专利名称：与黄瓜果瘤基因Tu紧密连锁的分子标记的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域的分子标记，特别涉及两个与黄瓜果瘤基因Tu紧密连锁的分子标记。
背景技术：
黄瓜(Cucumissativus L.)是葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属(Cucumis) —年蔓生的草本植物，原产温暖湿润的喜马拉雅山南麓的印度北部地区，传入我国栽培已有2000多年的历史，我国是黄瓜的次生起源中心。黄瓜作为世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我国主栽蔬菜作物之一。果实是黄瓜经济性状最重要的部分，黄瓜果实属于瓠果，由子房和花托共同发育 而成。在黄瓜果实上有一个重要的性状是果瘤,果瘤是黄瓜果实表面的瘤状突起。果瘤基因的研究始于1913年,有果瘤是黄瓜的野生性状,果瘤性状是由Tu (Tuberculate fruit)基因调控，有果瘤(Tu)为显性，无果瘤(tu)为隐性。2009年张微微等利用247个&群体将果瘤基因初步定位于第五染色体SSR标记16203和SCAR标记C_SC933之间，遗传距离分别为
I.4cM和 5. 9cM,详细结果可以参看；Zhang W W等在《Theoretical and Applied Genetics))(理论应用遗传学)2009年第120卷第3期645-654页发表的题为《Identificationand mapping of molecular markers linked to the tuberculate fruit gene in thecucumber (Cucumis sativus L.)》(黄瓜果瘤基因紧密连锁分子标记初步定位)一文,上述标记还存在分析群体相对较小，连锁距离相对较远等问题。黄瓜育种中发现黄瓜果实均有刺，但是有些品种果实上没有果瘤，刺和瘤是两个不同的性状，刺的形成是由Gl基因决定的，而Tu基因决定瘤的形成，虽然刺和瘤性状是由不同的基因决定的，但有研究表明刺对于瘤具有隐性上位作用，曹辰兴分离群体的遗传分析结果表明控制茎、叶、果实表皮毛性状的无毛基因对控制果瘤性状的果瘤基因存在隐性上位作用(曹辰兴等.黄瓜茎叶无毛性状与果实瘤刺性状的遗传关系.园艺学报，2001，28(6) :565-566)。因此，果瘤基因Tu的研究将有助于揭示黄瓜果刺基因形成的分子机制，为黄瓜遗传和育种工作奠定基础。随着生物技术水平的不断发展，克隆目的基因的方法也层出不穷，图位克隆方法利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因定位到染色体的一个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因。SSR(Simple Sequence Repeats)标记具有稳定性好、多态性高和广泛适用的优点，找到与果瘤基因Tu紧密连锁的标记，可为下一步图位克隆这个基因打下坚实的基础。随着人们生活水平的提高，品质育种已提到重要位置。黄瓜果实刺瘤性状属于感观品质范畴。欧美温室类型的黄瓜为无果瘤、少刺的果皮，称其为水果黄瓜，其市场价格为普通黄瓜的2-3倍。外观光滑黄瓜污染少，清洗方便，食用卫生，是无公害蔬菜的理想品种。经检测表明无瘤少刺黄瓜果肉农药残留量比有刺黄瓜低27%，果皮农药残留量低18%。黄瓜果瘤基因Tu控制果瘤的形成，它的研究将会推动品质育种进程。用与目的性状紧密连锁的分子标记进行标记辅助选择在黄瓜遗传育种中是十分有效的方法，分子标记是在DNA水平上对目标性状进行选择，具有高效、快速、不受环境条件限制等优点，可在苗期进行选择，加快了育种的进程。
发明内容
本发明的目的，在于克服现有技术的不足，提供两个与黄瓜果瘤基因Tu更紧密连锁的分子标记。本发明是通过以下技术方案实现的一个与黄瓜果瘤基因Tu紧密连锁的分子标记，命名为Y32，由SEQ ID NO. I所示的DNA片段和SEQ ID NO. 2所示的DNA片段组成；其中SEQ ID NO. I所示的DNA片段与果瘤基因Tu连锁，SEQ ID NO. 2所示的DNA片段与无瘤基因tu连锁。
上述与黄瓜果瘤基因Tu紧密连锁的分子标记，由SEQ ID NO. 5所示的上游引物和SEQ ID NO. 6所示的下游引物扩增得到。该引物由上海生工合成。一个与黄瓜果瘤基因Tu紧密连锁的分子标记，命名为Y46，由SEQ ID NO. 3所示的DNA片段和SEQ ID NO. 4所示的DNA片段组成；其中SEQ ID NO. 3所示的DNA片段与果瘤Tu连锁，SEQ ID NO. 4所示的DNA片段与无瘤基因tu连锁。上述与黄瓜果瘤基因Tu紧密连锁的分子标记，由SEQ ID NO. 7所示的上游引物和SEQ ID NO. 8所示的下游引物扩增得到。该引物由上海生工合成。本发明利用分子标记和染色体步移法，提供两个与黄瓜果瘤基因Tu更紧密连锁的稳定的SSR分子标记，果瘤基因Tu在提供的两个分子标记之间，遗传距离在O. 5cM之内，物理距离仅50Kb左右；由于所有两个分子标记的开发均与已知的黄瓜基因组序列相关，由此而获得的两个分子标记之间的物理图谱将有利于Tu基因的最终克隆，便于分子标记辅助育种体系的建立。本发明的分子标记可简便、快速、高通量地应用于育种实践。
图I是Y32的PCR扩增结果标记图；S52为有瘤亲本；S06为无瘤亲本R代表两亲本杂交后代；F2随机扩增代表在F2群体中随机挑选的19有瘤或无瘤植株PCR扩增结果。下面的条带代表与果瘤基因Tu连锁，上面的条带代表与无瘤基因tu连锁。图2是Y46的PCR扩增结果标记图；S52为有瘤亲本；S06为无瘤亲本R代表两亲本杂交后代；F2随机扩增代表在F2群体中随机挑选的19有瘤或无瘤植株PCR扩增结果。下面的条带代表与果瘤基因Tu连锁，上面的条带代表与无瘤基因tu连锁。图3是黄瓜果瘤基因Tu的染色体步移示意图Y32与Υ46代表与Tu基因紧密连锁的分子标记，SSR16203与C-SC933代表已经公布的标记。拼接用到的是已经公布的黄瓜品种基因组序列(http://cucumber, vcru. wise, edu/wenglab/gyl4-9930/index, html)使用的是 gyl4 品种的 Scaffold02633、Scaffold00154 和 9930 品种的 Scaffold000083、Scaffold000234中的序列，拼接后的序列总长度为1300kb。X代表F2群体剩余的交换株。
具体实施方式
一、遗传分离群体的构建与交换单株的鉴定UF2群体的构建欧洲温室类型自交系S06(母本)，表面光滑无果瘤，白刺较细小；华南类型自交系S52(父本)，表面有果瘤，黑刺较粗大，S06自交系和S52自交系已在《自然科学进展》2005年“黄瓜SRAP遗传连锁图的构建及始花节位的基因定位”一文中公开(潘俊松等.黄瓜SRAP遗传连锁图的构建及始花节位的基因定位.自然科学进展，2005，15，167-172)。本实施例利用这两个亲本配制了杂交组合，F1为有果瘤，黑刺较粗大，F1代自交产生F2代群体。在2200株F2个体中，鉴定有/无果瘤表型,卡方分析法进行验证。2、交换单株的筛选 2. I黄瓜基因组DNA的提取常规方法一CTAB法提取亲本及F2分离群体的叶片总DNA。2. 2标记扫描F2分离群体利用已经公开的与Tu基因连锁的分子标记SSR16203和SCAR标记C_SC933和本发明中开发的两个分子标记(Y32、Y46)扫描上述获得的F2分离群体，寻找标记基因型(通过分析显隐亲本获得)与性状表现型(有瘤/无瘤)的差别单株，获得标记与Tu基因的交换单株。PCR 体系基因组 DNA 30ng，引物 O. 2ymol/L，200ymol/L dNTPs, 2mmol/L MgCl2,I X Taq缓冲液，O. 5U TaqDNA聚合酶，总反应体系为10 μ L，其中TaqDNA聚合酶购于Promega公司。PCR扩增程序为-MV 5min ；35cycles,94°C 30s ；55°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。上述PCR产物检测方法为标记C_SC933使用3%琼脂糖凝胶电泳显示结果；其余(SSR16203、Y32、Y46)PCR产物使用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液为lXTBE，50W恒功率，电泳lh。电泳后进行银染。银染方法为将带胶的玻璃板放入固定液中，在摇床上轻轻摇动至指示剂颜色褪去，其中固定液的组成为冰醋酸、无水乙醇、蒸馏水的体积比为I : 10 100 ;用超纯水洗Imin 3min ;将冲洗后的胶板放入染色液中摇动半小时，其中染色液的组分为2g/L硝酸银；将染色后的胶板放入超纯水中漂洗5s后放入装有显影液的塑料盒中，轻轻摇动至条带清晰，放入自来水中冲洗3min;室温下干燥，干燥后拍照，其中显影液是在IL蒸馏水中加入15gNaOH和3ml甲醛混匀得到的。2. 3多态性片段的回收、克隆和测序将多态性片段从聚丙烯酰胺凝胶上切下，置于离心管中，用枪头捣碎，加入超纯水冲洗三遍，然后加入IOul超纯水95°C水浴15min，快速离心取上清液，用相对应的SSR引物进行PCR扩增，PCR反应体系为目标条带DNA 5ul，引物O. 5 umol/L，200umol/L dNTPs,IXTaq Buffer, I. 5mmol/L MgCl2, 2U Taq DNA 聚合酶，总反应体系为 50ul，其中 TaqDNA聚合酶购于Promega公司。目标条带PCR扩增程序为94°C 5min ；35cycles,94°C 30s ；50°C 30s ；72°C Imin ；72°C 5min。将 PCR 产物中加入 goldview 荧光染料 3ul，4°C 下放置IOmin让染料同DNA结合，然后加入上样缓冲液2ul，混匀后通过I %琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切下目标片段放入I. 5ml的离心管中，用DNA回收试剂盒回收，其中DNA回收试剂盒为上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，产品号为Cat. No. SK1132。将回收产物与载体连接采用上海申能博彩公司的PUCm-T vector系统。用电击法将连有目标片段的T-vector转化进入E. coli DH5 α感受态细胞，将菌液均匀涂布于LB固体培养基的平板上，涂好的平板倒置于37°C培养箱培养过夜，挑菌、摇菌及PCR菌液检测，进行相关序列的测定。二、染色体步移与标记开发I、黄瓜基因组序列的兼并拼接利用已经公布的黄瓜品种9331和gyl4黄瓜基因组序列(http://cucumber, vcru.wise, edu/wenglab/gy 14-9930/index, html),将 SSR 分子标记 16203 序列扫描黄瓜基因组9930数据库中得到Scaffold000083，将Scaffold000083的末端序列扫描黄瓜基因组gyl4数据库得到Scaffold02633，将Scaffold02633的末端序列扫描黄瓜基因组9930数据库得到Scaffold000234，将Scaffold000234的末端序列扫描黄瓜基因组gyl4数据库得到 Scaffold00154。Scaffold00154 序列中含有 SCAR 标记 C_8C69 序列，用 DNAMAN 软件对这4个Scaffold序列比对，兼并拼接得到SCAR标记C_SC69和SSR标记16203之间总长度1300Kb的序列。·
2、遗传分子标记的开发本发明通过SSR分析软件对获得的1300Kb序列进行扫面分析，对获得的SSR位点用弓I物设计软件Primer Premier5. O对设计引物,在两亲本间进行PCR扩增并使用6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。找出具有多态性的标记，再次筛选用SSR标记16203和SCAR标记C_SC933获得的2200株群体里的交换株。位于基因两侧的多态性标记向交换株逐渐减少的方向步移，最后距尚果瘤基因Tu两侧最近的2个SSR位点在两未本间广生差异(图I和图2)，随后对其进行测序并获得SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2及SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 4中的序列信息，这两个标记分别命名为Y32和Y46，标记Y32和Y46在2200株大群体中剩余的交换株分别剩余4株和2株。所有SSR标记PCR反应体系均为；黄瓜DNA 20ng,双向引物各0.2“11101/1，20(^11101/1(1见138，211111101/11%(12，1\了&9缓冲液，0· 5UTaqDNA聚合酶，总反应体系为10 μ 1，其中TaqDNA聚合酶购于Promega公司。扩增程序为94°C 3min ；35cycles,94°C 20s, 55°C 30s, 72°C 30s ；72°C 5min。以上两个新开发的分子标记经过分离群体验证，均与Tu基因位点紧密连锁(图3，图中X表示剩余的交换株)。由于都是特异性PCR扩增，故这些标记具有高稳定。利用这些标记构建的高密度遗传和物理图谱，将有助于黄瓜果瘤基因Tu的最终克隆。本发明利用果瘤亲本S52和无果瘤亲本S06杂交获得F1, F1再自交获得2200株F2分离群体。利用已经公布的黄瓜品种9930和gyl4黄瓜基因组序列(http://cucumber,vcru. wise, edu/wenglab/gyl4-9930/index, html)，能够将 SCAR 标记 C_SC933 和 SSR 标记16203之间的序列兼并拼接。拼接所用的gyl4黄瓜基因组序列有Scaffold02633、Scaffold00154，拼接所用的 9930 黄瓜基因组序列有Scaffold000083、Scaffold000234,拼接后的序列总长度为1300kb。首先用已经公布的SCAR标记C_SC933和SSR标记16203筛选该扩大的群体，找出交换株。然后再用SSR分析软件找出SSR位点，设计引物软件，对1300kb序列分析设计了大量引物，找出亲本间有多态性的引物，对交换株进行筛选和染色体步移，最后确定最近的两侧标记在Tu/tu基因位点间分别还有4和2个交换单株。上述黄瓜染色体步移的详细情况如图3所示。本发明中涉及的分子标记SSR标记16203和SCAR标记C_SC933已公开。详细参看Zhang W W 等在《Theoretical and Applied Genetics))(理论应用遗传学)2009 年第 120卷第 3 期 645-654 页发表的题为《Identification and mapping of molecular markerslinked to the tuberculate fruit gene in the cucumber (Cucumis sativus L.)))(黄瓜果瘤基因紧密连锁分子标记定位)一文。本发明中PCR产物克隆测序中所使用的E. coli DH5 α菌株已在文献《李欣，等。电转化法制备高转化效率的Ε. coli感受态细胞研究。食品与生物技术学报，2007，26 (6) 48 51》中公开；本发明中涉及的Ε. coli DH5a菌株可通过公开市售的商业渠道取得，购于宝生物工程(大连)有限公司，公司地址大连经济技术开发区东北二街19号。
权利要求
1.一个与黄瓜果瘤基因Tu紧密连锁的分子标记，命名为Y32，由SEQ ID NO. I所示的DNA片段和SEQ ID NO. 2所示的DNA片段组成；其中SEQ ID NO. I所示的DNA片段与果瘤基因Tu连锁，SEQ ID NO. 2所示的DNA片段与无瘤基因tu连锁。
2.根据权利要求I所述的与黄瓜果瘤基因Tu紧密连锁的分子标记，其特征在于由SEQ ID NO. 5所示的上游引物和SEQ ID NO. 6所示的下游引物扩增得到，其PCR扩增程序为94°C 5min ；35cycles,94°C 30s ；55°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。
3.一个与黄瓜果瘤基因Tu紧密连锁的分子标记，命名为Y46，由SEQ ID NO. 3所示的DNA片段和SEQ ID NO. 4所示的DNA片段组成；其中SEQ ID NO. 3所示的DNA片段与果瘤基因Tu连锁，SEQ ID NO. 4所示的DNA片段与无瘤基因tu连锁。
4.根据权利要求3所述的与黄瓜果瘤基因Tu紧密连锁的分子标记，其特征在于由SEQ ID NO. 7所示的上游引物和SEQ ID NO. 8所示的下游引物扩增得到，PCR扩增程序为 940C 5min ；35cycles,94°C 30s ；55°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。
全文摘要
两个与黄瓜果瘤基因Tu紧密连锁的分子标记，第一个命名为Ｙ32，由SEQ ID NO.1所示的DNA片段和SEQ ID NO.2所示的DNA片段组成；其中SEQ ID NO.1所示的DNA片段与果瘤基因Tu连锁，SEQ ID NO.2所示的DNA片段与无瘤基因tu连锁。第二个命名为Ｙ46，由SEQ ID NO.3所示的DNA片段和SEQ ID NO.4所示的DNA片段组成；其中SEQ ID NO.3所示的DNA片段与果瘤基因Tu连锁，SEQ ID NO.4所示的DNA片段与无瘤基因tu连锁。本发明的两个分子标记Y32和Y46与已经公开的SCAR标记C_SC69和SSR标记16203相比，与Tu基因位点的连锁更加紧密，已经将Tu基因定位在50Kb区间，对关于有瘤/无瘤的黄瓜分子标记辅助育种体系的建立更有帮助。
文档编号C12N15/11GK102925435SQ201210382890
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者杨绪勤, 潘俊松, 何欢乐, 蔡润, 李月 申请人:上海交通大学