专利名称：HRM法检测突变型α-地中海贫血基因的试剂盒和方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病基因检测技术，具体涉及HRM法检测突变型α-地中海贫血基因的试剂盒和方法。
背景技术：
高分辨熔解曲线(High Resolution Melting, HRM)技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性、-SNP,甲基化、HLA配型等的分析。该方法与其他遗传分型技术相比，不受突变碱基位点与类型的局限，操作简便，具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、快速、高通量检测的优点，结果准确， 并且实现了真正的闭管操作。HRM原理是在PCR基础上通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况导致DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。LC Green是一种与DNA有很强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功用于HRM检测中。HRM广泛应用于分子诊断的各个领域检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁、鉴定人类肿瘤的体细胞突变、肿瘤样品中筛选体细胞突变、基因突变扫描单碱基的改变、插入或缺失、特定突变、多态性位点的筛选、外显子和短扩增子基因型扫描。检测的样品范围广HRM检测片段范围在38-1000bp不同来源的样品都可以用于HRM如血粉、口腔细胞、冷冻的肿瘤样品、也可用于酒精固定、福尔马林固定或石蜡包埋的组织等，在人类遗传性疾病的研究中，通常用周边血液淋巴细胞中提取DNA，用于HRM分析。地中海贫血分为α、β、δ、δβ、γδβ等几种类型，常见的为α地中海贫血(简称α地贫)和β地中海贫血(简称β地贫)，是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一，也是世界上最常见的遗传性疾病之一。据WHO统计全世界约有I. 5亿多人携带地贫基因。在我国的广东、广西、海南、香港、湖南、湖北、云南、贵州、四川等地区常见，黄河以南至长江流域，台湾、福建及西藏等省(区)均有病例报道；患者以汉族多见，亦可见于回、傣、壮、苗和布衣等少数民族，海南黎族地贫基因突变的发生率达58. 4%。抽样调查发现，广西“地贫”基因携带者高达20%，居全国之首，广东为12%，居第二位，四川、重庆等省市也是高发区，有报导发病率在4 7%。α地贫是一种由于α-珠蛋白(a-Globin)基因突变导致α-珠蛋白合成减少，α-链/非 α-链比例失衡而产生的单基因遗传性溶血性血红蛋白病。分缺失型和突变型(非缺失型突变)两类，突变型α -地贫是指用限制性内切酶图谱法未能检测出明显的基因缺失，但在其中可能包括导致基因功能丧失的小片段核苷酸的缺失，插入或碱基替代。非缺失型α-地贫的突变大多位于功能较强的α2珠蛋白基因，故非缺失型血红蛋白H病患者的临床表现要比缺失型血红蛋白H病患者的临床表现更为严重。目前世界上已报道了至少46种引起非缺失型α -地贫的点突变，这些突变影响mRNA加工，mRNA的翻译及翻译后肽链不稳定或肽链缩短，导致α-珠蛋白链合成减少从而引起α地中海贫血。中国人群中目前已报道了 a aGD3°、α a CD3\ α α GD59、α α cs, α α QS、α α 种α地贫突变类型。我国最常见最早鉴定的是α a es、α a QS。α α QS是α 2基因第125密码子CTG(亮氨酸)突变为CCG (脯氨酸)，是一种高度不稳定的α-珠蛋白，阻碍α I β I 二聚体的形成，从而影响四聚体的合成；而α 0 是α 2基因终止密码突变，使α链延长为172个氨基酸。这种突变基因转录的mRNA不稳定，导致α链障碍。目前用于检测突变型α-地贫均为科研试剂，可检测a aes、α a QS、α α ■三种突变型别，而在中国人群中也有报道的a aCD3°, a a 31、a a eD59三种型别没有纳入检测范围。目前普遍应用的基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法(RFLP法)和DNA直接测序法。RFLP法是将PCR与限制性内切酶相结合的方法，但是该方法存在以下缺点试验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，且存在第一轮酶切不完全导致的假阳性。DNA直接测序法能对目的片段进行序列测定，是检测点突变的金标准。但该方法也存在较多缺点仪器及试剂价格昂贵，对一些长片段或外显子较多的基因不宜用测序法直接检测突变；另外，不适用于临床大量样本的检测，对杂合突变、缺失样本、混合样本的检测，无法得到较好的测序图，必须通过克隆测序，多次试验才能获得精确数据；对存在GC富集的样本、困难模板也很难通过一次测序获得准确数据。申请号为201010152735. 8的中国专利公开了 “一种一体化检测a、β突变型地中海贫血的试剂盒”，该试剂盒能检测中国有报导的27种β_地贫突变型别和6种α-地贫突变型别；申请号为02117287.0的中国专利公开了“用于诊断地中海贫血的DNA芯片及其制备方法”可检测在中国发现的21种类型的β_地贫突变以及缺失型的α-地贫。国家知识产权局中检索到的地中海贫血检测相关的专利数目不在少数，其诊断突变型的地中海贫血检测技术平台均为基因芯片法或者PCR-反向点杂交法。这些专利难以实现商品化，是因为它们都存在共同的不足其探针设计需要通过大量的探针筛选才能得到比较满意的结果；对目的基因进行扩增时，一般分为2-3段，其片段长度为300bp-600bp左右，在杂交过程中，片段长度越长，杂交效率就越低，尤其是以玻片为载体的基因芯片，经验上的数值是不超过400bp,而为了弥补杂交效率不足,相应的措施是延长杂交时间甚至需要过夜杂交,但这一措施并不适合于快速检测的初衷；以膜或者芯片为载体的基因芯片检测方法，其检测过程繁杂，且均设计对PCR产物的操作，开管操作极易产生污染。为了提高检测效率及准确性，开发一种集成化检测方法在短时间内完成多种突变型α-地贫型别的快速检测是很有必要的。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种利用HRM法检测突变型α-地中海贫血核苷酸多态性的试剂盒及其方法，该试剂盒可以同时检测6种突变型a -地贫，检测过程更加快速，检测结果也更为准确。本发明技术方案为提供一种HRM法检测突变型a -地中海贫血基因的试剂盒，所述试剂盒包括两个PCR反应管a -PCR管I和a -PCR管2，所述PCR反应管包括PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括引物、PCR Buffer, dNTPs、MgCl2、DNA聚合酶、饱和荧光染料；所述a -PCR管I包括扩增α a CD30、α α CD31、α α CD59三个位点的一对引物上游引物aFl为序列SEQ ID NO: 1，下游引物a Rl为序列SEQ ID NO:4 ；或上游引物aFl为SEQ ID N0:2，下游引物a Rl为序列SEQ ID NO:5 ；或上游引物aFl为序列SEQ ID NO: 3， 下游引物a Rl为序列SEQ ID N0:6 ；所述a -PCR管2包括扩增a a GS、a a QS、a α丽三个位点的一对引物上游引物a F2为序列SEQ ID NO: 7，下游引物a R2为序列SEQ ID NO: 10 ；或上游引物aF2为序列SEQ ID NO: 8，下游引物a R2为序列SEQ ID NO: 11 ；或上游引物a F2为序列SEQ ID NO: 9，下游引物a R2为序列SEQ ID NO: 12。优选的上述HRM法检测突变型a -地中海贫血基因的试剂盒，所述DNA聚合酶为Taq酶或热启动酶，所述a -PCR管I包括扩增α a GD3°、α α CD3\ α α CD59三个位点的一对引物上游引物a Fl为序列SEQ ID NO: 2，下游引物a Rl为SEQ ID NO: 5 ；所述a -PCR管2包括扩增α a GS、α a QS、α α丽三个位点的一对引物上游引物aF2为序列SEQ ID NO: 7，下游引物a R2为序列SEQ ID NO: 12。优选的上述HRM法检测突变型α-地中海贫血基因的试剂盒，其特征在于，所述饱和荧光染料为EvaGreen染料、LC Green PLUS染料、ResoLight染料或SYTO 9染料。优选的上述HRM法检测突变型α -地中海贫血基因的试剂盒，其特征在于，所述的 PCR 反应试剂各组分终浓度为1-5 XPCR buffer, O. I-ImM dNTPs, O. 1-1 μ M 引物，l_5mMMgCl2, DNA聚合酶，1-3 X饱和荧光染料。优选的所述dNTPs为dATP、dGTP、dCTP、dUTP等摩尔的混合液；所述PCRBuffer的pH值为8. 0-9. 0，所述PCR Buffer包括Tris-Cl，氯化钾、硫酸铵、氯化镁。本发明提供的又一技术方案为提供一种HRM法检测突变型α-地中海贫血基因的方法，包括如下步骤(I)采用上述的试剂盒对样品的模板DNA的目的基因进行PCR扩增；(2)对PCR产物的目的基因的突变位点进行HRM分析。优选的上述HRM法检测突变型α -地中海贫血基因的方法，其特征在于，所述步骤
(1)进行PCR扩增反应的条件为92-98°C预变性3_15min;92_98°C变性10-30s、50_68°C退火 10-45s、70-75°C延伸 10_45s，35-50 个循环。优选的上述HRM法检测突变型α -地中海贫血基因的方法，其特征在于，所述步骤
(2)PCR产物进行HRM分析的熔解程序为92-98°C变性l_2min，40_45°C复性l_2min，然后初始熔解温度为58-65°C开始程序升温熔解至92-97°C，并在熔解过程中实时检测荧光信号，25-45次每秒；然后40°C冷却10s。优选的上述HRM法检测突变型α -地中海贫血基因的方法，其特征在于，所述步骤
(I)具体为加入热启动酶的PCR反应试剂进行PCR扩增反应的条件为94°C预变性5min ；94°C变性20s、55°C退火30s、72°C延伸30s, 40个循环；所述步骤(2) PCR产物进行HRM分析的熔解程序为95°C变性lmin，40°C复性lmin，然后初始熔解温度为65°C开始程序升温熔解至95°C，并在熔解过程中实时检测荧光信号，40次每秒；然后40°C冷却10s。
本发明的相对于现有技术中的方案本发明的优点是利用优化的PCR-HRM反应条件，可以同时检测6种突变型α-地中海贫血包括a-cod30，a-Cod31, a -Cod59,a -WM-codl22, a-QS_codl25，a-CS_codl42中的一个或一个以上的组合。采用新型突变研究技术HRM法，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限，应用带HRM模块的荧光定量PCR仪，参照阴性、阳性对照，即可完成对样本多种基因型的片段，可用于地中海贫血的诊断或产前筛查。本发明是应用HRM技术进行基因检测的方法应用，所述的检测方法包含了 a-Globin基因发生单碱基突变区域的引物对，所述的两组引物对可以在相同的条件下进行反应。从而简便快速的完成对α-地贫的检测，克服了现有技术需要对PCR产物进行杂交或测序操作的繁杂性，实现闭管检测，通量高，耗时短，为a -地贫的临床治疗或遗传分析提供指导依据。
图la，图Ib :为本发明实施例进行引物筛选验证得到的电泳图采用三例全血样本提取的不同的DNA模板，使用所设计的弓I物分别进行检测，筛选最合适的引物。图2:为a-PCR管I扩增产物电泳图，图中1-7泳道包含两种不同的酶配制的a -PCR管I。1-3泳道为3例不同的EDTA抗凝全血，使用热启动酶配制的a -PCR管进行扩增的产物，4-6泳道为3例不同的EDTA抗凝全血，使用Taq酶配制的a -PCR管进行扩增的产物，标本同1_3泳道,7泳道为6泳道标本的重复检测。DNA marker为IOObp Ladder (TaKaRa公司生产)。由图2可知，a-PCR管I进行扩增的反应中，使用热启动酶或Taq酶均可成功扩增出目的条带。图3 :为a -PCR管2扩增产物电泳图。图中1_12泳道包含两种不同的酶配制的a -PCR管。1-6泳道为6例不同的EDTA抗凝全血，使用热启动酶配制的a -PCR管进行扩增的产物，7-12泳道为6例不同的EDTA抗凝全血，使用Taq酶配制的a -PCR管进行扩增的产物，标本同1-6泳道，DNA marker为IOObpLadder (TaKaRa公司生产)。由图3可知，a -PCR管2进行扩增的反应中，使用热启动酶或Taq酶均可成功扩增出目的条带。图4a为本发明实施例使用a -PCR管I对不同标本(分别为外周血血浆、外周血全血、羊水细胞、体液、腔道脱落物样本)DNA模板进行PCR扩增时得到的产物电泳图，图4b为本发明实施例使用a -PCR管2对不同标本(分别为外周血血浆、外周血全血、羊水细胞、体液、腔道脱落物样本)DNA模板进行PCR扩增时得到的产物电泳图。由图4a、4b可知，外周血血浆、外周血全血、羊水细胞、体液、腔道脱落物样本均可成为a -PCR管I和a -PCR管2的扩增反应的样本来源。图5 :为本发明实施例使用a -PCR管2对不同标本DNA模板进行PCR扩增后检测的熔解曲线图。图6 :为本发明实施例使用不同的饱和荧光染料进行HRM的熔解曲线图，所用样本为正常样本，图6Α、6Β分别为两段PCR产物的HRM图。图7 :为CS杂合子、CS纯合子、正常样本的扩增产物进行HRM的熔解曲线图。图8 :为QS杂合子、QS纯合子、正常样本的扩增产物进行HRM的熔解曲线图。图9 :为丽杂合子、丽纯合子、正常样本的扩增产物进行HRM的熔解曲线图。图10 :为a -cod30杂合子、a -Cod30纯合子、正常样本的扩增产物进行HRM的熔解曲线图。图11 :为a cod31杂合子、a cod31纯合子、正常样本的扩增产物进行HRM的熔解曲线图。图12 :为a -Cod59杂合子、a cod59纯合子、正常样本的扩增产物进行HRM的熔解曲线图。
具体实施例方式为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。本发明提供一种检测突变型α -地中海贫血的快速检测试剂盒，该方法高通量，快速便捷，闭管操作，利用本试剂盒可以同时检测6种突变型α -地贫。本发明提供一种基于HRM法基因分型技术的基因检测方法，包含以下步骤I、根据a -Globin基因序列，针对待检的两个靶向区域设计筛选合适的PCR引物对，设计的引物能够特异性扩增包括α-地中海贫血全部突变位点的区域。设计的引物可由专业的合成公司合成，如上海生工等。2、对全血、羊水、血斑等样本进行处理。提取基因组DNA，利用步骤I)筛选的引物，采用合适的PCR反应体系，对进行目的片段扩增。3、根据高分辨熔解曲线发对扩增后的目的基因的6种突变型别同时检测。4、在包含所述引物的PCR试剂中，使用两管PCR进行扩增，PCR反应试剂涉及的·组分可以使用市售的产品，如ΝΕΒ公司生产的Taq 5XMaster Mix,Fermentas公司生产的热启动酶等。所述目的基因选自a-Globin基因中突变α-地中海贫血发生的区域α2基因，所述的引物对包含α aeD3°、a aeD31、a a CD5\ a a es、a a QS、a a 6种突变类型。PCR试剂包括a -PCR管I和a -PCR管2，其中a -PCR管I由一对扩增含a a CD3°、a aCD3\ a a GD59三个位点的引物、PCR Buffer、dNTPs、MgCl2、DNA聚合酶、饱和荧光染料及模板DNA组成。a-PCR管2由一对扩增含a a cs、a a QS、a a丽)三个位点的引物、PCRBuffer、dNTPs、MgCl2、DNA聚合酶、饱和荧光染料及模板DNA组成，两对a -PCR引物分别为a Fl和a Rl, a F2和a R2，从以下如表I所示序列都能能够特异性扩增包括a -地中海贫血全部
突变位点的区域。
权利要求
1.一种HRM法检测突变型α-地中海贫血基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括两个PCR反应管a -PCR管I和a -PCR管2，所述PCR反应管包括PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括引物、PCR Buffer、dNTPs、MgCl2、DNA聚合酶、饱和荧光染料； 所述a -PCR管I包括扩增α α _、α a CD3\ α α CD59三个位点的一对引物 上游引物aFl为序列SEQ ID NO: 1，下游引物a Rl为序列SEQ ID NO: 4 ； 或上游引物aFl为SEQ ID NO: 2，下游引物a Rl为序列SEQ ID NO: 5 ； 或上游引物aFl为序列SEQ ID N0:3，下游引物a Rl为序列SEQ ID NO:6 ； 所述a-PCR管2包括扩增a aGS、a a QS、a a 三个位点的一对引物 上游引物a F2为序列SEQ ID N0:7，下游引物a R2为序列SEQ ID NO: 10; 或上游引物aF2为序列SEQ ID NO:8，下游引物a R2为序列SEQ ID NOill ； 或上游引物a F2为序列SEQ ID N0:9，下游引物a R2为序列SEQ ID NO: 12。
2.根据权利要求I所述的HRM法检测突变型a-地中海贫血基因的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq酶或热启动酶， 所述a-PCR管I包括扩增α a GD3°、α α CD3\ α α GD59三个位点的一对引物上游引物aFl 为序列 SEQ ID NO: 2，下游引物 a Rl 为 SEQ ID NO: 5 ； 所述a-PCR管2包括扩增a aGS、a a QS、a a 三个位点的一对引物上游引物a F2为序列SEQ ID N0:7，下游引物a R2为序列SEQ ID N0:12。
3.根据权利要求I所述的HRM法检测突变型a-地中海贫血基因的试剂盒，其特征在于，所述饱和荧光染料为EvaGreen染料、LC Green PLUS染料、ResoLight染料或SYTO 9染料。
4.根据权利要求2所述的HRM法检测突变型α-地中海贫血基因的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应试剂各组分终浓度为1-5XPCR buffer, O. I-ImMdNTPs7O. 1-1 μ M引物，l-5mM MgCl2, DNA聚合酶，1-3 X饱和荧光染料。
5.根据权利要求4所述的HRM法检测突变型α-地中海贫血基因的试剂盒，其特征在于，所述dNTPs为dATP、dGTP、dCTP、dUTP等摩尔的混合液；所述PCRBuffer的pH值为8.0-9. 0，所述PCR Buffer包括Tris-Cl，氯化钾、硫酸铵、氯化镁。
6.一种HRM法检测突变型α-地中海贫血基因的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)采用权利要求I所述的试剂盒对样品的模板DNA的目的基因进行PCR扩增； (2)对PCR产物的目的基因的突变位点进行HRM分析。
7.根据权利要求书6所述的HRM法检测突变型α-地中海贫血基因的方法，其特征在于，所述步骤(I)进行PCR扩增反应的条件为 92-98°C预变性 3-15min ； 92-98°C变性 10-30s、50-68°C退火 10-45s、70_75°C延伸 10_45s，35-50 个循环。
8.根据权利要求书6所述的HRM法检测突变型α-地中海贫血基因的方法，其特征在于，所述步骤(2) PCR产物进行HRM分析的熔解程序为92-98°C变性l_2min，40-45°C复性l-2min，然后初始熔解温度为58-65°C开始程序升温熔解至92-97°C，并在熔解过程中实时检测荧光信号，25-45次每秒；然后40°C冷却10s。
9.根据权利要求6所述的HRM法检测突变型α-地中海贫血基因的方法，其特征在于，所述步骤(I)具体为加入热启动酶的PCR反应试剂进行PCR扩增反应的条件为94°C预变性5min ；94°C变性20s、55°C退火30s、72°C延伸30s, 40个循环；所述步骤(2) PCR产物进行HRM分析的熔解程序为95°C变性 lmin，40°C复性 Imin，然后初始熔解温度为65°C开始程序升温熔解至95°C，并在熔解过程中实时检测荧光信号，40次每秒；然后40°C冷却10s。
全文摘要
本发明涉及一种疾病基因检测技术，具体涉及HRM法检测突变型α-地中海贫血基因的试剂盒及其方法。本发明提供一种HRM法检测突变型α-地中海贫血基因的试剂盒，所述试剂盒包括两个PCR反应管α-PCR管1和α-PCR管2，所述PCR反应管包括PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括引物、PCR Buffer、dNTPs、MgCl2、DNA聚合酶、饱和荧光染料。本发明利用优化的PCR-HRM反应条件，可以同时检测6种突变型α-地中海贫血包括α-cod30，α-cod31，α-cod59，α-WM-cod122，α-QS-cod125，α-CS-cod142中的一个或一个以上的组合。
文档编号C12Q1/68GK102925560SQ20121038230
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者彭春梅, 陈金元, 陈锋, 胡守旺, 谢佐福, 周晓强, 姚铭锋 申请人:泰普生物科学(中国)有限公司