步骤I)中，在同时进行多个激酶的筛选时，抑制组和对照组中加入多个激酶和激酶的底物，选择的反应条件保证每个激酶都保持一定的活性；数据分析中，对某一激酶的活性根据其相应的磷酸化底物进行单独分析，其他步骤同上。
7.蛋白激酶抑制激动剂的抑制参数的测定方法，其特征在于其具体步骤如下 抑制组与对照组的设置与上述相同，抑制参数通过抑制剂在不同浓度的下的抑制率通过非线性拟合求得。具体操作中可只设置一个对照组，包含不同浓度抑制剂的抑制组与来自同一对照组的产物进行一定比例的混合，可进一步减小误差。
全文摘要
一种蛋白激酶抑制激动剂的筛选方法，涉及一种蛋白激酶。为了克服现有的蛋白激酶抑制激动剂的筛选方法存在放射性污染，需使用特殊合成的非天然底物或特殊抗体的不便，修饰底物或修饰ATP造成的测定不准确，以及难于进行多个激酶的同时测定等问题，提供基于稳定同位素标记的γ-[18O4]-ATP和质谱的一种蛋白激酶抑制激动剂的筛选方法以及提供一种蛋白激酶抑制激动剂的抑制参数的测定方法。所述蛋白激酶抑制激动剂的筛选方法的具体步骤如下先合成γ-[18O4]-ATP，再应用合成的γ-[18O4]-ATP进行激酶抑制激动剂筛选。
文档编号C12Q1/48GK102925538SQ20121041700
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者赵玉芬, 付川 申请人:厦门大学