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【专利摘要】蚯蚓生物复合酵素，取一定量的活蚯蚓，用超声波清洗机清洗，尽最大可能使其内脏中的污物排出，然后捞出滤去多余水分，称重。取900公斤蚯蚓加入生物反应器，然后加入酵素菌50公斤，生物助剂50公斤，搅拌均匀，好氧发酵48小时，将滤出液进行超滤，浓缩有效成份，进入真空冷冻干燥机，在升华温度不高于30℃条件下，干燥约4-10小时即成干粉，粉碎后铝塑膜密封包装，置于冰箱中保存。
【专利说明】蚯蚓生物复合酵素
【技术领域】:
[0001]本发明属于食品及生物制药领域。
技术背景: [0002]现代医学研究证明蚯蚓有清热、镇定、抗惊厥、平喘、抗组胺、降血压、溶栓、抗癌的功效。蚯蚓蛋白质含量很高，约占鲜蚯蚓的8 %~10 %，干重的56 %~66 %，氨基酸以谷氨酸、赖氨酸、精氨酸的含量居多。蚯蚓冻干粉和体腔内液脂肪酸含量分析表明，不饱和脂肪酸含量高，饱和脂肪酸含量低。特别是具有抗癌、降血压、防止动脉硬化、养颜等作用的亚油酸含量更高，而十三羧酸明显不同于别的动物，这些符合当前人类健康食品结构的要求。
[0003]蚯蚓富含核酸、VA、Vc, VE等功能因子，Fe、Mn、Cu、Zn、Se等微量元素丰富，它们与其他中药材中有机物络合发挥更大药理功效，其中Se还能促进细胞免疫作用。此外，蚯蚓尚含虫丘蝴素(Iumbritn)、虫丘蝴碱(Iumbrofobrim)、虫丘蝴毒素(terrestrolumbrolysin)以及嘌呤、胆碱、胆甾醇等主要特殊活性物质。然而，目前研究得最多的是蚯蚓的几种酶(系)。
[0004]一、蚯蚓酶系及生理功能
[0005]1、纤溶酶(fibrinolytic enzyme)
[0006]蚯蚓作为活血化淤的药材已有几千年历史。新鲜蚯蚓体内含的纤溶酶即属于其中一组具强烈溶解纤维蛋白及血栓作用的丝氨酸蛋白酶，可从不同种属的蚯蚓分离得到。
[0007]2、蝴激酶(Iumbrinonase)
[0008]蚓激酶是从蚯蚓中提取的一种丝氨酸蛋白酶，具有典型的胰凝乳蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的多肽链折叠形式，与纤维蛋白原有特异的亲和力，且具有纤溶活力。蚓激酶能明显降解纤维蛋白原，降低血小板聚集率及血液粘度。现已有很多研究证明蚓激酶在体外具有强的纤溶活性，从而使其可能成为一种很有应用前景的溶栓制剂。
[0009]3、抗肿瘤蛋白
[0010]谢江碧等以赤子爱胜蚓为原料，分离得到一组抗肿瘤活性蛋白成分(简称蚯蚓抽提物)。祖殉等选取赤子爱胜蚓为原料，研究了通过各种方法分离出的样品对于肿瘤细胞的抑制作用。结果表明分离纯化后某一蛋白组分可有效抑制BEL-7402细胞(人原发性肝癌细胞系)、HeLa细胞(人宫颈癌细胞系)的生长。
[0011]4、溶血素
[0012]从蚯蚓体腔液中可以分离到具有溶血活性的蛋白质，其中个别蛋白质为双功能蛋白质，具有溶解和凝集红细胞的活性。
[0013]5、消化酶
[0014]蚯蚓在有机残体转化和土壤养分循环中起着重要的作用，为明确不同生态类型蚯蚓的食性及其消化有机物质的能力，张宝贵等测定了表居型蚯蚓赤爱胜蚓(Eiseniafetida)和上食下居型虫丘蝴威廉环毛蝴(Pheretima guillemi)肠道内纤维素酶、蛋白酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性；同时还对威廉环毛蚓排泄物中蛋白酶、磷酸酶以及C02呼吸强度与原土进行了比较，结果表明，赤爱胜蚓肠道内纤维素酶活性远远高于威廉环毛蚓，而蛋白酶和酸性及碱性磷酸酶活性显著低于威廉环毛蚓；两种蚯蚓肠道消化酶活化的差异与赤爱胜蚓直接以植物残体为食，而威廉环毛蚓以半分解的有机残体上的微生物为食有关。而且得出不同种类的蚯蚓生活习性不同，食性不同，体内成分也存在差异。
[0015]6、抗菌肽
[0016]张希春等采用硫酸铵沉淀，超滤，阳离子交换分离和反相快速蛋白质液相色谱(FPLC)分析，得到了两种新的蚯蚓抗菌肽F-1与F-2，经电喷雾离子源质谱(ES1-MS)测定，其相对分子质量为535.27和519.27，串联质谱(MS/MS)数据表明F-1的肽序列为 190Ac-Ala-Met-Val-Ser-Se;r, F-2 的妝序为 Ac-Ala-Met-Val-Gly-Thr,最小抑菌浓度(MIC)实验表明，F-1与F-2对鹁鸡肠球菌Ginterococcus gallinarum)、绿脓杆菌(Pseudomonas pyocyanea)、鲍氏不动杆(Acinetobacterbaumanii)、土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)的最小抑菌浓度分别为11.4mg/L和12.85mg/L,对幾肠球菌(Enterococcus faecalis)的最小抑菌浓度分别为22.8mg/L和25.68mg/L,对真菌白色链株菌(Candidaalbicans)没有表现为完全的抑制作用。
[0017]7、钙结合蛋白
[0018]张燕红等以赤子爱胜蚓为材料，通过DEAE-FastFlow离子交换层析、CaM-Sepharose亲和层析,分离纯化得到Φ丘蝴钙调素结合蛋白(CaMBPs)。王采疗等以赤子爱胜蚓为材料分离纯化了钙调素，并得到一种新的钙结合蛋白。王立波等应用红外光谱技术定量测定了水化膜中蚯蚓新钙结合蛋白(NCBP)的二级结构及在不同比例Ca2+、Tb3+离子的作用下其二级结构的变化。结果表明，NCBP中a-helix含量较低而β-sheet的含量较高，且随不同比例全局离子的加入，1629cm_l处β-sheet峰的变化较明显。同时发现，NCBP具有钙结合蛋白家族特征的SDS-PAGE现象，但不具有激活PDE靶酶的活性，初步认为，NCBP含有与Ca2+浓度相关的特殊的结构和功能。另外，高浓度下Tb3+的结合引发NCBP的分子间聚合。提示对稀土元素的使用要慎重。
`[0019]8、过氧化氢酶
[0020]徐炜虹等以赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)组织匀浆经硫酸胺盐析、透析浓缩后，用大柱制备和电泳纯化得到两个过氧化氢酶，均为糖蛋白，分子量分别为39kD和40kD，KCN及Cu2+、Cd2+、Zn2+、Ni2+等金属离子均抑制酶的活性，Pb2+、Fe2+则有激活作用。在直隶环毛虫引(Pheretima tschiliensis)体内实验中，Zn2+显著提高过氧化氢酶的总活力，Cd2+、Ν?2+先是降低，随后提高酶总活力。
[0021]9、胆碱酯酶
[0022]丁诗华等对赤子爱胜蚓的TritonX-1OO抽提液经PEG2000-磷酸钾缓冲液处理、离子交换层析及凝胶过滤后，获得电泳纯的胆碱酯酶，该酶经鉴定为糖蛋白，凝胶过滤法和SDS-PAGE法测得其Mt分别为59000和58000，酸性氨基酸含量约占24%，碱性氨基酸含量约占12%，最大紫外吸收λ = 272nm;酶作用最适温度T = 39°C，热稳定性较差；最适pH为7.8，在pH7.0-8.0酶较稳定，对碘化硫乙酰胆碱的Ka值为88 μ mol/L,有过量底物抑制现象.Mg2+、Ca2+和Mn2+对酶活性的影响较小。DEP则对该酶有强烈抑制作用。
[0023]10、蚯蚓素
[0024]陈可夫等通过实验表明，蚯蚓素9203对小鼠无镇痛、镇静作用；对大鼠原位肠无抑制作用，对大鼠心电、血压、呼吸频率和呼吸深度均无明显影响。个别大鼠出现异常情况，可能与蚯蚓素9203不纯有关；对豚鼠离体回肠有一定抑制作用，以后在临床应用中有可能产生便秘的副作用，提醒临床医生给予密切关注。总的看来，蚯蚓素9203作为溶栓新药很有研究如景。
[0025]二、蚯蚓酶目前常用的提取工艺
[0026]1、过去常用的提取工艺
[0027]通常蚯蚓酶的提取方法是盐析，继而用多种层析及HPLC、FPLC乃至亲和层析、或离子交换、分子筛、凝胶电泳等手段从不同品系的蚯蚓中获得多种蚯蚓酶的单纯组分，但操作麻烦，流程长，且酶活力损失很大，又不适合工业化生产。
[0028]2、近期新的提取工艺
[0029]新提取方法一:
[0030]提取工艺描述:取一定量的活蚯蚓，水洗数次，尽最大可能使其内脏中的污物排出，然后捞出用滤纸尽量吸其多余水分，称重，加2倍体积的缓冲液于匀浆器中匀浆5分钟，在4°C冰箱中静置4小时后，高速离心，弃去沉淀，取上清液加固体硫酸铵达一定饱和度，以4000r/min,离心IOmin,收集上清液再加入固体硫酸铵达较高的饱和度,静置过夜,高速离心，收集沉淀，然后用缓冲液溶解此沉淀物，用透析袋透析去盐或用超滤方法浓缩后，用冷冻干燥机冻干。此时为淡棕色粉末状物质，是酶的粗制品。
[0031]新提取万法二:
[0032]提取工艺描述:选用纯正赤子爱胜(大平二号)成蚓，筛除漂洗各种杂质，并浙干污水。洗净的蚯蚓加入一定浓度盐水，在组织匀浆器中高速匀浆5分钟后，低温静置盐析沉淀，经盐析后高速离心，收集上清液。沉淀用盐溶液洗涤两次，再离心，收集上清液，合并上清液，进行第一次超滤，以滤除不溶于水的大分子。将滤出液再次超滤，浓缩有效成份。当浓缩液达5% -10%浓度后，进入真空冷冻干燥机，在升华温度不高于30°C条件下，干燥约5-20小时即成干粉，粉碎后铝塑膜密封包装，置于冰箱中保存。
【发明内容】
:
[0033]蚯蚓生物复合酵素是利用生物技术提取的蚯蚓全部酵素。
[0034]一.主要设备:
[0035]超声波清洗机，蚯蚓生物反应器，超滤设备，真空冷冻干燥机
[0036]二，工艺流程
[0037]酵素菌+助剂
[0038]活蚯蚓超声波清洗机清洗蚯蚓生物反应器滤出液超滤设备真空冷冻干燥机粉碎包装
[0039]三，生产描述:
[0040]取一定量的活蚯蚓，用超声波清洗机清洗，尽最大可能使其内脏中的污物排出，然后捞出滤去多余水分，称重。取900公斤蚯蚓加入生物反应器，然后加入酵素菌50公斤，生物助剂50公斤，搅拌均匀，好氧发酵48小时，将滤出液进行超滤，浓缩有效成份。进入真空冷冻干燥机，在升华温度不高于30°C条件下，干燥约4-10小时即成干粉，粉碎后铝塑膜密封包装，置于冰箱中保存。
[0041]四，产品及工艺特点[0042]1，使用酵素菌生物技术，加速蚯蚓溶解，酵素产量大幅提升。
[0043]2，工艺设备简单。
[0044]3，不使用硫酸铵，盐等化学助剂
[0045]4，除清洗外， 不用水，使浓缩干燥更容易。
【权利要求】
1.蚯蚓生物复合酵素是利用生物技术提取的蚯蚓全部酵素。 取900公斤蚯蚓加入生物反应器，然后加入酵素菌50公斤，生物助剂50公斤，搅拌均匀，好氧发酵48小时。
【文档编号】C12N9/00GK103740657SQ201210393076
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2012年10月17日 优先权日:2012年10月17日
【发明者】李大治 申请人:沈阳尊龙生物技术有限公司