专利名称：一种新型人胎盘屏障体外模型的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种新型人胎盘屏障体外模型。
背景技术：
目前胎盘屏障体外模型有胎盘灌流模型和滋养层细胞模型两类。胎盘灌流模型是对完整胎盘小叶中的胎儿动静脉进行插管，以建立胎儿循环，可用于外源及内源性物质的胎盘转运机制研究，为胎盘代谢、内源性物质在母儿间的循环，以及致畸作用的风险评估提供了最直接的证据。但该技术的局限性在于，妊娠早、中期脐血管狭窄，插管困难，无法通过该模型对药物的胎盘透过性进行准确评价，胎盘制备和灌流过程中操作复杂，易损伤组织，影响结果的准确性。胎盘滋养层细胞培养模型的原代培养和滋养层细胞系(BeWo，、Jar和JEG-3)具备胎盘的激素合成和一定的胎盘滋养层细胞形态学特点，可接种于体外通透性支持物上，如Transwell等，但该模型不能摸拟人胎盘屏障结构在孕期呈现的动态变化过程，通常用细胞模型得到的实验结果往往需要用胎盘灌流方法进一步证实。
发明内容
为了克服上述方法的缺陷，本发明人通过大量实验后，以胎盘组织培养技术和Ussing扩散池方法为基础，建立了一种新型人胎盘屏障体外模型。与胎盘灌流模型相比，本模型操作简便，可对各孕期胎盘组织取材研究；与胎盘滋养层细胞培养模型相比，本模型的转运体的表达在整个研究过程不易改变，极性和细胞间的连接与体内更加相似，克服了胎盘滋养层细胞培养模型的细胞培养周期长的缺陷。本发明的目的是提供一种新型的人胎盘屏障体外模型。本发明人胎盘屏障体外模型通过以下方法建立，包括步骤I.制备胎盘组织薄片I)收集胎盘选择25-30岁，孕36-40周足月分娩的健康产妇胎盘，胎盘娩出后，在无菌条件下，用冰冷的含肝素的生理盐水充分冲洗胎盘，之后浸于冰冷的含肝素的KRBB中备用。2)用冰冷的含肝素的生理盐水充分冲洗胎盘，之后浸于冰冷的含肝素的KRBB中备用。3)切取胎盘组织块在胎盘终末绒毛部位，取2块组织块，用KRBB漂洗。4)玻璃化冷冻法冷冻胎盘组织在室温下将组织块移至冷冻保护液A中平衡5min，然后移入冷冻保护液B中快速清洗至少10次，时间控制在50s内；之后迅速将组织块移至冷冻的叶片上，将载有组织块的冷冻叶片立即投入液氮中保存30s。5)振动切片按照Leica VT1000振动切片机的说明设置速度、频率、切片厚度，将冷冻好的胎盘组织块用专用胶水固定在切片机的托盘中进行切片。6)组织复苏将切好的胎盘组织薄片按照母体面-胎儿面的方向固定于扩散池的夹片上，迅速浸入37°C含I. OmoI/L的蔗糖液中lmin，然后顺次移至含O. 5mol/L、0. 25mol/L的鹿糖液中，分别停留3min,最后在纯水中平衡5min。2、建立人胎盘屏障体外系统此系统由双通道的Ussing扩散池、温度加热块、气体供应装置、恒温浴槽四部分装置组成；将恒温水浴槽经树脂胶管与温度加热块相连，调节恒温浴槽内水温维持Ussing扩散池内温度保持37°C恒温。将Ussing扩散池的通气针阀与气体供应装置连接，同时Ussing扩散池的两侧通入95% O2和5% CO2的混合气体。调节气体供应装置和扩散池的通气针阀控制通气流，以保证气泡缓慢均匀地从池底鼓出。3、将胎盘组织薄片固定连接在扩散池中I)样品固定将复苏后的胎盘组织薄片固定于样品夹片上，将载有胎盘组织的样品夹片插入扩散池两室底部的插口内，固定完好。 2)加注灌流液样品固定后即刻在扩散池的母体侧和胎儿侧同时缓慢加入预热至37. 5 0C，ρΗ7· 4 的培养液 KRBB 7mL。3)调节气流调节气体供应装置和扩散池的通气针阀控制通气流，保证气泡缓慢均匀地从池底鼓出。4)平衡37. 5°C恒温条件下维持胎盘组织薄片的活性，转运实验开始前将组织薄片预平衡30min。 所述冷冻保护液A是将7. 5%乙二醇、7. 5%DMS0、85%纯水充分混合后配制的溶液；冷冻保护液B是将15%乙二醇、15%DMS0、70%纯水充分混合后配制的溶液。本模型建立后，即可用于有关的胎盘研究，根据研究目的进行相关操作。本发明模型的优点和特点I.本模型模拟胎盘在母体内的环境，具备体内胎盘完整的绒毛结构，分泌功能和物质转运功能，模拟了母胎间物质转运的循环系统。通过胎盘绒毛组织形态学特点，胎盘滋养层细胞标志性分泌物hCG的分泌，外排转运体P-gp mRNA的表达和外排功能，以及对被动扩散低-高分子量标志物的通透性，反映该模型持续灌流5小时仍与在体胎盘保持了相似的功能活性。2.经形态学和功能学鉴定，本模型具备胎盘的在体环境，及物质交换、屏障和内分泌的功能，为研究胎盘的结构、功能、物质代谢及妊娠相关疾病提供了一种新的快速筛选方法。该方法在毒理学、靶向治疗以及妊娠期应用药物的安全性评价领域具有广泛的应用价值。3.本发明模型对临床较难收集到的样本，如在环境污染物和毒物的胎儿宫内暴露，感染病毒对胎盘功能的影响等研究中，利用人胎盘屏障体外模型可严格控制实验条件，对特殊疾病的发病机制进行研究。4.本系统可同时完成2个组织样品的测量。5.本发明Ussing扩散池包含了 2个扩散小室，可为细胞和组织提供相似于体内环境的生理环境。以往的胎盘组织是在普通培养瓶或培皿中培养后应用到相关的实验研究，而人体胎盘是母儿间物质交换的场所，存在母体和胎儿两个血液循环系统，其间由胎盘屏障相隔，调控了营养物质、气体及代谢产物的转运，并具有内分泌、免疫等功能。而Ussing扩散池的2个扩散小室为模拟胎盘的母体和胎儿循环过程提供了有利条件。
图I本模型体外系统各装置联接图其中1.胎盘组织薄片；2. Ussing扩散池；3.温度加热块；4.外部恒温水浴槽；
5.Ussing扩散池的通气针阀；6.气体供应装置。
具体实施例方式为了进一步说明本发明，下面通过实施例作进一步的说明，但不限制本发明。实施例一、试剂的制备
UKRBB :称取 NaCl 6. 923g、KCl O. 354g、MgSO4 ·7H20 O. 288g,CaCl2 ·6Η20 0. 56g、NaHCO3 2. lg、Na2HPO4 0. 136g、葡萄糖I. Sg、L-丙氨酸0. 178g，混合后以800mL双蒸水充分溶解，调节PH值至7. 4，双蒸水补足体积至IOOOmL,过O. 22 μ m滤膜，分装，4°C保存。2、冷冻保护液A :将7. 5%乙二醇、7. 5%DMS0、85%纯水充分混合，配制成溶液。3、冷冻保护液B :将15%乙二醇、15%DMS0、70%纯水充分混合，配制成溶液。二、建立人胎盘屏障体外模型I.制备胎盘组织薄片I)收集胎盘选择25-30岁，孕36-40周足月分娩的健康产妇胎盘，胎盘娩出后，在无菌条件下，用冰冷的含4U/mL肝素的生理盐水充分冲洗胎盘3次，浸于冰冷的含4U/mL肝素的KRBB中。2)用冰冷的含4U/mL肝素的生理盐水充分冲洗胎盘3次，之后浸于冰冷的含4U/HiL肝素的KRBB中备用。3)取胎盘终末绒毛部位，即胎盘母体面底板区的中间带的丛密绒毛处，2块约3cmX 3cmX Icm大小的组织块，用KRBB漂洗。4)在室温下将组织块移至冷冻保护液A中平衡5min，然后移入冷冻保护液B中快速清洗至少10次，时间控制在50s内；之后迅速将组织块移至自制的冷冻叶片上，将载有组织块的冷冻叶片立即投入液氮中保存30s。5)按照Leica VT1000振动切片机的说明设置速度、频率及500 μ M切片厚度，将冷冻好的胎盘组织用专用胶水固定在切片机的托盘中进行切片。6)将切好的胎盘组织薄片按照母体面-胎儿面的方向固定于扩散池的夹片上，迅速浸入37°C含I. OmoI/L的蔗糖液中lmin，然后顺次移至含O. 5mol/L、0. 25mol/L的蔗糖液中，分别停留3min,最后在纯水中平衡5min。2、建立人胎盘屏障体外系统将恒温水浴槽经树脂胶管与温度加热块相连，调节恒温浴槽内水温维持Ussing扩散池内温度保持37°C恒温。将Ussing扩散池的通气针阀与气体供应装置连接，同时Ussing扩散池的两侧通入95% O2和5% CO2的混合气体。调节气体供应装置和扩散池的通气针阀控制通气流，以保证气泡缓慢均匀地从池底鼓出。3、将胎盘组织薄片连接固定在扩散池中I)将复苏后的胎盘组织薄片固定于样品夹片上，将载有胎盘组织的样品夹片插入扩散池两室底部的插口内，固定完好。2)样品固定后即刻在扩散池的母体侧和胎儿侧同时缓慢加入预热至37. 5°C，pH7. 4 的培养液 KRBB 7mL。3)调节气体供应装置和扩散池的通气针阀控制通气流，保证气泡缓慢均匀地从池底鼓出。4)平衡37. 5°C恒温条件下维持胎盘组织薄片的活性，转运实验开始前将组织薄片预平衡30min。三、验证模型是否建立成功I.胎盘终末绒毛形态学检测胎盘终末绒毛部位随机切取组织，生理盐水清洗。于Ussing扩散池中培养5h后·经2. 5%戊二醛溶液固定4h。将组织用O. Imol -L^1PBS (pH=7. 4)清洗3次，每次40min。然后再用含有1%锇酸的O. Imol · L^1PBS (pH=7. 4)固定I. 5h，50%、70%、95%、100%酒精逐级脱水，各lOmin。环氧树脂丙酮(I I)浸透2h，环氧树脂812+815包埋，Leica超薄切片机切片(50-70nm)。切片用5%乙酰双氧铀镁和柠檬酸铅染色，用JEM-IOO电镜观察绒毛形态。结果透射电镜下观察合体滋养细胞表面均覆有浓密的微绒毛，呈细而长，整齐排列，细胞内含有丰富的内质网和线粒体，遍布于整个胞质，胞质内含有少量脂质颗粒。2.胎盘组织人绒毛膜促性腺激素(β -hCG)的分泌胎盘组织薄片置于扩散池中培养，分别于0、l、2、3、4、5、12、24、48h在胎盘屏障体外模型母体侧、胎儿侧各取样100 μ L，同时补充同温度等体积的K氏缓冲液，IOOOrpm.mirT1,离心IOmin,取上清液，4°C保存。Elisa法检测试剂盒说明书进行操作，酶标仪在450nm吸收波长下读取OD值，绘制标准曲线，将OD值带入标准曲线，计算待测样本的浓度。结果胎盘终末绒毛组织在扩散池中培养，48h内培养液中均可检测到β-hCG，且均呈现出先上升后下降的趋势，分泌量峰值分别在培养的5h。3.胎盘组织P-gp/MDR I mRNA的表达将灌流后的胎盘组织置于液氮中，离心柱法提取总RNA，检测总RNA浓度，鉴定其纯度及完整性，以2 μ g RNA为模板逆转录合成cDNA。上游引物
5’ TGCTCAGACAGGATGTGAGTTGG3 ’ ；下游引物 5 ’ GTAATTACAGCAAGCCTGGAACC3，产物长 122bp。管家基因 GAPDH 上游引物 5 ’ CCATGGAGAAGGCTGGGG3 ’;下游引物 5 ’ -CAAAGTTGTCATGGATGACC3，，产物长246bp。PCR扩增的反应体系为=Premix Ex Taq酶10 μ L，cDNA2 μ L，引物各I. O μ L加双蒸水至总体积20 μ L。反应条件94°C预变性lmin ;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环，72°C延伸lOmin, 4°C IOmin0 1%琼脂糖凝胶电泳，100V，25min，紫外灯下观察拍照，凝胶图像分析系统检测灰度值。以P-gp灰度值/GAPDH灰度值表示P-gp的表达水平。结果采用半定量RT-PCR方法可检测到经灌流5h后的胎盘终末绒毛存在P_gpmRNA的表达。4.胎盘组织P-gp外排功能检测母体侧和胎儿侧均加入空白/ΙΟΟμΜ维拉帕米的KRBB 7mL，扩散池的两室通Λ 95 % 02和5% C02的混合气体，37 °C恒温条件下维持胎盘组织薄片的活性，空白的KRBB/100 μ M维拉帕米的KRBB中平衡30min。母体侧分别加入4 μ M的P-gp探针底物罗丹明(Rhol23)/含4μ M罗丹明和100 μ M维拉帕米KRBB7mL，胎儿侧加入空白的KRBB/100 μ M维拉帕米的KRBB。转运开始后30min，于胎儿侧取样200 μ L，每组平行做3个样本，多功能酶标仪530nm激发波长，590nm发射波长下检测荧光强度值。根据标准曲线计算药物浓度，上述实验均避光操作，实验重复3次，计算表观渗透系数。结果依据公式分别计算Papp,母体侧向胎儿侧的转运中，通过P-gp抑制剂维拉帕米抑制P-gp功能 ，可显著增加Rhol23由母体侧向胎儿侧的转运，Papp值由
O.26±0. ΟΙΧΙΟ-7/cm.s—1显著增加为2. 89±0· 06X ΙΟ-7/cm · s—1，表明胎盘屏障体外模型母体侧的P-gp具有显著的外排特性(p〈0. 01)，可用于p-gp参与的主动转运研究。5.胎盘屏障通透性检测将胎盘组织薄片与扩散池固定连接，平衡30min后，于扩散池的母体侧分别加入37°〇，0.5 4 11荧光素溶液和10 μ M FD70s溶液7mL。于给定的时间间隔1、2、3、8、12、24h，在胎儿侧取样200 μ L，同时补充同温度等体积的KRBB。多功能酶标仪490nm激发波长，520nm发射波长下检测荧光强度值。根据标准曲线计算各时间点药物浓度，计算各时间点转运率和Papp，转运率=胎儿侧药物转运量/母体侧药物的初始量X 100%。避光操作，实验重复3次。结果低分子量标志物突光素分子量为332Da, 24h内的转运率为(33. 10±3. 22)%，转运率与时间呈良好的线性关系，无饱和现象，符合被动扩散特点。荧光素在24h的Papp为(3. 42 ±O. 24) X 10_6cm · s—1，吸收较好，高分子量标志物FD70S分子量为 70，OOODa, 24h 内的转运率为(O. 39±O. 01) %，Papp 为(3. 93±O. 08) X 10_8cm · s-1，吸收较差，表现为与被动扩散的分子量选择性相同的渗透特征。
权利要求
1.一种新型人胎盘屏障体外模型，其特征在于通过如下方法建立，包括步骤 1)制备胎盘组织薄片 收集胎盘选择25-30岁，孕36-40周足月分娩的健康产妇胎盘，胎盘娩出后，在无菌条件下，用冰冷的含肝素的生理盐水充分冲洗胎盘，之后浸于冰冷的含肝素的KRBB中； 用冰冷的含肝素的生理盐水充分冲洗胎盘，之后浸于冰冷的含肝素的KRBB中备用； 切取胎盘组织块在胎盘终末绒毛部位，取2块 组织块，用KRBB漂洗； 玻璃化冷冻法冷冻胎盘组织在室温下将组织块移至冷冻保护液A中平衡5min，然后移入冷冻保护液B中快速清洗至少10次，时间控制在50s内；之后迅速将组织块移至冷冻的叶片上，将载有组织块的冷冻叶片立即投入液氮中保存30s ； 振动切片按照Leica VT1000振动切片机的说明设置速度、频率、切片厚度，将冷冻好的胎盘组织块用专用胶水固定在切片机的托盘中进行切片； 组织复苏将切好的胎盘组织薄片按照母体面-胎儿面的方向固定于扩散池的夹片上，迅速浸入37°C含I. OmoI/L的蔗糖液中lmin，然后顺次移至含O. 5mol/L、0. 25mol/L的鹿糖液中，分别停留3min,最后在纯水中平衡5min ； 2)建立人胎盘屏障体外系统 将恒温水浴槽经树脂胶管与温度加热块相连，调节恒温浴槽内水温维持Ussing扩散池内温度保持37°C恒温；将Ussing扩散池的通气针阀与气体供应装置连接，同时Ussing扩散池的两侧通入95% O2和5% CO2的混合气体；调节气体供应装置和扩散池的通气针阀控制通气流，以保证气泡缓慢均匀地从池底鼓出； 3)将胎盘组织薄片固定连接在扩散池中 样品固定将复苏后的胎盘组织薄片固定于样品夹片上，将载有胎盘组织的样品夹片插入扩散池两室底部的插口内，固定完好； 加注灌流液样品固定后即刻在扩散池的母体侧和胎儿侧同时缓慢加入预热至37.5 0C，ρΗ7· 4 的培养液 KRBB 7mL ； 调节气流调节气体供应装置和扩散池的通气针阀控制通气流，保证气泡缓慢均匀地从池底鼓出； 平衡37. 5°C恒温条件下维持胎盘组织薄片的活性，转运实验开始前将组织薄片预平衡30min ； 所述冷冻保护液A是将7. 5%乙二醇、7. 5%DMS0、85%纯水充分混合后配制的溶液；冷冻保护液B是将15%乙二醇、15%DMS0、70%纯水充分混合后配制的溶液。
全文摘要
本发明公开了一种新型人胎盘屏障体外模型，本模型模拟胎盘在母体内的环境，具备体内胎盘完整的绒毛结构，分泌功能和物质转运功能；本模型持续灌流5小时仍与在体胎盘保持了相似的功能活性，本模型的建立为研究胎盘的结构、功能、物质代谢及妊娠相关疾病提供了一种新的快速筛选方法，在毒理学、靶向治疗以及妊娠期应用药物的安全性评价领域具有广泛的应用价值。
文档编号C12N5/073GK102899284SQ20121038310
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者宋殿荣, 郭洁, 韩芳, 张崴, 王雅楠, 王玉华 申请人:天津中医药大学第二附属医院