专利名称：一种肌肉特异表达猪igf1基因的过表达载体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种安全型骨骼肌特异表达猪类胰岛素生长因子I (insulin-like growth factorl, IGF1)基因的过表达载体。
背景技术：
在研究基因功能及转基因动物生产过程中，人们常常借助真核表达载体来实现， 例如pcDNA3. O系列载体。传统方法往往通过分子生物学手段将目的基因片段连接到病毒启动子(如CMV启动子)或异源性强启动子下游，以指导外源基因表达。该方法在基因表达及功能的研究中有着极其广泛的应用，但诸多研究暴露了该手段不足的一面异源性基因序列导入宿主常引起基因组序列的紊乱，内源性基因表达异常，甚至改变宿主固有的特征表型；也常常引起人们对转基因伦理问题的争论。此外，病毒启动子序列或指导质粒DNA复制等原核拢余序列的引入，易引起转基因安全问题，须经长期的生物安全评价才能投入实际应用，既费时又耗费财力。同时，普遍性过表达外源基因常引起机体生长等的异常。因此，在利用转基因技术进行动物遗传改造时，同一物种的内源基因序列，以及组织表达的特异性是保证转基因动物安全性的基础。发明内容
本发明提供了一种猪内源性骨骼肌特异sk-α -actin启动子驱动的表达框架，以及含有该表达框架的猪骨骼肌特异过表达猪IGFl基因安全型表达载体。
本发明所述的猪内源性骨骼肌特异sk- a -actin启动子驱动IGFl基因的表达盒， 是由依次串联的 sk_ a-actin 启动子(sk_ a-actin Promoter)、猪 IGFl (Cl :Ea)基因、 sk- a -actin 3，UTR和SV40增强子组成；该表达盒序列如SEQ ID No. I所示。
本发明所述骨骼肌特异过表达猪IGFl基因安全型表达载体，含有上述的猪内源性骨骼肌特异sk- a -actin启动子驱动表达盒，是通过EcoRV酶切位点克隆到转座子载体 PT2-HB中而获得；该表达载体的序列如SEQ ID No. 2所示。
本发明中所述猪内源性骨骼肌特异sk-a-actin启动子驱动IGFl基因的表达盒是由依次串联的sk-α-actin启动子、猪IGFl (Cl :Ea)基因、sk-a-actin 3’UTR和 SV40增强子组成；所述猪内源sk-a -actin启动子为克隆测序的2602个核苷酸序列；所述 sk- a -actin 3’UTR为克隆测序的751个核苷酸序列；所述猪IGFl (Cl :Ea)基因CDS全长为393个核苷酸序列，具有GENBANK号为匪214256. I的自5'端第13 — 405位核苷酸序列；所述SV40增强子为242个核苷酸序列，从pGL3-C0ntr0l载体自+1第2201-2442位核苷酸序列克隆获得。
所述表达载体安全性体现在载体表达调控元件及目的基因均克隆自猪内源序列， 以及转座子载体序列为脊椎动物所特有，表达载体的核苷酸序列见序列表。
本发明中的骨骼肌特异过表达猪IGFl (Cl Ea)基因的安全型表达载体，在细胞水平上验证了骨骼肌特异sk-α -actin启动子在成肌细胞中能高效表达，在具有成肌分化潜能的PEF细胞中仅低水平表达而在其他类型细胞中不表达；本发明中构建的载体制备转基因小鼠，通过定量PCR和Western Blot检测出转基因小鼠骨骼肌中IGFl基因的mRNA和蛋白表达水平分别为野生型小鼠的15倍和3. 5倍，并且仅在骨骼肌中高效表达，为制备安全、 骨骼肌特异表达目的基因的转基因猪模型提供了平台。
图I :PCR 扩增 sk-α-actin Promoter 产物电泳图2 PCR 扩增 sk- a -actin 3，UTR 产物电泳图3 :PCR扩增猪IGFl (Cl :Ea) cDNA产物电泳图4 PCR扩增SV40Enhancer产物电泳图5 :表达载体元件连接示意图6 pT2/ a -actin-IGFl质粒酶切产物电泳图7 pT2/ a -actin-IGFl 质粒图谱；
图8 pT2/ a -actin- Δ IGF1骨架驱动报告基因GFP在各组细胞中表达；
图9 pIGFl转基因鼠PCR检测外源基因；
图10 pIGFl转基因鼠SOUTHERN BLOT检测外源基因；
图11 :荧光定量检测IGFl基因在转基因小鼠组织器官中的表达；
图12 =Western Blot检测IGFl基因在转基因小鼠组织器官中的表达；
图13 =Western Blot检测IGFl基因在转基因小鼠骨骼肌中的表达。
具体实施方式
下述实施例中提到的实验方法，如无特别说明均为常规方法。
实施例I、骨骼肌特异表达猪IGFl载体的构建
I、特异表达载体基本构件的获得
(I)猪 sk- a -actin Promoter 特异片段的制备
以长白猪基因组DNA为模板,按表I中列举的扩增sk-α-actin Promoter的引物扩增骨骼肌特异sk-α-actin启动子片段。反应体系为50 μ 1，5 μ L 10XBuffer、4 μ L2.5mM dNTP> IuL 20 μ M 引物 sk-a-actin Promoter F> I μ L 20 μ M 引物 sk-a-actin Promoter R (引物序列见表1)、0· 5 μ L5 U/μ L高保真LA Tag聚合酶，2 μ I长白猪基因组 DNA模板，加超纯水至50 μ L(高保真酶购自TaKaRa Code =DRO(^A)t5PCR扩增程序95°C 10s， 60°C 3min，循环35次。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测(如图I所示)。
PCR产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操作步骤见试剂盒说明)，将纯化产物连入PCR克隆载体pMD19-T VectorCTaKaRa Code D102A),按要求步骤操作转化DH5 α 感受态大肠杆菌(购自北京全式金公司，货号CD201)；菌液涂琼脂糖凝胶板，于37°C培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养基中培养,部分菌液送公司测序(invitrogen北京分公司)。测序结果表明含有sk-a-actin Promoter的重组载体,提取质粒备用。
(2)猪sk-a-actin 3’ UTR特异片段的制备
以长白猪基因组DNA为模板，按表I中列举的扩增sk-a -actin 3’ UTR的引物扩增骨骼肌特异 sk-a-actin 3’UTR片段。反应体系为 50 μ 1，5 μ L 10XBuffer、8 μ L 2. 5mMdNTPU μ L 20 μ M 弓I物 sk-α -actin 3，UTR FU μ L 20 μ M 弓I物 sk-α -actin 3，UTR R(序列见表I)、O. 5 μ L5U/ μ L高保真LA Tag聚合酶，2 μ I长白猪基因组DNA模板，加超纯水至 50 μ L (高保真酶购自 TaKaRaCode :DR002A)。PCR 扩增程序95°C 10s, 60 °C lmin，循环 35 次。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测(如图2所示)。
PCR产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操作步骤见试剂盒说明)，将纯化产物连入PCR克隆载体pMD19-T VectorCTaKaRa Code D102A),按要求步骤操作转化DH5 α 感受态大肠杆菌(购自北京全式金公司，货号CD201);菌液涂琼脂糖凝胶板，于37°C培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养基中培养,部分菌液送公司测序(invitrogen北京分公司)。测序结果表明含有sk-a-actin 3’ UTR的重组载体，提取质粒备用。
(3)猪 IGFl (Cl Ea) cDNA 的克隆
以长白猪肝脏组织cDNA为模板，按表I中列举的扩增IGFl (Cl Ea)的引物扩增I 类Ea特异剪接体形式的IGFl⑶S片段(GENBANK登录号为匪214256. I的自5'端第13 — 405位核苷酸序列)。反应体系为50 μ 1，5 μ L 10XBuffer、4y L 2. 5mM dNTPU μ L 20 μ M引物 IGFl (Cl :Ea)F、l μ L 20 μ M 引物 IGFl (Cl :Ea)R(引物序列见表 1)、0· 5 μ L5U/ μ L 高保真 LA Tag聚合酶，2 μ I长白猪肝脏组织cDNA模板，加超纯水至50 μ L (高保真酶购自TaKaRa Code DR002A)o PCR 扩增程序95°C 10s，60。。lmin，循环 35 次。PCR 扩增产物用 I. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测(如图3所示)。
PCR产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操作步骤见试剂盒说明)，将纯化产物连入PCR克隆载体pMD19-T VectorCTaKaRa Code D102A),按要求步骤操作转化DH5 α 感受态大肠杆菌(购自北京全式金公司，货号CD201);菌液涂琼脂糖凝胶板，于37°C培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养基中培养,部分菌液送公司测序(invitrogen北京分公司)。测序结果表明含有IGFl (Cl Ea)的重组载体，提取质粒备用。
(4) SV40Enhancer特异片段的制备
以pGL3_control 载体(Promega Code E1741)为模板，按表 I 中列举的扩增 SV40 Enhancer的引物扩增特异的真核表达增强子片段(pGL3_control载体自+1第2201 — 2442 位核苷酸序列)。反应体系为50μ 1，5μ L 10XBuffer、4y L 2. 5mM dNTPU μ L 20μΜ弓丨物 SV40 EnhancerFU μ L 20μΜ 引物 SV40 Enhancer R (引物序列见表 I )、0· 5 μ L5 U/μ L 高保真LA Tag聚合酶,20ng pGL3-control载体为模板,加超纯水至50 μ L (高保真酶购自 TaKaRa Code :DR002A)。PCR 扩增程序95°C 10s，60。。30s，循环 35 次。PCR 扩增产物用I.5%琼脂糖凝胶电泳检测(如图4所示)。
PCR产物用QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操作步骤见试剂盒说明)，将纯化产物连入PCR克隆载体pMD19-T VectorCTaKaRa Code D102A),按要求步骤操作转化DH5 α 感受态大肠杆菌(购自北京全式金公司，货号CD201);菌液涂琼脂糖凝胶板，于37°C培养箱中培养过夜；挑单菌落接种于液体LB培养基中培养,部分菌液送公司测序(invitrogen北京分公司)。测序结果表明含有SV40EnhanCer的重组载体，提取质粒备用。
2、pT2/ a -actin-IGFl特异表达载体的构建
(I)非转座子表达载体pA-actin-IGFl的构建
以pGL3_control vector (Promega Code :E1741)为骨架载体，用 KpnI/MluI 双酶切将sk- a -actin Promoter从克隆T载体上切下,连入骨架载体KpnI/MluI酶切位点处,构建成 pGL3_l 中间载体；再用 Ncol/Hpal 双酶切将 sk-a-actin 3’UTR/SV40 enhancer 片段从克隆T载体上切下，连接入中间载体pGL3-l的Ncol/Hpal酶切位点处，构建成pGL3_2 中间载体；然后用EcoRI/NcoI双酶切将IGFl从克隆T载体切下，连入中间载体pGL3_2的 EcoRI/NcoI酶切位点处,构建成pA-actin-IGFl表达载体。(连接酶购自Promega Code M1804)
(2) pT2/ a -actin-IGFl 表达载体的构建
用内切酶EcoRV 将包含 sk-α-actin Promoter/IGFl (Cl :Ea) / sk- a -actin 3’ UTR/SV40 enhancer串联组成的的表达盒(图5)(命名为a -actin-IGFl)从 pA-actin-IGFl表达载体上切出，用
QIAGEN琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化(操作步骤见公司试剂盒)；a -actin-IGFl表达盒的序列如SEQ ID No. I所示，
同时用EcoRV酶切两侧含正反向转座元件的转座子载体pT2-HB (由Hackett 教授(Unibersity of Minnesota, USA)惠赠，Zongbin Cui, Aron Μ· Geurts, Geyi Liu, Christopher D. Kaufman,Perry B. Hackett. StructureFunction Analysis of the Inverted Terminal Repeats of theSleeping Beauty Transposon. Journal of Molecular Biology, 318 (5) : 1221-1235.该载体在 Hackett 教授的实验室网站 http:// www. cbs. umn. edu/labs/perry/plasmids/plasmid. html 有详细的图谱及序列信息)，将 a -actin-IGFl表达盒(含有IGFl (Cl =Ea))的纯化产物与酶切后的载体pT2_HB连接构建成pT2/ a -actin-IGFl表达载体。pT2/ a -actin-IGFl质粒酶切鉴定结果如图6所示，pT2/ a -actin-IGFl质粒图谱如图7所示。
表I :本发明中用于扩增载体构件的引物
权利要求
1.一种猪内源性骨骼肌特异sk-α -actin启动子驱动IGFl基因的表达盒，是由依次串联的sk-a -actin启动子、猪IGFl基因、sk_ a -actin 3，UTR和SV40增强子组成；其序列如SEQ ID No. I所示。
2.ー种骨骼肌特异过表达猪IGFl基因安全型表达载体，其特征在于含有权利要求I所述的猪内源性骨骼肌特异sk- a -actin启动子驱动表达盒；该表达载体的序列如SEQ IDNo. 2所示。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于是将权利要求I所述猪内源性骨骼肌特异sk- a -actin启动子驱动表达盒通过EcoRV酶切位点克隆到转座子载体pT2_HB中而获得。
全文摘要
本发明为一种猪骨骼肌中特异过表达猪内源IGF1(C1Ea)基因的安全型表达载体。该载体包含猪内源性序列sk-α-actinPromoter/IGF1(C1:Ea)/sk-α-actin3’UTR/SV40增强子串联组成的表达盒。本发明的表达载体在细胞水平上验证了骨骼肌特异sk-α-actin启动子在成肌细胞中能高效表达，在具有成肌分化潜能的PEF细胞中仅低水平表达而在其他类型细胞中不表达。本发明中构建的载体制备转基因小鼠，通过定量PCR和WesternBlot检测出转基因小鼠骨骼肌中IGF1基因的mRNA和蛋白表达水平分别为野生型小鼠的15倍和3.5倍，并且仅在骨骼肌中高效表达。
文档编号C12N15/11GK102978202SQ201210383179
公开日2013年3月20日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者李奎, 宋成义, 吴晗, 鞠辉明, 白立景 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 扬州大学