天冬氨酸激酶iii突变体及其宿主细胞和应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明提供一种天冬氨酸激酶，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于SEQ?ID?NO:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸残基为非天冬氨酸。本发明的天冬氨酸激酶能高效解除L-赖氨酸的反馈抑制，并且能有效用于生产L-赖氨酸。本发明还提供包含编码所述天冬氨酸激酶的基因的宿主细胞以及利用所述宿主细胞或天冬氨酸激酶产生L-赖氨酸的方法。本发明的天冬氨酸激酶或包含本发明天冬氨酸激酶的宿主细胞还用于产生L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸或L-缬氨酸。本发明还提供利用所述天冬氨酸激酶或宿主细胞产生L-天冬氨酰-4-基磷酸的方法。
【专利说明】天冬氨酸激酶111突变体及其宿主细胞和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】。具体地说，本发明涉及天冬氨酸激酶III (简称AKIII，又称LysC)的突变体及其应用。
【背景技术】
[0002]L-赖氨酸是人类和动物营养中最重要的必需氨基酸，在食品工业、养殖业和饲料工业中有着十分重要的地位。近年来，其市场需求稳步增加，世界市场销售量已经突破百万吨规模。目前，赖氨酸主要采用微生物发酵法来生产。
[0003]在许多微生物中L-赖氨酸的合成途径是以天冬氨酸为前体的，包括两步和甲硫氨酸和苏氨酸等氨基酸共用的步骤。在大肠杆菌中，L-赖氨酸生物合成途径经过九步的酶催化过程(如下式所示)。其中，天冬氨酸激酶催化赖氨酸生物合成的第一步反应，是赖氨酸生产的限速步骤，它的活力决定着代谢流流向L-赖氨酸合成途径的比例。在大肠杆菌中有三个天冬氨酸激酶，分别命名为天冬氨酸激酶I (AK I，由thrA基因编码)、天冬氨酸激酶IKAK II，由metL基因编码)、天冬氨酸激酶III (AK III，由IysC基因编码，其编码基因的核苷酸序列如SEQ IDN0:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示)。AK I和AK II是双功能酶，都还具有高丝氨酸脱氢酶活性。AK I在酶活性水平受到苏氨酸和赖氨酸的反馈抑制，AK III在酶活性水平受终产物赖氨酸的反馈抑制(Bearer CF, Neet KE ；Stadtman, E.R., Cohen, G.N., LeBras, G., Robichon-Szulmajster, H.(1961)."Feed-back Inhibitionand Repression of Aspartokinase Activity in Escherichia coli and Saccharomycescerevisiae.〃J.Biol.Chem.)。AK II在酶活水平不受天冬氨酸家族氨基酸的反馈抑制但是受到转录水平严谨调控(X D`ong, PJ Quinn, X Wang.(2011).“Metabolic engineeringof Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for the production ofL-threonine.，’Biotechnology advances)D
[0004]
【权利要求】
1.一种天冬氨酸激酶，其特征在于，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于SEQ IDN0:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸残基为非天冬氨酸。
2.编码权利要求1所述天冬氨酸激酶的基因。
3.包含权利要求2所述编码基因的载体。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求2所述编码基因。
5.权利要求4所述宿主细胞在生产L-氨基酸中的应用。
6.一种制备L-氨基酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: a.培养权利要求4所述的宿主细胞，使之产生L-氨基酸；和 b.从培养液中分离L-氨基酸。
7.权利要求1所述天冬氨酸激酶在生产L-氨基酸中的应用。
8.如权利要求5-7所述的应用或方法，其特征在于，所述的L-氨基酸为L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸或L-缬氨酸。
9.一种制备L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸或L-缬氨酸方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: a.利用权利要求1所述的天冬氨酸激酶(EC2.7.2.4)，催化从L-天冬氨酸生成L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸或L-缬氨酸过程中的以下反应，进而获得L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸或L-缬氨酸，
10.制备权利要求1所述天冬氨酸激酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: a.改造SEQID N0:2所示氨基酸序列的编码序列，使得编码的氨基酸序列中对应于SEQID N0:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸残基突变为非天冬氨酸； b.将a得到的编码序列直接转染合适的宿主细胞或经载体引入合适的宿主细胞； c.培养b得到的宿主细胞； d.从步骤c得到的培养体系中分离所述宿主细胞产生的天冬氨酸激酶；和 e.测定所述天冬氨酸激酶解除赖氨酸反馈抑制的能力。
11.改造野生型天冬氨酸激酶使之解除赖氨酸反馈抑制的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: a.将野生型天冬氨酸激酶的氨基酸序列与SEQID N0:2所示氨基酸序列作比对；和 b.改造所述野生型天冬氨酸激酶的编码序列，使得编码的氨基酸序列中对应于SEQIDN0:2所示氨基酸序列的第340位的氨基酸残基突变为非天冬氨酸； c.将b得到的编码序列直接转染合适的宿主细胞或经载体引入合适的宿主细胞； d.培养c得到的宿主细胞； e.从步骤d得到的培养体系中分离所述宿主细胞产生的天冬氨酸激酶；和 f.测定所述天冬氨酸激酶解除赖氨酸反馈抑制的能力。
【文档编号】C12N15/54GK103773745SQ201210398902
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月18日 优先权日:2012年10月18日
【发明者】岳国君, 孙际宾, 郑平, 刘娇, 李庆刚, 夏令和, 周永生, 罗虎, 周勇, 满云, 卢宗梅, 马延和 申请人:中粮生物化学（安徽）股份有限公司, 天津工业生物技术研究所