专利名称：超级细菌ndm和kpc基因双重荧光定量pcr检测方法及其试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及荧光定量PCR技术领域，特别涉及检测超级细菌耐药基因的双重荧光定量PCR技术及其试剂盒。
背景技术：
碳青霉烯是有着广谱抗菌活性的一类β -内酰胺类抗生素，常作为治疗高产Ampc和超广谱的β_内酰胺酶的革兰阴性杆菌引起的感染的最有效的药物。但随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，细菌也逐渐获得对此类药物的耐药性。近年来，耐碳青霉烯的非发酵菌已成为医院感染的严重问题，而且耐碳青霉烯的肠杆菌细菌的报道也越来越多，这种耐碳青霉烯的革兰阴性杆菌的快速传播和流行正日益成为令人担忧的全球性问题。细菌对碳青霉烯类抗生素耐药主要原因是产生碳青霉烯酶，其包括Ambler 分子分类的Α、B、D三类酶。其中A类中的新增成员KPC (Klebsiella PneumoniaeCarbapenemase)和 B 类中新增成员 NDM (New Delhi metallo-β-lactamase),因其能够水解除头霉素类以外几乎所有的β_内酰胺类抗菌药物而引起了世界各国抗感染专家和临床微生物工作者的极大关注。携带有NDM或KPC基因的细菌也被称为“超级细菌”。特别是携带有NDM的“超级细菌”目前仅对替加环素和黏菌素敏感，但是前者具有毒副作用，后者只能用于治疗部分种类的细菌感染，一般不适合大规模使用而且对黏菌素耐药的多重耐药菌株目前已有报道。由NDM或KPC型的“超级细菌’感染造成的暴发流行，往往使治疗陷入无药可用的境地，给临床抗感染治疗带来极大挑战。因此及时检测NDM和KPC基因，对细菌耐药表型进行监测，控制和杜绝超级细菌的爆发流行显得至关重要。目前主要利用分子生物学技术检测携带NDM或KPC基因的超级细菌，PCR的方法更是被誉为检测的“金标准”。但普通PCR容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性或假阴性，而且普通PCR的结果判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作不够简化。目前尚缺乏一种灵敏度高、特异性好、操作简便，且能对同时对KPC和NDM基因进行联合检测的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种超级细菌NDM和KPC基因双重荧光定量PCR检测方法。本发明所采取的技术方案是
一种超级细菌的双重荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤
(1)提取待检样本的DNA|旲板；
(2)对DNA模板进行PCR扩增，所用引物和探针序列如下
NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I),
NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2),NDM 基因的探针 NDM-probe :TGGCAGCACACTTCCTATCTCG (SEQ ID NO. 3),
KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4),
KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5),
KPC 基因的探针 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCA TTCAAGG (SEQ ID NO. 6)；
所用探针标记的荧光基团互不相同；
(3)结果分析反应结束，根据待测样本的Ct值判断其是否为NDM、KPC基因阳性。上述双重荧光定量PCR扩增体系为10μ I的Premix Ex Taq (Probe qPCR)(2X)，10Mmol/L 的 NDM 和 KPC 上下游上下游引物各 O. 4μ1，5Mmol/L 的 NDM-probe 和KPC-probe 各 O. 2μ1，ROX Reference Dye II 0· 4μ1，待检 DNA 模板或阳性对照 DNA 或阴性对照 μ ，加灭菌去离子水补足体积至20μ1。上述双重荧光定量PCR反应条件为95°C预变性20s ;然后95°C 3s，60°C 30s，反应40个循环。上述探针标记荧光为J0E-ECLIPSE和FAM-ECLIPSE。所用荧光定量PCR仪为美国ABI 7500 FAST。一种超级细菌的双重荧光定量PCR检测试剂盒，包括如下成分Premix Ex Taq(Probe qPCR) (2X)、引物、探针、ROX Reference Dye II、阳性对照品、阴性对照品，其中引物和探针序列分别为
NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I),
NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2),
NDM 基因的探针 NDM-probe :TGGCAGCACACTTCCTATCTCG (SEQ ID NO. 3),
KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4),
KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5),
KPC 基因的探针 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCATTCAAGG (SEQ ID NO. 6)；
所用探针标记的荧光基团互不相同。上述阳性对照品为NDM和KPC基因阳性的DNA标本混合物，阴性对照品为灭菌去离子水。本发明的有益效果是
本发明方法能在同一体系同时完成KPC和NDM两个基因的检测，较单重荧光定量PCR更加高效、省时省力。本方法特异性好、重复性佳、灵敏性高，且可以利用已建立的标准曲线对未知样本进行定量分析。
图I为特异性实验扩增曲线 图2为敏感性实验扩增曲线 图3为重复性试验扩增曲线 图4为标准曲线 图5为临床标本扩增曲线图。
具体实施方式
实施例I
超级细菌NDM和KPC基因双重荧光定量PCR检测方法的引物和Taqman探针的设计与合成
(I)引物和探针的设计方法
在GeneBank上下载NDM和KPC基因所有亚型的序列，到目前为止NDM共六个亚型NDM-I，NDM-2, NDM-3，NDM-4，NDM-5，NDM-6 对应的 GeneBank 序列号分别是 AB614355，JF703135，JQ734687，JQ348841，JN104597, JN967644 ;KPC 共 11 个亚型分别为 KPC-2，KPC-3，KPC-4, KPC-5, KPC-6, KPC-7，KPC-8，KPC-9，KPC-10, KPC-II, KPC-12, GeneBank 序列号依次是 AY034847，AF395881, FJ473382, EU400222, EU555534, EU729727, FJ234412, FJ624872,GQ140348，HM066995，HQ641421。利用 Beacon Designer 7 软件分别针对 NDM 和 KPC 基因各亚型间保守的区域设计引物和探针，使引物或探针与模板的结合点避开突变区域。设计好的引物和探针通过01igo6. 44、DNAstar、Primer Premier5. 0等多种软件进行评估，且所有 引物在NCBI数据库(www. ncbi.nlm.nih. gov)上BLAST均未见除目的基因外的其他同源序列。(2)引物和探针序列
NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I),
NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2),
NDM 基因的探针 NDM-probe JOE-TGGCAGCACACTTCCTATCTCG- ECLIPSE (SEQ ID NO. 3),KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4),
KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5),
KPC 基因的探针 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCATTCAAGG (SEQ ID NO. 6)；
所用探针标记的荧光基团互不相同；
(3)引物和Taqman探针均由大连Takara生物公司合成并进行突光标记。实施例2 Cl)菌株
选取南方医科大学附属南方医院微生物室临床分离的耐碳青霉烯的肠杆菌科细菌和耐碳青霉烯的非发酵菌中的不动杆菌和铜绿假单胞菌，同一病人多次分离的菌株若属种相同则只留取一株，共166株，其中大肠埃希菌I株、阴沟肠杆菌I株、肺炎克雷伯菌9株、产酸克雷伯菌I株、鲍曼不动杆菌73株和84株铜绿假单胞菌。临床分离的菌株利用BDPhoenixlOO全自动微生物分析仪分析系统及其配套细菌鉴定卡进行菌种鉴定和药敏试验，头孢哌酮/舒巴坦和米诺环素药敏试验采用K-B法，药敏纸片购自英国0X0ID公司。NDM和KPC基因的阳性对照株(编号分别是856和432)为本发明人常规PCR法检测并经测序验证的阳性标本，GeneBank序列号分别为JN711113和JF431928。阴性株为大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC70060和金黄色葡萄球菌ATCC25923。(2)试剂和仪器
常规PCR反应试剂和荧光定量PCR反应试剂及细菌DNA提取试剂盒均购自宝生物工程Takara大连有限公司。质粒DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司。Thermo公司核酸分析仪。Bio-Rad GeldocXR凝胶成像仪。德国eppendorf公司的Mastercycler梯度PCR仪。美国ABI 7500 FAST荧光定量PCR仪。DNA测序服务由北京六合华大基因公司提供。(3)扩增体系和反应条件
①双重实时荧光定量PCR扩增体系和反应条件
扩增反应在AB17500 FAST荧光定量PCR仪上进行。反应体系为20μ1 =Premix Ex Taq(Probe qPCR) (2 X) 10μ1 ; 10Mmol/L 的 NDM 和 KPC 上下游引物各 O. 4μ1 ;5Mmol/L 的NDM-probe 和 KPC-probe 各 O. 2μ1 ；R0X Reference Dye II 0. 4μ1 ;待检 DNA 模板或阳性对照DNA或阴性对照 μ ，加灭菌去离子水补足20μ1体积。反应条件95°C预变性20s ；95°C变性3s，60°C退火并延伸30s，40个循环。②普通PCR扩增体系和反应条件
NDM和KPC两基因普通PCR反应在德国印pendorf公司的Mastercycler梯度PCR仪上进行。所用引物序列如下
Endm-F CACCTCATGTTTGAATTCGCC (SEQ ID NO. 7)；
Endm-R CTCTGTCACATCGAAATCGC (SEQ ID NO. 8)；
Ekpc-F ATGTCACTGTATCGCCGTCT (SEQ ID NO. 9)；
Ekpc-R TTTTCAGAGCCTTACTGCCC (SEQ ID NO. 10)；
扩增反应体系为20μ1 含Mg2+的10 X buffer 2 μ I，dNTP终浓度为200 μ mol/L,10 μ mol/L的上下游引物各为0. 8 μ 1，DNA模板I μ 1，TaqDNA聚合酶I U，加入灭菌去离子水至20 μ I。反应条件95°C预变性5min ;95°C变性30s，57°C退火40s并72°C延伸lmin，30个循环。取5μ1扩增产物与 μ 6 X Loading buffer上样缓冲液混勻,在1%琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为0. 5 X TBE,电压为5V/cm，电泳20分钟。通过Bio-Rad GeldocXR凝胶成像仪自动读取电泳结果。(4)实验步骤 ①质粒标准品的构建
利用本发明人已建立的NDM和KPC常规PCR扩增法对测序确认的阳性DNA标本分别进行NDM和KPC扩增，PCR产物用I %琼脂糖凝胶电泳，确认目的条带有扩增，分别将NDM和KPC基因的PCR扩增产物克隆至pMD18-T载体上，挑取阳性克隆转化至DH5a大肠杆菌中，增殖后提取质粒DNA进行序列测定以鉴定插入序列，并测定质粒DNA浓度以进行拷贝数的换
笪
ο②模板DNA的提取
按照 TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver. 3· O 的说明利用此试剂盒提取细菌基因组DNA。通过Thermo公司核酸分析仪测定0D260 / 0D280值以确定DNA浓度。③敏感性
分别将构建的NDM和KPC质粒标准品进行10倍梯度稀释，使起始浓度均为IO8拷贝数/μ 终浓度均为10拷贝数/μι (IO8、107、IO6、105、IO4、103、IO2、10)。以上述一系列稀释的质粒标准品作为模板，按照上述反应体系进行多重实时荧光定量PCR反应，在同一体系内同时扩增NDM和KPC基因，并以稀释倍数的log值为横坐标，扩增的Ct值为纵坐标制作标准曲线，根据曲线参数来评价实验结果的可信度。④特异性对NDM和KPC基因均阴性的标准株大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC70060和金黄色葡萄球菌ATCC25923进行双重PCR体系特异性性实验。并将NDM (编号为856)和KPC (编号为432)基因阳性的DNA标本等比例混合后取混合的DNA样本作为阳性对照品，以灭菌去离子水空白作为阴性对照同时进行双重实时荧光定量PCR反应。⑤重复性
以浓度为IO5拷贝/μ 的NDM和KPC质粒标准品I: I混合作为模板重复8次，对结果进行统计学分析，计算变异系数(CV)。⑥检测临床分离菌株
对临床分离的166株耐碳青霉烯革兰阴性杆菌提取基因组DNA后，利用已经建立的双重荧光定量PCR法进行KPC和NDM基因检测，通过NDM和KPC普通PCR检测法和测序技术·对检测结果进行验证并且阳性标本经测序可进一步确定其基因亚型。(4)结果 ①特异性
NDM和KPC等比例混合的阳性对照DNA标本按照已建立的反应体系扩增后可见两条S型曲线即NDM的扩增曲线和KPC的扩增曲线，指数期明显，且基线无上扬现象。大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC70060和金黄色葡萄球菌ATCC25923均无扩增，见图I。此结果表明本发明建立的双重荧光定量PCR法有良好的特异性。②敏感性
在同一扩增体系中同时加入10倍梯度稀释的NDM和KPC质粒标准品，起始浓度均为IO8拷贝数/μ ，终浓度均为10拷贝数/μι ( ο8、 ο7、 ο6、 ο5、 ο4、 ο3、io2、10)。结果显示ndm和KPC —系列稀释的质粒标准品均有良好的S型扩增曲线，基线无上扬现象，指数期明显，并且有较好的平行性，见图2。说明NDM和KPC基因均能至少检测到10个拷贝数的质粒，表明该方法敏感性高。③重复性
以IO5拷贝/μ 的I: I混合的NDM和KPC质粒标准品作为模板，重复做8次试验，计算各重复样品反应Ct值之间的变异系数，扩增曲线见图3。NDM的结果为I. 8%,KPC的结果为
0.5%。对于检测方法来说，统计结果的变异系数CV值〈5%即可以认为该方法的重复性良好。从本实施例的结果CV值〈5%，因此该方法具有较好的重复性。④标准曲线
为了准确定量未知的待检模板的浓度，利用模板浓度和阳性扩增的Ct值之间的相关关系，建立的NDM和KPC基因扩增的标准曲线见图4，NDM基因的标准曲线为Υ=_3. 273X log (X)+40. 357，KPC 基因的标准曲线为 Y=-2. 997 X log (X)+34. 248，其中 Y 为 Ct 值，X为拷贝数，R2分别为O. 971和O. 992，扩增效率分别是102. 066%和115. 615%。上述结果表明本发明建立的标准曲线线性关系较好，能够通过标准曲线对未知浓度的样本进行定量。⑤临床分离菌株检测
对临床分离的166株耐碳青霉烯革兰阴性杆菌基因组DNA为模板分别进行常规PCR检测和双重荧光定量PCR检测，双重荧光定量PCR法检测结果9株肺炎克雷伯菌检出KPC基因；1株产酸克雷伯菌NDM阳性，I株阴沟肠杆菌NDM阳性，不动杆菌中有两株NDM阳性；其余标本KPC和NDM均阴性，未见同时携带有两个基因的标本，扩增曲线见图5。这与常规PCR法检测结果完全一致。NDM和KPC阳性PCR产物测序结果显示，4株NDM阳性菌株均携带NDM-I基因，9株KPC阳性的菌株均携带KPC-2基因，此外两株NDM阳性的不动杆菌进一步经16S-23S rRNA测序验证分别为不动3和13TU种，其余携带KPC和NDM的阳性菌株经16srRNA测序技术菌种鉴定结果与BD PhoenixlOO全自动微生物分析仪鉴定结果一致。本发明建立的双重荧光定量PCR法，对于NDM基因，其引物和Taqman探针均针对所有亚型保守区设计，可检测到所有NDM亚型，同样地KPC基因也可以检测到所有的亚型。本发明已经检出的阳性标本经测序分析，KPC基因均为KPC-2，NDM基因均为NDM-1，两基因检测出的亚型都是我国乃至全球最为常见的类型。从实验结果来看，本方法特异性好、重复性佳、灵敏性高，至少能检测到10个拷贝数的质粒。质粒拷贝数和扩增Ct值之间相关性较好，可利用已建立的标准曲线对未知模板浓度进行定量。 总之本发明建立的基于Taqman探针的双重荧光定量PCR法同时针对NDM和KPC基因能在同一体系同时检测两个基因，可准确快速地进行NDM和KPC基因的筛选，有效防止NDM和KPC型的超级细菌传播导致的暴发流行，较已报道的相应单重荧光定量PCR法提高了诊断的敏感性，更高效、快捷、省时省力。另外，本发明建立的方法意在全面检出所有类型的NDM和KPC基因，大大提高了检测效率，若需精确分型可结合DNA测序技术。
权利要求
1.一种超级细菌的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤 (I)提取待检样本的DNA |旲板； (2 )对DNA模板进行PCR扩增，所用引物和探针序列如下 NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I), NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2),NDM 基因的探针 NDM-probe :TGGCAGCACACTTCCTATCTCG (SEQ ID NO. 3), KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4), KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5),KPC 基因的探针 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCATTCAAGG (SEQ ID NO. 6)； 所用探针标记的荧光基团互不相同； (3)结果分析反应结束，根据待测样本的Ct值判断其是否为NDM、KPC基因阳性。
2.根据权利要求I所述的一种超级细菌的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述双重荧光定量PCR扩增体系为10 μ I的Premix Ex Taq (Probe qPCR) (2X)，10Mmol/L 的 NDM 和 KPC 上下游上下游引物各 O. 4μ1，5Mmol/L 的 NDM-probe 和 KPC-probe 各O.2μ1, ROX Reference Dye II 0. 4μ1，待检DNA模板或阳性对照DNA或阴性对照 μ ，加灭菌去离子水补足体积至20μ1。
3.根据权利要求I所述的一种超级细菌的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述双重荧光定量PCR反应条件为95°C预变性20s ;然后95°C 3s, 60°C 30s，反应40个循环。
4.根据权利要求I所述的一种超级细菌的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于所述探针标记荧光为J0E-ECLIPSE和FAM-ECLIPSE。
5.根据权利要求I所述的一种超级细菌的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于所用荧光定量PCR仪为美国ABI 7500 FAST。
6.一种超级细菌的双重荧光定量PCR检测试剂盒，包括如下成分Premix Ex Taq(Probe qPCR) (2X)、引物、探针、ROX Reference Dye II、阳性对照品、阴性对照品，其中引物和探针序列分别为 NDM 基因上游引物 NDM-F :TTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO. I), NDM 基因下游引物 NDM-R :GGTTGATCTCCTGCTTGA (SEQ ID NO. 2),NDM 基因的探针 NDM-probe :TGGCAGCACACTTCCTATCTCG (SEQ ID NO. 3), KPC 基因上游引物 KPC-F :CGCAACTGTAAGTTACCG (SEQ ID NO. 4), KPC 基因下游引物 KPC-R :CATGCCTGTTGTCAGATA (SEQ ID NO. 5),KPC 基因的探针 KPC-probe :CCACTGTGCAGCTCATTCAAGG (SEQ ID NO. 6)； 所用探针标记的荧光基团互不相同。
7.根据权利要求6所述的一种超级细菌的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照品为NDM和KPC基因阳性的DNA标本混合物，阴性对照品为灭菌去离子水。
全文摘要
本发明公开了一种超级细菌NDM和KPC基因双重荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，利用特异性设计的引物和探针，优化扩增体系和条件，能在同一体系同时完成KPC和NDM两个基因的检测，较单重荧光定量PCR更加高效、省时省力，本方法特异性好、重复性佳、灵敏性高，且可以利用已建立的标准曲线对未知样本进行定量分析。
文档编号C12Q1/68GK102899414SQ20121038309
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者芮勇宇, 郑芬, 孙静静, 王前 申请人:南方医科大学