专利名称：一株基因改性的高效解磷工程菌及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及微生物和基因工程技术领域中的一株经基因工程技术改性(本文中改性含义与改造相同)的高效解磷细菌及其在制备生物肥料中的微生物肥料中的应用。
背景技术：
磷是限制植物生长的主要营养元素之一，其在土壤中主要以难溶的矿物态存在。溶磷微生物在土壤磷循环相关的生物学系统中担任着重要的角色，它们可以将难溶性无机磷转化为可溶性磷(如磷酸一氢钙等)，提高作物对磷的利用率。但植物根围的解磷微生物通常数量不足，难以发挥其效用。因此，有必要从自然环境中筛选出高效解磷菌株，制成菌剂后再施入土壤中以促进植物对磷的吸收利用。
由于芽孢杆菌具有抗逆性强，在土壤中容易定殖，适宜工业化生产等优点，目前通过注册的商品化微生物菌肥中有很多都是芽孢杆菌(Bacillus)。微生物溶解无机磷的机理较为复杂，许多微生物的解磷过程与细胞内有机酸的合成密切相关，弱酸性环境可促进难溶磷酸钙溶解。基因工程技术是把外源基因导入到宿主菌细胞，有目的的改造宿主菌的遗传形状的一种方法，通过此方法构建的工程菌株，可以在分子的水平上定向的改变菌株的遗传特性。目前，国内外对解磷细菌的研究大量集中在解磷细菌的菌株筛选、对比、诱变、以及机理初探方面，对基因解磷机理的研究很少，解磷细菌的基因工程育种仅限于一些零星的、基础性的研究报道。尽管分子育种是新型解磷菌选育的发展方向，但目前尚未见到利用基因工程技术对解磷微生物进行改造的报道。与本发明相关的现有技术如下现有技术一“一种解磷真菌及其在制备生物菌肥中的应用”(中国专利文献，申请号201010590115. 2)。该发明米用常规方法从云南省晋宁县磷矿厂矿土中利用解磷微生物筛选培养基，筛选获得解憐真菌Penicillium oxalicum Mo-Po菌株。其利用Mo-Po菌株堆肥发酵烟草废弃物制备的生物菌肥能作为各种蔬菜种植中的基肥，在土壤含磷量较高的农田里能够作为化学磷肥的替代品。其缺点是筛选解磷真菌时采集的样品来源范围小，使得筛选的解磷真菌的种类较少，且在传代的过程中容易蜕化，在进一步的纯化过程中容易失去解磷能力。此外，该发明所用的筛选方法为常规方法，未涉及利用基因工程技术对解磷菌进行遗传改造。现有技术二 “一株具有解磷作用的枯草芽孢杆菌及其应用”(中国专利文献，申请号201010532768. 5)。该发明从山东省济宁市田间土壤中分离到一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis XF-8)，该菌株能产生中性植酸酶，对有机磷具有解磷作用。其缺点为所使用的枯草芽孢杆菌只对土壤有机磷具有解磷作用，对难溶性无机磷无效。此外，该发明未涉及利用基因工程技术对解磷菌株进行遗传改造。现有技术方案三“芽孢杆菌解磷工程菌株的构建”(中国专利文献，申请号02145369. I)。该发明应用诱变效率高、突变幅度大的新型诱变技术一离子束注入方法构建工程菌，使芽孢杆菌分解有机磷和无机磷的能力增强。其缺点为得到的工程菌利用的是物理诱变技术，此技术一方面产生的有益突变频率低，另一方面难以有效的控制变异的方向和性质。此外，该发明也未涉及利用基因工程技术对解磷菌进行遗传改造。
发明内容
本发明的目的是提供一株对土壤中的无机磷具有较好的溶解效果的高效解磷工程菌。本发明所提供的高效解磷芽孢杆菌，为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089。所述解淀粉芽抱杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089是革兰氏阳性杆菌，顶端生芽孢；在Yro培养基上生长良好，48h形成直径2-3mm大小的圆形菌落，有运动性，好氧，菌落呈白色有光泽，表面湿润、平坦，边缘整齐；生长温度范围 250C _37°C，最适生长温度30°C -37°C ;生长酸碱度范围pH 2-9，最适pH值为7.0。本发明进一步提供一种高效解磷微生物菌剂，其活性成分为前述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57H1CGMCC No. 6089的发酵液或发酵液干燥得到的固体菌剂。该高效解磷微生物菌剂，为所述发酵液与草炭、轻质碳酸钙经混合、粉碎得到的，三者混合比例为1:3-5:0. 03-0. 05，优选1:4:0. 04 (重量比)。本发明还提供一种构建解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57H1CGMCC No. 6089的方法，包括以下步骤I)选定一株能解憐的芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57,其 16S rDNA序列如序列表中序列I所示；2)在序列表中序列2所示的葡萄糖脱氢酶基因(gdh)的5’端添加枯草杆菌蛋白酶E基因启动子(PsubE)，在3’端添加枯草杆菌蛋白酶E基因转录终止子(TsubE)，得到序列表中序列3所示的葡萄糖脱氢酶基因的完整表达元件，然后将其克隆到芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒PHY300PLK的BamH I和Sal I酶切位点之间，得到携带葡萄糖脱氢酶基因完整表达元件的芽孢杆菌表达载体PHYH ；3)将携带葡萄糖脱氢酶基因完整表达元件的芽孢杆菌表达载体pHYH通过电击转化方法导入芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57中,得到基因改造的高效解磷工程菌即解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089。本发明进一步提供一种得到解淀粉芽孢杆菌(BaciIIus amyloliquefaciens)PS57CGMCC No. 6089的发酵液的方法，包括以下步骤I)配制无机磷细菌液体培养基，配方为葡萄糖10g，硫酸铵0. 5g，酵母粉0. 5g，氯化钠0. 3g,氯化钾0. 3g,硫酸镁0. 3g,硫酸亚铁0. 03g,硫酸猛0. 03g,磷酸韩5g,蒸懼水IOOOmL, pH 7. 0-7. 5，将培养基在使用前用常规方法115°C灭菌30min ；2)将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089 按5%的比例接种于步骤I)的无机磷细菌液体培养基中，在摇瓶转速180-200r/min下培养20-24h，得到PS57H1发酵液。本发明还提供一种制备所述高效解磷微生物菌剂的方法，将前PS57H1发酵液与高温灭菌后的草炭、轻质碳酸钙按照重量比1:4:0. 04的比例在搅拌机内搅拌均匀，粉碎后得到。本发明进一步提供一种活化磷肥，包括磷肥和按磷肥质量的1-50%添加的所述高效解磷微生物菌剂。解淀粉芽抱杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089 在溶解土壤难溶磷中的应用也属于本发明内容；所述土壤难溶磷为包括磷酸钙、磷灰石和磷铁矿中的磷酸三钙等的无机磷。综上，本发明技术方案围绕该高效解磷工程菌解淀粉孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)PS57H1CGMCC No. 6089展开。该菌株是先从植物根围土壤中筛选获得解磷菌PS57，然后构建葡萄糖脱氢酶基因(gdh)的完整表达元件，再将该基因表达元件电转入宿主菌一解磷菌PS57中得到的高效解磷菌株。实验证明，该菌株在无机磷培养基(磷元素来源为难溶性磷酸钙Ca3 (PO4)2，原始含量为5g/L，)中培养72h，可使培养基中的可溶 性磷(磷以可溶性磷的形式存在)含量高达58. 8mg/L，说明该菌株具有很强的解磷作用，可作为解磷细菌应用于微生物肥料生产。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图I为磷标准曲线图2为携带葡萄糖脱氢酶基因完整表达元件的芽孢杆菌表达载体pHYH的物理图谱
具体实施例方式本发明提供的基因改性(或称改造)的高效解磷工程菌为一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),名称为PS57H1,该菌株已于2012年05月11日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6089。该解淀粉芽抱杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089 是革兰氏阳性杆菌，顶端生芽孢；在Yro培养基上生长良好，48h形成直径2-3mm大小的圆形菌落，有运动性，好氧，菌落呈白色有光泽，表面湿润、平坦，边缘整齐；生长温度范围25°C-37°C，最适生长温度30°C-37°C;生长酸碱度范围pH 2-9，最适pH值为7. O ;部分生化特性如表I所示表I 解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) PS57H1CGMCC No. 6089的部分生化特性
权利要求
1.一株基因改性的高效解磷工程菌，为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57H ICGMCC No. 6089。
2.根据权利要求I所述的高效解磷工程菌，其特征在于所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57H1CGMCC No. 6089是革兰氏阳性杆菌,顶端生芽抱；在Yro培养基上生长良好，48h形成直径2-3mm大小的圆形菌落，有运动性，好氧，菌落呈白色有光泽，表面湿润、平坦，边缘整齐；生长温度范围25°C _37°C，最适生长温度30°C -37°C ；生长酸碱度范围pH 2-9，最适pH值为7.0。
3.一种高效解磷微生物菌剂，其活性成分为权利要求I或2所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089 的发酵液或发酵液干燥得到的固体菌剂。
4.根据权利要求5所述高效解磷微生物菌剂，其特征在于，为所述发酵液与草炭、轻质碳酸钙经混合、粉碎得到的，三者混合比例为1:3-5:0. 03-0. 05，优选1:4:0. 04 (重量比)。
5.—种构建权利要求I或2或3或4所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089 的方法，包括以下步骤 1)选定一株能解憐的芽抱杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57,其 16S rDNA 序列如序列表中序列I所示； 2)在序列表中序列2所示的葡萄糖脱氢酶基因(gdh)的5’端添加枯草杆菌蛋白酶E基因启动子(PsubE)，在3’端添加枯草杆菌蛋白酶E基因转录终止子(TsubE)，得到序列表中序列3所示的葡萄糖脱氢酶基因的完整表达元件，然后将其克隆到芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒PHY300PLK的BamH I和Sal I酶切位点之间，得到携带葡萄糖脱氢酶基因完整表达元件的芽孢杆菌表达载体PHYH ； 3)将携带葡萄糖脱氢酶基因完整表达元件的芽孢杆菌表达载体pHYH通过电击转化方法导入芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacien3)PS57中，得到基因改造的高效解磷工程菌即解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089。
6.一种得到权利要求3或4所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57CGMCC No. 6089的发酵液的方法，包括以下步骤 1)配制无机磷细菌液体培养基，配方为葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，酵母粉0. 5g，氯化钠0. 3g，氯化钾0. 3g，硫酸镁0. 3g，硫酸亚铁0. 03g,硫酸锰0. 03g,磷酸钙5g，蒸馏水IOOOmL,pH 7. 0-7. 5，将培养基在使用前用常规方法115°C灭菌30min ； 2)将解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)PS57Hl CGMCC No. 6089按5%的比例接种于步骤I)的无机磷细菌液体培养基中，在摇瓶转速180-200r/min下培养20_24h，得到PS57H1发酵液。
7.一种制备权利要求4所述高效解磷微生物菌剂的方法，将权利要求6所述PS57H1发酵液与高温灭菌后的草炭、轻质碳酸钙按照1:4:0.04 (重量比)的比例在搅拌机内搅拌均匀，粉碎后得到。
8.一种活化磷肥，其特征在于，包括磷肥和按磷肥质量的1-50%添加的权利要求3或4所述高效解磷微生物菌剂。
9.解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)PS57Hl CGMCC No. 6089 在溶解土壤难溶磷中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述土壤难溶磷为包括磷酸钙、磷灰石和磷铁矿中的磷酸三钙等的无机磷。
全文摘要
本发明公开了一株基因改性的高效解磷工程菌及其应用。该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57H1 CGMCC No.6089，从植物根围土壤中筛选获得解磷菌PS57，构建含有葡萄糖脱氢酶基因(gdh)的完整表达元件，再将该基因表达元件电转入宿主菌PS57中得到。实验证明，该菌株在无机磷培养基(主要磷元素来源为难溶性磷酸钙，含磷量为5g/L)中培养72h，可使培养基中的可溶性磷含量高达58.8mg/L，说明该菌株具有很强的解磷作用，可作为解磷细菌应用于微生物肥料生产。
文档编号C12R1/07GK102876624SQ20121038282
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者孙立文, 许仁杰, 李庆财, 赵学民 申请人:山东禹城瑞利源科技有限公司, 北京中农瑞利源高科技发展有限公司