专利名称：解淀粉芽孢杆菌及其用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种有抑菌效果和提高动物免疫能力的解淀粉芽孢杆菌的筛选及应用。
背景技术：
我国作为世界水产大国，也是世界上唯一水产养殖产量高于捕捞产量的国家，2002年水产养殖产量高达2770万吨，约占世界水产养殖总产量的70%，这主要得益于我国水产养殖集约化程度的不断提高。水产养殖已成为我国渔业发展的重点，是我国大农业中发展较快、活力较强、经济效益较高的产业之一。伴随着我国水产养殖业的迅猛发展，各类水产病害亦迅猛增长，据不完全统计，目前水产养殖病害在300种以上，每年约有1/10的养殖面积发生病害，年损失产量占养殖总产量的15 % 30 %，经济损失高达数百亿元，水产动物病害已成为影响我国水产养殖业发展的主要制约因素(黄艳平等，2004)。
针对水产养殖业病害爆发频率的加剧，抗生素作为重要的抗细菌性疾病的药物，在水产养殖上得到广泛应用。如用青霉素和硫酸链霉素治疗亲鱼产后受伤引起感染及罗非鱼的溃烂病、赤皮病、打印病；用庆大霉素治疗草鱼“三病”(肠炎病、烂鳃病、赤皮病)；用红霉素治疗球菌引起的感染和虹鳟鱼的细菌性肾脏疾病等都收到良好的效果；加氯霉素可以抑制淡水养殖中的致病性气单胞菌，氟喹诺酮类抗菌素可以抑制海水养殖中致病性弧菌。这在一定程度上极大地促进了水产养殖业的发展。但同时，养殖水体中长期使用抗生素已引发一系列环境和社会问题，尤其是过量的使用抗生素使水体微生物选择压力增大，一方面导致抗药微生物滋生，可改变水体微生物群落结构，恶化水体的适养性，另一方面引起水产动物体内菌群失调，易引发内源性、外源性和二重感染(胡彩红，2005)。因此，限制和减少抗生素类药物在水产养殖水体中的使用，寻找抗生素的替代品已经成为水产养殖业发展的必然趋势。益生菌不仅可避免抗生素的副作用、达到防治疾病的效果，而且能促进动物生长。近年来，益生菌作用抗生素类药物的替代物，在养殖业得到广泛的关注。现代微生态学研究表明，微生物在水产养殖中占有重要的地位，直接影响产量、物质循环、动物营养、水质、疾病控制及养殖水环境(Moriarty, 1998)。随着微生物学和微生态学的深入研究,利用益生菌来调节动物体内生态环境、改善养殖生态环境、增强机体免疫功能、抑制病原微生物、减少疾病发生，正逐渐成为各国研究热点。由于益生菌制品没有残留，也不会产生抗药性，在中国、印度等水产养殖大国得到广泛的应用，并主张用其替代抗生素。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种解淀粉芽孢杆菌，该解淀粉芽孢杆菌有抑菌效果和提高动物免疫能力。为了解决上述技术问题，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌，保藏名称解淀粉芽孢杆菌SC06 (Bacillus amyloliquefaciens SC06),保藏单位中国典型培养物保藏中心,保藏地址中国武汉武汉大学；保藏日期2012年7月11日，保藏号CCTCC No: M2012280。本发明还同时提供了上述解淀粉芽孢杆菌的用途，用于抑菌或者用于提高动物的免疫能力。作为本发明的解淀粉芽孢杆菌的用途的改进动物为水生动物或畜禽。本发明以SC06菌株总DNA为模板，使用通用引物上游引物(Pl):5’ 一 AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT —3，下游引物(P6):5’ 一 TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC — 3’ ；进行PCR扩增获得的16s rDNA部分序列；通过Blast与GenBank收录的细菌16srDNA基因序列比对，发现SC06菌株与解淀粉芽孢杆菌的同源性为99%。本发明的解淀粉芽孢杆菌可作为益生菌用于提高水生动物、畜禽生长，并提高其抗氧化和免疫功能。本发明的解淀粉芽孢杆菌实际使用时，可采取向水中投放解淀粉芽孢杆菌SC06的方法，一般控制解淀粉芽孢杆菌SC06在水体中的浓度为O. 5飞X 107CFU/mL ;也可在每克常规水生动物/畜禽基础日粮中添加解淀粉芽孢杆菌SC06 O. 5飞X 105CFU。本发明的解淀粉芽孢杆菌也可先制成干菌粉，再进行如上操作。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是SC06的扫描电镜图片；图2是SC06对甲鱼生长的影响对比图。
具体实施例方式实施例1、解淀粉芽孢杆菌SC06的获得I)、制备稀释液称取土壤(采自杭州郊区蔬菜地)2g，放入IOOml无菌水中，用高速组织捣碎机捣碎。无菌操作吸取捣碎液1. Oml加入9. Oml无菌水中，再用无菌水稀释为10_\10_2，10 _3、ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ '10_7共七个浓度梯度。2)、培养取各浓度的稀释液IOOul分别涂布于LB培养基平板(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L,酵母浸出物5g/L，琼脂16g/L，其余为水；用IOmoI/L NaOH调节pH7. 0，121°C灭菌20分钟)，晾干后倒置恒温箱内30°C培养。3)、菌株的分离、纯化在LB培养基上于30°C培养48 h，即有菌落出现。用接种针挑取单个菌落，在LB培养基平板表面连续划线培养，选择那些形态不一样的菌落，重复几次后便可形成单独孤立的菌落，因而获得纯培养菌株。4)、不同时间抑菌效果测定将每个单菌落活化后分别置于50ml胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Tryptone soyaBroth, TSB，购自杭州微生物试剂厂公司)中培养，初始接种浓度为1. OX IO6 CFU/mL, 24h后调整各菌液至1. OX IO9 CFU/mL备用。LB培养基平板高温灭菌(121°C灭菌20分钟)后，冷却至50-60°C后，按照1% (体积比)的接种量加入一种病原性细菌菌液(培养16h的嗜水气单胞菌(Aeromonas HydroPhila ATCC 14715)、副溶血弧菌(Vibrio ParahaemolyticusATCC 27519)和突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens ATCC 13525)),倒平板,放置无菌室约lh，倒置放于4°C冰箱中lh，用直径O. 25cm打孔器在平板表面均匀的打孔，然后按照每孔10 μ I的加样量加入被筛选菌株菌液，在30°C培养，每隔3h取样，测定24h内的抑菌圈直径变化，每个平皿设3个重复。挑选出对所试3株病原性细菌的总抑制效果最佳的菌落，命名为SC06。SC06对嗜水气单胞菌和副溶血弧菌抑制效果最为明显，12h抑菌环平均直径分别为16. 2和13. 1mm，对荧光假单胞菌12h抑菌环平均直径为9. 4mm。5)、SC06拮抗性测定将菌株SC06在LB液体培养基(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母浸出物5g/L，其余为水；用10mol/L NaOH调节pH7.0，121°C灭菌20分钟)30°C进行培养，每隔3h取样，测定其0D600。结果显示，SC06生长较快，18h的OD600为1. 72±0· 16。6)、共凝集试验参照Chabrillon M.，et al 2005方法并稍作修改进行。于LB液体培养基中接种病原性细菌和被筛选细菌，30°C过夜培养，测定其0D600，并将其OD稀释至O. 5，然后取菌株SC06和病原性细菌各1. 5ml于无菌具塞试管中，涡旋振荡混匀，30°C静置培养4h后测定0D_。3.0ml的病原性细 菌或被筛选细菌30°C静置培养4h作为对照管。其共凝集率表示共凝集率=[(SC+LC)/2-(S+L)/( SC+LC)/2] XlOO (SC和LC :对照管病原细菌和益生菌的终0D600 ；L+S :试验管终0D600)。结果发现，SC06对3株病原性细菌均具有较好共凝集效果，对 A. hydroPhila、P. flurorescens、V. Parahaemolyticus 的共凝集率分别为30. 42%,41. 20%,39. 20%。备注说明病原性细菌是指嗜水气单胞菌(Aeromonas HydroPhila ATCC 14715)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus ATCC 27519)和突光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens ATCC 13525)。7)、菌种鉴定(I)形态特征在液体培养基中呈均匀混浊并伴有微量沉淀，轻轻摇动沉淀即散开。在营养琼脂平板上菌落SC06直径为2. O 3. Omm，平台状，边缘整齐，不透明，有光泽，无色素，质地较软。SC06在扫描电镜的形态如图1。SC06首尾相连，形成链状。(2) 16S rRNA 序列分析对分离筛选到的菌株SC06进行进一步的16S rRNA序列分析与比对。根据细菌16S rDNA的保守序列设计一对引物，上游引物(Pl):5’ 一 AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT —3，下游引物(P6) : 5 ’ 一 TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC — 3 ’由上海生工合成。PCR扩增分别以筛选得到的菌株为模板。反应条件95°C预变性 5min，94°C变性 50s，52°C退火 lmin，72°C延伸 Imin 30s，反应 30 个循环。目的片断按照常规方法(Samtoook，et al.，2001)进行克隆和序列测定，测定结果与GenBank中所登录的16S rRNA序列(登录号NC_017912.1、NC_017061.1和NC_016784.1等)进行比对分析,基因同源性达到99%以上。根据《Bergey’s Mannual ofDeterminative Bacteriology)) (Holt, J. G. , Gibbons, N. E. , 1994)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英等，2001 )，通过性态特征和16S rRNA序列分析，确定菌株SC06为解淀粉芽孢杆菌。将该菌株进行保藏，保藏名称为解淀粉芽孢杆菌SC06 (Bacillusamyloliquefaciens SC06)，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉武汉大学；保藏日期=2012年7月11日，保藏号CCTCC No: M 2012280。实施例2、解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法解淀粉芽孢杆菌SC06接种于LB液体培养基中，30°C培养20小时后，离心取菌泥，60度恒温干燥至恒重、与玉米淀粉按4:1的重量比(B卩，玉米淀粉恒温干燥后的菌泥=4:1的重量比)混合而制成干菌粉，每克干菌粉中SC06活菌数为108cfu。实施例3、SC06可提高罗非鱼的抗氧化能力尼罗罗非鱼(吉福品系)由浙江跃腾水产食品有限公司提供，用2. 5%(质量浓度)的食盐水进行浸泡消毒，在浙江大学饲料科学研究所水产动物营养实验室暂养14d后，选取体重约2. 50g的健康的尼罗罗非鱼，采取单因子设计方案对照组和SC06组。每组3个平行重复，每个重复30尾鱼。实验鱼在密闭式过滤循环系统的水族箱(IOOcmX 50cmX 50cm)中饲养，实际水体积为200L，饲养水温25-28°C，AC0-318型空气压缩机24h增氧。每天9 00和19 00两次投饵(对照组为常规的尼罗罗非鱼饲料；SC06组为在常规的尼罗罗非鱼饲料的基础上每4天向水体中添加一次干菌粉，直至SC06在水体中的浓度为107CFU/mL)，日投饵率为体重的3.5%。每两周称重一 次，调节投饵量。每天观察鱼的健康状况，记录投饵量、死亡数量。本实验期间不换水，水源为充分曝气除氯的自来水。试验21d后进行相应的检测，具体如表I所述。结果表明，与对照组相比，SC06组(即SC06菌株添加组)的血清中CAT (过氧化氢酶)活性、T-AOC (总抗氧化能力)和MDA (脂质过氧化物)含量分别降低81. 64% (P<0. 05),61.99% (P〈0. 05)和 82. 14% (P〈0. 05)，超氧根阴离子自由基(02 —)活力升高31. 58% (P<0. 05), GSH-Px (谷胱甘肽过氧化物酶)基本不变。因此，SC06可有效提高罗非鱼机体中CAT和GSH-Px活性，对降低血清中脂质过氧化对机体造成的危害有重要的作用。表1、SC06对罗非鱼血清抗氧化指标的影响
权利要求
1.解淀粉芽孢杆菌，其特征是保藏名称解淀粉芽孢杆菌SC06 (Bacillus amyloliquefaciens SC06),保藏单位 中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉武汉大学；保藏日期2012年7月11日， 保藏号CCTCC No: M 2012280。
2.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的用途，其特征是用于抑菌或者用于提高动物的免疫能力。
3.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌的用途，其特征是所述动物为水生动物或畜禽。
全文摘要
本发明涉及一种有抑菌效果和提高动物免疫能力的解淀粉芽孢杆菌的筛选及应用。本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌，其保藏名称解淀粉芽孢杆菌 SC06 (Bacillus amyloliquefaciens SC06)，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国 武汉 武汉大学；保藏日期2012年7月11日，保藏号CCTCC No: M2012280。解淀粉芽孢杆菌 SC06接种于LB液体培养基中培养后，离心取菌泥，干燥至恒重，与玉米淀粉等混合后制成干菌粉；在动物的常规饲料中添加上述干菌粉，喂食动物；从而实现用于抑菌或者用于提高动物的免疫能力，动物是指水生动物或畜禽。
文档编号C12N1/20GK103045498SQ20121038296
公开日2013年4月17日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者李卫芬, 邓斌, 张小平, 黄琴, 姚江涛, 余东游 申请人:浙江大学