专利名称：脂肪细胞/肝细胞共培养模型进行降脂药物快速筛选的模型及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于细胞体外培养技术领域，具体涉及一种脂肪细胞/肝细胞共培养模型进行降脂药物快速筛选的模型及其应用
背景技术：
随着经济水平的发展，国民生活方式的改变，一系列脂代谢紊乱的疾病，如高脂血症、非酒精性脂肪肝、代谢综合征等疾病的发生率日趋上升。如2002年中国居民与健康状况调查结果显示我国血脂异常人数为I. 6亿人，而2007年发布的《中国成人血脂异常防治指南》则显示中国血脂异常现患率迅速攀升至18.6%。而近几年脂肪肝的发病率也迅速上
升，特别是在某些职业人群中(白领人士、出租车司机、职业经理人、个体业主、政府官员、高级知识分子等)脂肪肝的平均发病率为25% ;肥胖人群与II型糖尿病患者中脂肪肝的发病率为50%;嗜酒和酗酒者脂肪肝的发病率为58%。日趋严峻的脂质代谢紊乱疾病发病情况提示，临床现用的降脂药物效果并不理想，因此开发降脂药物的任务迫在眉睫。近年来越来越多的研究资料表明，肥胖是脂代谢紊乱疾病的独立危险因素，脂肪组织可能在其中发挥重要的作用。国内外大量研究结果表明脂肪组织不仅仅是能量储存器官，也是一个活跃的内分泌和旁分泌器官，能分泌多种脂肪细胞因子，如抵抗素、脂联素、白细胞介素_6、肿瘤坏死因子-α等。这些细胞因子共同作用于各个系统与组织，对机体的结构功能有重要的调节作用，特别是在调节机体糖脂代谢、维持能量及心血管功能的稳定、免疫应答等方面发挥着重要作用。已有研究证实，血浆低脂联素水平与脂质代谢紊乱如高甘油二酯和低HDL-C有普遍相关性，提示脂联素可能参与调节脂蛋白水平及其组成。另一方面有研究提出肥胖是一种低度的炎症性疾病或炎症状态，巨噬细胞与脂肪细胞相互作用改变了脂肪细胞因子如抵抗素等的分泌，最终导致代谢综合征和动脉粥样硬化发生、发展。临床研究亦显示肥胖患者体内脂肪细胞增生肥大，脂肪组织内T细胞和巨噬细胞明显增加，它们通过影响抵抗素和脂联素的分泌，进而导致多种脂质代谢紊乱疾病。而肝脏作为体内最重要的代谢器官，在脂类的消化、吸收、分解、合成及运输等代谢过程中均起重要作用。如肝脏是合成胆固醇的主要器官，占全身总合成量的3/4以上，其同时也可将胆固醇转化为胆汁酸，这是胆固醇降解的最重要途径。另外肝脏还参与除脂蛋白乳糜微粒外所有脂蛋白的合成过程，而且肝脏不但是合成脂蛋白的唯一部位同时降解脂蛋白的主要场所。考虑到脂肪组织与肝脏在机体脂质代谢中的重要地位，脂肪组织对肝脏脂质代谢的间接调控作用已日益受到人们的关注。目前调节脂质代谢紊乱药物体外评价模型主要以单细胞为主，如游离脂肪酸诱导的人肝癌细胞株/人正常肝细胞株非酒精性脂肪肝体外模型等；以及以酶学研究为基础的模型，如脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)、烷基辅酶A、胆固醇转移酶(ACAT)、胆固醇酯转移蛋白(CETP)、抑制LDL氧化修饰等分子水平模型。上述体外模型并不能较为全面的模拟体内脂质代谢情况，作为药物筛选的评价手段有所缺陷。而调节脂质代谢紊乱药物的体内动物模型评价方法主要采用如构建家兔高脂饮食诱发高血脂模型、大鼠高脂饮食诱发非酒精性脂肪肝模型等，动物模型虽然能够更为贴切的模拟脂质代谢异常的情况，但是周期长、花费大，不适合药物的前期发现阶段的快速评估研究。
发明内容
发明目的本发明提供一种能够快速筛选降脂药物的细胞模型。技术方案一种脂肪细胞/肝细胞共培养模型进行降脂药物快速筛选的模型，其特征在于其包括正常脂肪细胞与肝细胞共培养细胞和炎症脂肪细胞与肝细胞共培养细胞，上述两种模型分别按如下步骤制得A、正常脂肪细胞与肝细胞共培养细胞 取前3代的大鼠前体脂肪细胞，用O. 25 %胰酶消化后，在Mi 11 icel I双层培养室的下室中加入ImL密度为2 X IO5个/ml的前体脂肪细胞，待其贴壁后换为含5 μ g/mL的胰岛素、200pmol/L的T3，33 μ mo I/L的生物素及10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，每2-3天进行一次换液，8天后认为其已分化为大鼠脂肪细胞，将培养基换为含10%胎牛血清的DMEM培养基；再将ImL肝细胞以2X IO5个/ml的密度加入Millicell上层小室，将所用的培养基均换为含10%胎牛血清的DMEM培养基，置37°C，体积分数5%的CO2培养箱内培养，每2天更换一次新鲜的培养基； B、炎症脂肪细胞与肝细胞共培养细胞取前3代的大鼠前体脂肪细胞，用O. 25 %胰酶消化后，在Mi 11 icel I双层培养室的下室中加入ImL密度为2 X IO5个/ml的前体脂肪细胞，待其贴壁后换为含5 μ g/mL的胰岛素、200pmol/L的T3，33 μ mo I/L的生物素及10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，每2-3天进行一次换液，8天后认为其已分化为大鼠脂肪细胞，将培养基换为含10%胎牛血清及10ng/mL脂多糖的DMEM培养基，培养24小时后再将ImL肝细胞以2 X IO5个/ml的密度加AMillicell上层小室；将所用的培养基均换为含10%胎牛血清的DMEM培养基，置37°C，体积分数5%的CO2培养箱内培养，每2天更换一次新鲜的培养基。其中所述的Millicell双层培养室在上层和下层之间设置的半透膜的孔径为O. 4 μ m0上述的脂肪细胞/肝细胞共培养模型进行降脂药物快速筛选的模型的应用，其特征在于C、在步骤A获得的正常脂肪细胞与肝细胞共培养细胞中的脂肪细胞内，给予10-100 μ M的药物刺激24小时后，在培养箱中37°C，5% CO2静置培养48小时后，收集培养基及肝细胞裂解液进行指标的测定；其中检测指标为抵抗素2-9pg/mL、HMG-CoA还原酶8-13ng/mL、脂联素 1600_2400pg/mL、低密度脂蛋白受体 10. 5_17ng/mL ；D、在步骤B获得的炎症脂肪细胞与肝细胞共培养细胞中的脂肪细胞内，给予IO-IOOyM的药物刺激24小时后，在培养箱中37°C，5% CO2静置培养48小时后，收集培养基及肝细胞裂解液进行指标的测定；其中检测指标为抵抗素2-8pg/mL、白介素-6200-600pg/mL、肿瘤坏死因子 a 60_190pg/mL、HMG-CoA 还原酶 8-14. 5ng/mL、脂联素700-1400pg/mL、低密度脂蛋白受体 10_18ng/mL。有益效果I、本发明提供的脂肪细胞与肝细胞共培养体系，是在Millicell双层培养系统中，肝细胞贴壁培养在上层培养室的半透膜上，脂肪细胞贴壁培养在下层培养室的底面上；该培养体系是在体外条件下模拟脂肪组织对肝脏脂质代谢的调控作用；并以药物对细胞因子、酶和受体的影响，应用于降脂药物的快速筛选。本发明提供的脂肪细胞与肝细胞共培养体系作为筛选模型，与整体动物模型相t匕，具有快速培养的优点；与单种细胞模型相比，在保持了快速培养的基础上，不但同时提供多个调节脂质代谢的相关靶点用于筛选药物，又模拟了体内脂肪组织对肝脏脂质代谢的调控作用，有效避免了漏筛某些通过脂肪组织间接调控肝脏脂质代谢的药物。2、通过采用临床降脂一线用药辛伐他汀对该模型进行测试，我们认定药物作用 后，脂肪细胞和肝细胞共培养体系中各因子、酶和受体含量达到上述范围内即可认定该药物具有调节脂质代谢紊乱的作用。
图I为Millicell双层培养室中共培养的示意图，其中I为Millicell双层培养室的上层，2为Millicell双层培养室的下层；图2原代培养的大鼠前体脂肪细胞的形态学观察图，其中A为100倍显微镜下观察，B为200倍显微镜下观察；图3油红O染色鉴定大鼠脂肪细胞，其中A为大鼠前体脂肪细胞，B为大鼠成熟脂肪细胞；图4原代培养的大鼠肝细胞的形态学观察图，其中A为100倍显微镜下观察，B为200倍显微镜下观察。
具体实施例方式实施例中所述的百分比所指为，若是液体为体积百分比，固液为重量/体积百分比。实施例I :材料实验动物SD大鼠，体重200 ±20克。均为雄性，购于南京青紫兰实验动物有限公司。实验试剂Millicell双层培养室购于Millipore公司；血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白测定试剂盒购于南京威特曼生物科技有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶、PBS、DMEM培养基购于GIBCO公司；脂多糖、胰岛素、T3、生物素、胶原酶购于Sigma公司；青霉素、链霉素购于南京生兴生物科技有限公司；脂联素(APN)、抵抗素(REN)、白介素-6 (IL-6)、肿瘤坏死因子-a (TNF- α )、HMG-CoA还原酶(HMGR)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、ELISA试剂盒购于武汉优尔生物技术有限公司；10%胎牛血清的DMEM的配方每IOOmL DMEM培养基中加入IOmL胎牛血清。方法
I.脂肪细胞/肝细胞共培养细胞的建立I. I大鼠原代脂肪细胞的分离及诱导和大鼠原代肝细胞的分离脱颈椎处死雄性SD大鼠(180-220g)，于75%乙醇中浸泡消毒5-15min后，无菌条件下取腹股沟部、肾、附睾周围的脂肪组织，用含青霉素和链霉素的DMEM反复冲洗3次。再用剪刀将脂肪组织剪成Imm3小块，置于lmg/ml胶原酶中，37°C摇床IOOrpm消化l_3h。将含脂肪组织的消化液以IOOOrpm离心5min，去除漂浮的脂肪细胞及消化液液，沉积的细胞用红细胞裂解液再次配成细胞悬液，37°C孵育lOmin，IOOOrpm离心5min弃上清以去除污染的红细胞。此时再将沉积的细胞用DMEM配成细胞悬液，60目筛网过滤后，用DMEM洗涤并以lOOOrpm，5min离心2次.最后将沉积的细胞用含10%胎牛血清的DMEM制成细胞悬液，计数并以台盼蓝检测分离细胞的活性，调整细胞浓度以2X105个/ml接种于培养瓶中，置37°C，体积分数5%的CO2培养箱内培养，大鼠前体脂肪细胞形态学观察如图2所示。
采用台盼蓝染色法测定大鼠前体细胞的存活率为98± I %，结果表明，其细胞存活率满足体外培养的要求。取3代内生长良好的前体脂肪细胞，常规消化传代于培养瓶内，用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养24h后，用PBS液洗净，换用含5 μ g/mL的胰岛素、200pmol/L的T3，33 μ mo I/L的生物素及10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，每2_3天进行一次换液，分化5到8天的细胞，用油红O染色鉴定其为已分化成熟的脂肪细胞后(见图3)，确定分化8天的细胞为成熟的脂肪细胞，即可进行后续试验。选用正常雄性SD大鼠，以10%水合氯醛(300μ L/100g)麻醉后固定体位、消毒，依次打开皮肤、腹腔暴露门静脉和下腔静脉，打开胸腔下腔静脉胸段后插入静脉套管针以动脉夹固定，剪开门静脉，同时排空套管针内的空气，向肝脏灌注37°C预热的HEPES缓冲液，流速30mL/min。灌注15-20分钟后肝脏逐渐变为灰白色即刻停止灌注，换用37°C预热的0. 02%含钙(0. 06% )胶原酶灌注，流速为15mL/min，待看到肝脏表面出现囊泡或者裂痕时立即停止灌注，小心将肝脏取下放入盛有HEPES缓冲液的烧杯中轻轻冲洗一遍，然后将肝脏转移至一个盛有无血清DMEM培养基的烧杯中，用无菌镊子撕破肝脏表面的纤维膜，并不断抖动以抖落肝细胞。细胞悬液以200目筛网过滤。取过滤后的肝细胞以500rpm离心IOmin,弃上清,加入无血清DMEM培养基重新吹打细胞至悬浮后500rpm离心IOmin,弃上清。重复上述步骤两次将离心速度变为800rpm离心3min以清洗残留的胶原酶。用含10%胎牛血清的DMEM重悬细胞，计数并以台盼蓝检测分离细胞的活性，调整细胞密度至2 X IO5个/mL，接种到培养瓶，置37°C，体积分数5%的CO2培养箱内培养。原代培养的大鼠肝细胞形态观察结果如图4所示。采用台盼蓝染色法测定大鼠肝细胞的存活率为95±2%，结果表明，其细胞存活率满足体外培养的要求。I. 2脂肪细胞(正常)/肝细胞共培养细胞的建立取前3代的大鼠前体脂肪细胞，用0. 25%胰酶消化后，在Millicell (中间半透膜的微孔直径为0.4 μ m)双层培养室的下室中加入ImL密度为2X IO5个/ml的前体脂肪细胞，待其贴壁后换为含5 μ g/mL的胰岛素、200pmol/L的Τ3，33μπι01/1的生物素及10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，每2-3天进行一次换液，8天后认为其已分化为大鼠脂肪细胞，将培养基换为含10%胎牛血清的DMEM培养基。此时再将ImL肝细胞以2Χ IO5个/ml的密度加入Millicell上层小室。此时将所用的培养基均换为含10%胎牛血清的DMEM培养基，置37°C，体积分数5%的CO2培养箱内培养，每2天更换一次新鲜的培养基。I. 3脂肪细胞(炎症)/肝细胞共培养细胞的建立取前3代的大鼠前体脂肪细胞，用O. 25 %胰酶消化后，在Mi 11 ice11 (中间、半透膜的微孔直径为0.4 μ m)双层培养室的下室中加入ImL密度为2X IO5个/ml的前体脂肪细胞，待其贴壁后换为含5 μ g/mL的胰岛素、200pmol/L的Τ3，33μπι01/1的生物素及10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，每2-3天进行一次换液，8天后认为其已分化为大鼠脂肪细胞，将培养基换为含10%胎牛血清及10ng/mL脂多糖的DMEM培养基，培养24小时后再将ImL肝细胞以2 X IO5个/ml的密度加入Millicell上层小室。此时将所用的培养基均换为含10%胎牛血清的DMEM培养基，置37°C，体积分数5%的CO2培养箱内培养，每2天更换一次新鲜的培养基。2.采用共培养模型对部分样品进行初步筛选 受试样品如下甘草次酸、小檗碱、儿茶酚，将上述样品以适量二甲基亚砜助溶，用DMEM培养基稀释成浓度分别为ImM的溶液，O. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌，得到样品溶液。对照组加入等量的助溶剂(二甲基亚砜)。米用上述两种共培养模型，置37°C,体积分数5%的CO2培养箱内培养24h后，吸弃上下小室的培养基，下室加入含不同浓度样品(25-100 μ M，二甲基亚砜助溶)的DMEM培养基lmL，以辛伐他汀(10 μ M7DMSO助溶)为阳性对照组，阴性对照组加入等量的助溶剂二甲基亚砜刺激24h后，再培养48h后，测定培养基中APN、REN、IL_6、TNF-α以及肝细胞裂解液中HMGR、LDLR的含量。APN、REN、IL-6、TNF- a ,HMGR及LDLR含量的测定均采用ELISA试剂盒，按说明书操作测定。同时将大鼠原代肝细胞，置37°C，体积分数5%的CO2培养箱内培养24h后，吸弃培养基，加入含不同浓度样品(25-100 μ M，二甲基亚砜助溶)的DMEM培养基刺激24h后，再培养48h后，测定肝细胞裂解液中HMGR、LDLR的含量，并将此单细胞筛选的结果与共培养模型筛选结果相互比较。3.采用高脂膳食诱导的大鼠脂肪肝模型对筛选的药物进行体内验证60只SD大鼠正常喂养I周后，随机分为6组，每细10只。正常组给予普通饲料；模型组为高脂饲料喂养，即普通饲料基础上加1%胆固醇和10%猪油；辛伐他汀组在高脂饲料喂养的同时分别给予辛伐他汀40mg/kg，受试样品组在高脂饲料喂养的同时分别给予样品80mg/kg灌胃，每日一次。实验动物自由饮水和进食，分笼饲养于明暗各12小时，25±2°C的SPF级动物实验室内。实验第8周后，禁食16小时后，股动脉采血，脱颈椎处死，取出肝脏，按常规制备血清、肝组织匀浆。检测血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白及 APN、REN、IL-6、TNF- α、HMGR、LDLR 含量。结果I.样品对脂肪细胞(正常)/肝细胞共培养细胞的作用结果显示阳性对照药物辛伐他汀可以有效升高共培养模型中APN的含量，降低REN的含量；同时通过对脂肪细胞的调控，间接降低了肝细胞内HMGR的含量，升高了 LDLR的含量。所筛选的三种样品中，甘草次酸及小檗碱的药效结果与辛伐他汀相似，均可以有效升高共培养模型中APN的含量，降低REN的含量；同时通过对脂肪细胞的调控，间接降低了肝细胞内HMGR的含量，升高了 LDLR的含量，而儿茶酚则无此作用(结果见表I)。表I样品对脂肪细胞(正常)/肝细胞共培养细胞中细胞因子和酶活性的影响(Mean 土 SD, η = 3)
,W&APNRENHMGRLDLR
另丨J
…μ Mpg/mLPgAnLng/mLng/mL
~空白组~ 1025. 73 + 99. 94~12.96 + 1.05~17. 63±1. 388. 74 + 0. 56
共培养组 - 1087. 19±73. 33 13. 13±0. 77 17.82±1.658.89±0.82
阴性对照组 - 1056.28± 101. 27 13. 26±1·02 16. 96±0·988·37±0. 74
辛伐他汀组 10 2365. 42±173. 98** 2. 25±0.09“ 8. 26±0·97“16·79±1.20**
25 1546. 32±89.65* 6.87±1.26* 12.49±1.64*11.26±1.55*
甘草次酸组 50 1679. 45± 114. 21* 5. 46±O. 74** 10. 52±1·32**12. 54±1·29*
100 2054. 84± 112. 76“ 4. 89±0. 52” 9. 37±0. 86“14. 99±0. 9(Γ
251782.46±199.25*8.60±0. 74*14·89±1.6410.24±1.31
小檗碱组 501963. 25±79. 97*·4. 53±0. 96**11. 65土 I. 28“10. 97±0. 88*
1002254. 28±99. 47“4. 06±0. 73”9_63±0. 87“14. 46± I. 43“
25 898.25±94.3613.09±0.4714. 73±1.36 9.24±0. 73儿茶酚组 501001. 28± 137. 6512. 16±0. 6914. 04±1.7810. 60±0. 72__100999. 72±115. 6412·58±1.0413. 21 士 I. 0910. 99±1. 37注与共培养组相比，*Ρ< O. 05，< O. 01。2.样品对脂肪细胞(炎症)/肝细胞共培养细胞的作用结果显示阳性对照药物辛伐他汀可以有效升高共培养模型中APN的含量，降低IL-6、TNF-α及REN的含量；同时通过对脂肪细胞的调控，间接降低了肝细胞内HMGR的含量，升高了 LDLR的含量。所筛选的三种样品中，甘草次酸及小檗碱的药效结果与辛伐他汀相似，均可以效升高共培养模型中APN的含量，降低IL-6、TNF_a及REN的含量；同时通过对脂肪细胞降低了肝细胞内HMGR的含量，升高了 LDLR的含量，而儿茶酚则无此作用(结果见表2)。表2样品对脂肪细胞(炎症)/肝细胞共培养模型中细胞因子和酶活性的影响(Mean 土 SD, η = 3)
权利要求
1.脂肪细胞/肝细胞共培养模型进行降脂药物快速筛选的模型，其特征在于其包括正常脂肪细胞与肝细胞共培养细胞和炎症脂肪细胞与肝细胞共培养细胞，分别按如下步骤制得: A、正常脂肪细胞与肝细胞共培养细胞 取前3代的大鼠前体脂肪细胞，用O. 25 %胰酶消化后，在Mi 11 ice11双层培养室的下室中加入ImL密度为2X IO5个 /ml的前体脂肪细胞，待其贴壁后换为含5 μ g/mL的胰岛素、200pmol/L的T3，33 μ mo I/L的生物素及10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，每2-3天进行一次换液，8天后将培养基换为含10%胎牛血清的DMEM培养基；再将ImL肝细胞以2X IO5个/ml的密度加入Millicell上层小室，将所用的培养基均换为含10%胎牛血清的DMEM培养基，置37°C，体积分数5%的CO2培养箱内培养，每2天更换一次新鲜的培养基； B、炎症脂肪细胞与肝细胞共培养细胞 取前3代的大鼠前体脂肪细胞，用O. 25 %胰酶消化后，在Mi 11 icel I双层培养室的下室中加入ImL密度为2 X IO5个/ml的前体脂肪细胞,待其贴壁后换为含5 μ g/mL的胰岛素、200pmol/L的T3，33 μ mo I/L的生物素及10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，每2-3天进行一次换液，8天后将培养基换为含10%胎牛血清及10ng/mL脂多糖的DMEM培养基，培养24小时后再将ImL肝细胞以2 X IO5个/ml的密度加入Millicell上层小室；将所用的培养基均换为含10%胎牛血清的DMEM培养基，置37°C，体积分数5%的CO2培养箱内培养，每2天更换一次新鲜的培养基； 其中所述的Millicell双层培养室在上层利下层之间设置的半透膜的孔径为O. 4 μ m。
2.根据权利要求I所述的脂肪细胞/肝细胞共培养模型进行降脂药物快速筛选的模型的应用，其特征在于 A、在权利要求I步骤A获得的正常脂肪细胞与肝细胞共培养细胞中的脂肪细胞内，给予10-100 μ M的药物刺激24小时后，在培养箱中37°C，5% CO2静置培养48小时后，收集培养基及肝细胞裂解液进行指标的测定；其中检测指标为抵抗素2-9pg/mL、HMG-CoA还原酶8-13ng/mL、脂联素 1600_2400pg/mL、低密度脂蛋白受体 10. 5_17ng/mL ； B、在权利要求I步骤B获得的炎症脂肪细胞与肝细胞共培养细胞中的脂肪细胞内，给予10-100 μ M的药物刺激24小时后，在培养箱中37°C，5% 0)2静置培养48小时后，收集培养基及肝细胞裂解液进行指标的测定；其中检测指标为抵抗素2-8pg/mL、白介素-6200-600pg/mL、肿瘤坏死因子 a 60_190pg/mL、HMG-CoA 还原酶 8-14. 5ng/mL、脂联素700-1400pg/mL、低密度脂蛋白受体 10_18ng/mL。
全文摘要
本发明属于细胞体外培养技术领域，分别建立了脂肪细胞(正常)/肝细胞共培养模型和脂肪细胞(炎症)/肝细胞共培养模型，应用于降脂药物的快速筛选。本发明提供的脂肪细胞与肝细胞共培养体系，是在Millicell双层培养系统中，肝细胞贴壁培养在上层培养室的半透膜上，脂肪细胞贴壁培养在下层培养室的底面上；该培养体系是在体外条件下模拟脂肪组织对肝脏脂质代谢的调控作用；并以药物对细胞因子、酶和受体的影响，应用于降脂药物的快速筛选。
文档编号C12N5/071GK102864121SQ201210382919
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者李妤, 尚靖, 陈鑫 申请人:中国药科大学