专利名称：丙烯酰胺的制备方法
技术领域：
本发明涉及酰胺化合物的制备方法。本发明(第一发明)较详细地涉及制备酰胺化合物及酰胺类聚合物的方法，更具体而言，涉及使用具有腈水合酶(nitrile hydratase)活性的催化剂,有效地在水性介质中由腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法，以及由该酰胺化合物制备高品质的酰胺类聚合物的方法。另外，本发明(第二发明)较详细地涉及制备丙烯酰胺、及丙烯酰胺类聚合物的方法，更具体而言，通过含有腈水合酶的微生物的菌体等水合丙烯腈制备高品质的丙烯酰胺的方法、及由该丙烯酰胺制备高品质的丙烯酰胺类聚合物的方法。
背景技术：
关于工业上有用的酰胺化合物，如下所述地公开了各种制备方法。近年，发现了具有水合氰基转化为酰胺基的腈水合活性的腈水合酶，并已经公开了使用该酶或具有该酶的微生物菌体等由腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法。已知该制备方法与现有的科学方法相比，具有由腈化合物转化为对应的酰胺化合物的转化率及选择率闻等优点。利用上述腈水合酶在工业上制备酰胺化合物时，将作为催化剂的腈水合酶的酰胺化合物的生产率(I分子腈水合酶产生的酰胺化合物的分子数)最大化是重要的。因此，为了维持或提高酶活性、抑制活性降低、提高降低了的酶活性等，提出了各种方案。例如，在不伴随细胞增殖的条件下，使含有腈水合酶的微生物菌体或该菌体处理物与氧化剂接触，由此维持或提高酶活性已是公知的(参见专利文献I)。另外，通过使用降低了所含氢氰酸的浓度的腈化合物，抑制腈水合酶的活性降低也是公知的(参见专利文献2)。除此之外，还已知下述方法使用经戊二醛交联处理后的菌体进行反应的方法(参见专利文献3);在高级不饱和脂肪酸或其盐类的存在下进行反应的方法(参见专利文献4);使用经有机溶剂处理后的菌体、或处理物进行反应的方法(参见专利文献5)等。以上是第一发明的背景技术。另外，如上所述，作为丙烯酰胺的主要制备方法之一，可以举出将丙烯腈进行水合反应的方法，例如已知有用阮内铜等金属铜催化剂进行水合反应的方法、或以含有腈水合酶的微生物菌体及该菌体处理物等作为催化剂进行水合反应的方法。上述方法中，以含有腈水合酶的微生物菌体等作为催化剂的丙烯酰胺的制备方法与现有的通过金属铜催化剂等进行水合反应的方法相比，由于丙烯腈的转化率及选择率高，故作为工业上的制备方法备受关注。为了以含有该腈水合酶的微生物菌体等为催化剂，有效地制备更高品质的丙烯酰胺，必须尽可能地除去抑制微生物菌体等的催化作用的杂质。另外，由该反应得到的丙烯酰胺主要用作丙烯酰胺类聚合物的原料，但近年，要求该丙烯酰胺类聚合物更高品质化。例如，可以将丙烯酰胺类聚合物用于凝集剂用途，但近年随着提高性能的要求，要求用作凝集剂的丙烯酰胺类聚合物在维持水溶性的同时进一步高分子量化。另外，可以将丙烯酰胺类聚合物用于制纸用添加剂等用途，作为该制纸用添加齐U，为了进一步提高所得的纸的品质而要求色调更优异的聚合物。如上所述，作为改善由含有腈水合酶的菌体催化剂等得到的丙烯酰胺的品质或聚丙烯酰胺的品质的方法，已知有下述方法通过化学方法降低腈化合物中的氢氰酸浓度后，使腈水合酶作用于腈化合物的酰胺化合物的制备方法(例如，参见专利文献2);降低丙烯腈中作为杂质所含的噁唑及氢氰酸，将丙烯腈转化为丙烯酰胺，由该丙烯酰胺制备丙烯酰胺类聚合物的方法(例如，参见专利文献6)。以上是第二发明的背景技术。专利文献I :特开2004-350573号公报专利文献2 :特开11-123098号公报专利文献3 :特开平7-265091号公报 专利文献4 :特开平7-265090号公报专利文献5 :特开平5-308980号公报专利文献6 :国际公开2004/090148号说明书
发明内容
但是，利用腈水合酶有效地制备酰胺化合物时，第一发明的背景技术中所述的现有技术中存在无法解决的由其他原因导致的腈水合酶的酰胺化合物生产率降低的现象，有待解决其主要原因。因此，第一发明的目的在于提供在利用腈水合酶的反应中由腈化合物有效地制备对应的酰胺化合物的方法。还提供使用由上述方法制备的酰胺化合物制备高品质的酰胺类聚合物的方法。另外，从排除抑制含有腈水合酶的微生物菌体等的催化作用的原因、有效地进行丙烯腈的水合反应的观点来看，第二发明的背景技术中所述的方法未必能得到充分的效果。从提高丙烯酰胺、及丙烯酰胺类聚合物的品质的观点来看，仍有改善的余地。因此，第二发明的目的在于用含有腈水合酶的微生物催化剂等更有效地制备更高品质的丙烯酰胺的方法、及使用该丙烯酰胺得到色调优异、同时实现了水溶性和高分子量化的品质优异的丙烯酰胺类聚合物的制备方法。为了解决上述第一发明的课题，本发明人等对酰胺化合物的制备方法进行了深入的研究，发现使用具有腈水合酶活性的催化剂，在水性介质中由腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法中，将水性介质中的苯浓度降低至特定浓度以下，由此能不降低腈水合酶的反应速度且有效地制备酰胺化合物。需要说明的是，水性介质中的苯通常来源于作为原料的腈化合物，因其他原因混入时，也可以通过降低至相同的浓度条件，有效地制备酰胺化合物。另外，可以使用根据上述方法在抑制苯浓度的反应条件下制备的酰胺化合物，制备酰胺类聚合物，由此得到色调优异的酰胺类聚合物。S卩，第一发明如下所述。[I] 一种酰胺化合物的制备方法，所述方法是在具有腈水合酶活性的催化剂的存在下、在水性介质中，由腈化合物制备酰胺化合物的方法，其特征在于，水性介质中的苯浓度为4. Oppm以下。[2]如[I]所述的酰胺化合物的制备方法，其中，腈水合酶是来源于假诺卡氏菌属的腈水合酶或来自红球菌属的腈水合酶。[3]如[I]或[2]所述的酰胺化合物的制备方法，其中，腈化合物为丙烯腈或甲基
丙烯腈。[4] 一种制备酰胺类聚合物的方法，所述方法是均聚[I]所述的酰胺化合物或共聚所述酰胺化合物和能与酰胺化合物共聚的至少一种不饱和单体来制备酰胺类聚合物。[5]如[4]所述的制备酰胺类聚合物的方法，其中，上述酰胺化合物为丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺。
另外，本发明人等研究了上述第二发明的课题，通过降低丙烯腈中所含的丙烯醛浓度，可以维持腈水合酶的催化活性，且能得到高品质的丙烯酰胺，并且利用该丙烯酰胺可以得到色调优异、能同时实现水溶性和高分子量化的丙烯酰胺类聚合物，从而完成了第二发明。S卩，第二发明的丙烯酰胺的制备方法的特征在于，用含有腈水合酶的微生物的菌体或该菌体处理物使丙烯醛浓度为Ippm以下的丙烯腈在水性介质中进行水合反应。优选上述丙烯腈中所含的氢氰酸的浓度为5ppm以下。另外，也优选上述丙烯腈中所含的噁唑的浓度为IOppm以下。更优选上述丙烯腈中所含的氢氰酸的浓度为5ppm以下、且噁唑的浓度为IOppm以下。第二发明的丙烯酰胺类聚合物的制备方法的特征在于均聚上述丙烯酰胺，或共聚上述丙烯酰胺和能与丙烯酰胺共聚的至少一种不饱和单体。根据第一发明，在利用腈水合酶的反应中，通过将含有腈化合物的水性介质中的苯浓度降低至特定浓度以下，可以有效地由腈化合物制备对应的酰胺化合物。另外，利用上述方法，在抑制了苯浓度的反应条件下制备酰胺化合物，使用制得的酰胺化合物制备酰胺类聚合物，由此可以得到色调优异的酰胺类聚合物。另外，根据第二发明，利用含有腈水合酶的微生物催化剂等，可以更高效地制备更高品质的丙烯酰胺。根据第二发明，还可以得到色调优异、同时实现水溶性和高分子量化的品质优异的丙烯酰胺类聚合物。
具体实施例方式I.第一发明以下，详细说明第一发明。所谓用于第一发明的具有腈水合酶活性的催化剂，是指产生腈水合酶的微生物的菌体或该菌体处理物。此处所说的腈水合酶是指具有水合腈化合物的能力的蛋白质。作为产生腈水合酶的微生物，可以举出诺卡氏菌(Nocardia)属、棒杆菌(Corynebacterium)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、嗜热性芽孢杆菌属、假单胞菌(Pseudomonas)属、微球菌(Micrococcus)属、以紫红红球菌(rhodochrous)种为代表的红球菌(Rhodococcus)属、不动杆菌(Acinetobacter)属、黄色杆菌(Xanthobacter)属、链霉菌(Streptomyces)属、根瘤菌(Rhizobium)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、肠杆菌(Enterobacter)属、欧文氏菌(Erwinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、朽1檬酸杆菌(Citrobacter)属、产喊菌(Achromobacter)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属或以嗜热菌(thermophila)种为代表的假诺卡氏菌(Pseudonocardia)属、无芽孢杆菌(Bacteridium)属、短杆菌(Brevibacterium)属的微生物等。优选举出属于假诺卡氏菌属或红球菌属的微生物，特别优选嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila) JCM3095、或紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J-I。另外，在任意宿主中表达由该微生物克隆的腈水合酶基因的转化体也包含在第一发明中所说的产生腈水合酶的微生物中。需要说明的是，此处所说的任意宿主可以举出下述实施例中的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)为代表例,但并没有特别限定于大肠埃希氏菌，还包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等芽孢杆菌属菌、酵母或放线菌等其他微生物菌株。作为这样的例子，可以举出MT-10822(该菌株基于国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，于1996年2月7目保藏在茨城县筑波市东I段I番3号的通商产 业省工业技术院生命工学工业技术研究所中，保藏编号为FERM BP-5785)。另外，表达下述变异型的腈水合酶的转化体也包括在第一发明中所说的产生腈水合酶的微生物中，所述变异型的腈水合酶是使用重组DNA技术，用其他氨基酸置换或缺失、消除或插入构成该酶的I个或2个以上氨基酸，进一步提高酰胺化合物耐性或腈化合物耐性、温度耐性的变异型腈水合酶。在第一发明的制备方法中使用产生上述腈水合酶的微生物时，使用该微生物的菌体或菌体处理物。菌体可以利用分子生物学·生物工程学·基因工程学领域公知的一般方法进行制备。例如，可以举出下述方法在LB培养基或M9培养基等通常的液体培养基中接种该微生物后，在适当的培养温度(通常为20°C 50°C，但为嗜热菌时，可以为50°C以上)下使其生长，然后，通过离心分离该微生物，从培养液分离·回收而得到。另外，对微生物的菌体处理物的形状没有特别限定，有上述微生物菌体的提取物或磨碎物、分离精制该提取物或磨碎物的腈水合酶活性馏分所得的后分离物、使用适当的载体将该微生物菌体或该菌体的提取物·磨碎物·后分离物固定得到的固定化物等，上述物质只要具有腈水合酶的活性，就可以用作第一发明中所说的菌体处理物。产生上述腈水合酶的微生物菌体或该菌体处理物当然可以在制备后立即用于反应，也可以在制备后保存，根据需要使用。第一发明中的产生腈水合酶的微生物菌体或该菌体处理物可以用于分步反应，也可以用于连续反应。另外，反应形式可以根据微生物的菌体或菌体处理物的形态选择悬浊床、固定床、流化床等适当的形式。此时反应液中的该催化剂浓度只要不妨碍水性介质和腈化合物的混合即可，没有特别限定。第一发明中的水性介质是指水、或以适当的浓度溶解磷酸盐等缓冲剂、硫酸盐或碳酸盐等无机盐、碱金属的氢氧化物、酰胺化合物、腈化合物、具有腈水合酶活性的催化剂等得到的水溶液(反应液整体)。第一发明中，不管该溶液是腈化合物相对于水溶液处于饱和浓度内的均匀体系，抑或处于饱和浓度以上的腈相和水相的二相体系，均将该溶液整体定义为水性介质。需要说明的是，本说明书中，将第一发明中的水性介质也称为“水性介质(I)”。二相体系时，使用旋转翼或管路混合器(line mixer)等适当的混合装置，充分混合在静置下分离为二相的水相和腈相也是重要的。
第一发明中，反应时的水性介质(I)中的腈化合物浓度只要是不因水性介质(I)中的苯浓度导致反应速度降低的范围或腈水合酶不因腈化合物而失活的范围即可，没有特别限定。优选腈化合物的重量％为50重量％以下。第一发明中所用的腈化合物只要是在水性介质(I)中，在具有腈水合酶活性的催化剂的作用下转化为酰胺化合物的化合物即可，没有特别限定。优选举出乙腈、丙腈、丙烯腈、甲基丙烯腈、正丁腈、异丁腈、丁烯腈、α -羟基异丁腈等碳原子数为2 4的腈化合物作为该腈化合物的代表例。较优选使用丙烯腈、甲基丙烯腈。上述腈化合物经精制工序制成市售产品，但含有微量杂质。作为杂质之一,可以举出苯，例如丙烯腈，利用丙烯的氨氧化法进行工业制备，但由于丙烯中所含的微量苯被带入到丙烯腈产品中等原因，导致市售的丙烯腈产品中含有苯。水性介质(I)中所含的苯浓度只要是抑制反应速度降低的浓度即可，通常为 4.Oppm以下，优选为2. 2ppm以下。此处，抑制反应速度降低的范围是指以水性介质⑴中所含的苯浓度为2. 2ppm以下的反应中的反应速度为100%，相对反应速度为80%以上的范围。另外，水性介质(I)中所含的苯浓度为4. Oppm以下是指Ikg水性介质(I)中所含苯的量为4mg以下。从腈化合物中除去苯的方法、或从水性介质(I)中除去苯的方法可以为任意方法，例如蒸馏、用活性炭进行吸附处理、利用作为超强酸的杂多酸等固体酸进行吸附处理、用柱色谱法进行处理、用环丁砜进行萃取、用能同化苯的微生物进行生物分解、利用苯的挥发性进行脱气处理等。第一发明中的反应通常在常压下进行，为了提高丙烯酸类化合物在水性介质(I)中的溶解度，可以在加压下进行反应。另外，对反应温度没有特别限定，优选在该腈水合酶不失活的温度范围内，进一步优选为O 50°C。另一方面，pH只要是能维持腈水合酶活性即可，没有特别限定，优选在pH5 pHIO的范围内。第一发明的酰胺类聚合物可以通过均聚如上所述地制得的酰胺化合物、或共聚酰胺化合物和能与酰胺化合物共聚的至少一种不饱和单体进行制备。此处，酰胺化合物优选为利用第一发明的酰胺化合物的制备方法得到的丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺。作为能与酰胺化合物共聚的不饱和单体，可以举出丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、马来酸、富马酸等不饱和羧酸及它们的盐；乙烯基磺酸、苯乙烯磺酸、丙烯酰胺甲基丙磺酸及它们的盐；甲基丙烯酸N，N-二甲基氨基乙酯、甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯、丙烯酸N，N-二甲基氨基乙酯等(甲基)丙烯酸的烷基氨基烷基酯、或它们的季铵衍生物；(N, N- 二甲基氨基丙基)甲基丙烯酰胺、(N，N- 二甲基氨基丙基)丙烯酰胺等N，N-二烷基氨基烷基(甲基)丙烯酰胺、或它们的季铵衍生物；丙酮丙烯酰胺、N, N- 二甲基丙烯酰胺、(N，N- 二甲基)甲基丙烯酰胺、(N-乙基)甲基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N, N- 二乙基丙烯酰胺、N-丙基丙烯酰胺等亲水性丙烯酰胺；N-丙烯酰基吡咯烷、N-丙烯酰基哌啶、N-丙烯酰基吗啉；甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、丙烯酸羟丙酯；甲氧基聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、N-乙烯基-2-吡咯烷酮；甲基丙烯酰胺；N，N- 二-正丙基丙烯酰胺、N-正丁基丙烯酰胺、N-正己基丙烯酰胺、(N-正己基)甲基丙烯酰胺、N-正辛基丙烯酰胺、(N-正辛基)甲基丙烯酰胺、N-叔辛基丙烯酰胺、N-十二烷基丙烯酰胺、(N-正十二烷基)甲基丙烯酰胺等N-烷基(甲基)丙烯酰胺衍生物；N, N- 二缩水甘油基丙烯酰胺、(N, N- 二缩水甘油基)甲基丙烯酰胺、N-(4-环氧丙氧基丁基)丙烯酰胺、N-(4-环氧丙氧基丁基)甲基丙烯酰胺、N-(5-环氧丙氧基戊基)丙烯酰胺、N-(6-环氧丙氧基己基)丙烯酰胺等Ν-(ω-环氧丙氧基烷基)(甲基)丙烯酰胺衍生物；(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸月桂基酯、(甲基)丙烯酸2-乙基己酯、(甲基)丙烯酸缩水甘油基酯等(甲基)丙烯酸酯衍生物；丙烯腈、甲基丙烯腈、乙酸乙烯基酯、氯乙烯、偏氯乙烯、乙烯、丙烯、丁烯等烯烃类、苯乙烯、α-甲基苯乙烯、丁二烯、异戍二烯等。
上述单体可以单独使用I种，也可以并用2种以上。作为上述单体的聚合方法，例如有水溶液聚合、乳液聚合等。上述聚合方法中，采用水溶液聚合时，通常酰胺化合物与根据需要添加的不饱和单体的总浓度为5 90重量％。作为聚合引发剂，例如可以使用自由基聚合弓I发剂。作为自由基聚合引发剂，可以举出过硫酸钾、过硫酸铵、过氧化氢、过氧化苯甲酰等过氧化物；偶氮二异丁腈、2，2’-偶氮二(4-脒基丙烷)2盐酸盐、4，4’-偶氮二(4-氰基戊酸钠)等偶氮类游离基引发剂；并用上述过氧化物和亚硫酸氢钠、三乙醇胺、硫酸亚铁铵等还原剂的所谓氧化还原类催化剂。上述聚合引发剂可以单独使用I种，也可以并用2种以上。聚合引发剂的量通常在相对于单体的总重量为O. 001 5重量％的范围内。为单一聚合引发剂时，聚合温度通常在O 120°C的范围内，较优选在5 90°C的范围内。另外，聚合温度无需一直保持一定的温度，可以伴随聚合的进行适当地改变，通常伴随聚合的进行，产生聚合热，聚合温度有上升的倾向，所以有时根据需要进行冷却。聚合时的气氛没有特别限定，从迅速进行聚合的观点来看，例如优选在氮气等惰性气体氛围中进行聚合。聚合时间没有特别限定，通常在I 20小时的范围内。另外，聚合时水溶液的pH也没有特别限定，可以根据需要调节pH进行聚合。作为此时能使用的PH调节剂，可以举出氢氧化钠、氢氧化钾、氨等碱；磷酸、硫酸、盐酸等无机酸；甲酸、乙酸等有机酸等。利用第一发明所得的聚合物的分子量没有特别限定，通常在10万 5000万的范围内，优选在50万 3000万的范围内。由此得到的第一发明的酰胺类聚合物为同时实现水溶性和高分子量化的聚合物，且色调也优异，可以优选用作凝集剂、制纸用添加剂、石油回收剂等。2.第二发明以下，详细说明第二发明。首先，说明用于第二发明的丙烯酰胺制备方法的原料。
〔丙烯腈〕第二发明中，使用丙烯醛的浓度为Ippm以下的丙烯腈。此处，丙烯醛的浓度为Ippm以下的丙烯腈是指Ikg作为第二发明的原料使用的丙烯腈中所含的丙烯醛的量为Img以下。将丙烯腈中所含的丙烯醛的浓度设定为Ippm以下的方法可以举出下述方法使乙酰丙酮等和丙烯腈中的丙烯醛反应，通过蒸馏等，分离该反应生成物和丙烯腈的方法；使丙烯腈与含有伯氨基及/或仲氨基作为交换基团的多孔性离子交换树脂接触除去丙烯腈中的丙烯醛的方法；使丙烯腈与具有伯氨基及/或仲氨基官能团的凝胶型弱碱性离子交换树脂接触来减少丙烯腈中的醛类、实质上为丙烯醛的方法。丙烯腈中所含的丙烯醛的浓度可以用气相色谱法、高效液相色谱法等进行定量。第二发明中，原料丙烯腈中的丙烯醛的浓度为Ippm以下，较优选为O. 5ppm以下。
丙烯醛的浓度在上述范围内时，丙烯醛对腈水合酶的催化作用不发生反应抑制，且使用所得的丙烯酰胺，能得到色调优异、同时实现了水溶性和高分子量化的品质优异的丙烯酰胺类聚合物。用于第二发明的丙烯腈中所含的丙烯醛的浓度为Ippm以下，更优选该丙烯腈中所含的氢氰酸的浓度为5ppm以下。此处，丙烯腈中所含的氢氰酸的浓度为5ppm以下是指Ikg用作第二发明的原料的丙烯腈中所含的氢氰酸的量为5mg以下。将丙烯腈中所含的氢氰酸的浓度设定为Ippm以下的方法，例如可以举出下述方法特开平11-123098号公报中记载的将氢氰酸制成金属络合物加以除去的方法；使用离子交换树脂的方法；在碱性条件下对丙烯腈加成氢氰酸的方法等。另外，丙烯腈中所含的氢氰酸的浓度可以在用碱溶液萃取后，通过使用硝酸银的滴定法求出。第二发明中，丙烯腈中的氢氰酸的浓度优选为5ppm以下，较优选为3ppm以下，更优选为Ippm认下。并且，第二发明中，还优选除丙烯腈所含的丙烯醛的浓度为Ippm以下之外，丙烯腈中所含的噁唑的浓度为IOppm以下。此处，丙烯腈中所含的噁唑的浓度为IOppm以下是指Ikg用作第二发明的原料的丙烯腈中所含的噁唑的量为IOmg以下。使丙烯腈中所含的噁唑的浓度在IOppm以下的方法，例如可以举出特开昭63-118305号公报记载的使丙烯腈中的噁唑与H型的阳离子交换树脂接触的方法。另外，丙烯腈中所含的噁唑的浓度可以用气相色谱法、高效液相色谱法等进行定量。第二发明中，丙烯腈中的噁唑的浓度优选为IOppm以下，较优选为5ppm以下，更优选为Ippm以下。另外，第二发明中，用于第二发明的丙烯腈中所含的丙烯醛的浓度在上述范围内，氢氰酸的浓度为5ppm以下,优选为3ppm以下,较优选为Ippm以下,且卩惡唑的浓度为IOppm以下，优选为5ppm以下，较优选为Ippm以下。〔含有腈水合酶的微生物菌体等〕
第二发明中，可以以上述丙烯腈为原料，以含有腈水合酶的微生物菌体及其菌体处理物等为催化剂进行水合反应，得到第二发明的丙烯酰胺。第二发明中，腈水合酶是指具有水解腈化合物生成对应的酰胺化合物能力的酶。此处，作为含有腈水合酶的微生物，只要是产生具有水解腈化合物生成对应的酰胺化合物的能力的腈水合酶且在丙烯酰胺水溶液中保持腈水合酶活性的微生物即可，没有特别限定。具体而言，可以举出诺卡氏菌(Nocardia)属、棒杆菌(Corynebacterium)属、芽孢杆菌(BaciIIus)属、嗜热性芽孢杆菌属、假单胞菌(Pseudomonas)属、微球菌(Micrococcus)属、以紫红红球菌(rhodochrous)种为代表的红球菌(Rhodococcus)属、不动杆菌(Acinetobacter)属、黄色杆菌(Xanthobacter)属、链霉菌(Streptomyces)属、根瘤菌(Rhizobium)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、肠杆菌(Enterobacter)属、欧文氏菌(Erwinia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、朽1檬酸杆菌(Citrobacter)属、产碱菌 (Achromobacter)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属或以嗜热菌(thermophila)种为代表的假诺卡氏菌(Pseudonocardia)属的微生物作为优选例。另外，在任意宿主中表达由该微生物克隆的腈水合酶基因的转化体也包括在第二发明中所说的微生物中。需要说明的是，此处所说的任意宿主可以举出下述实施例中使用的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)为代表例,但并没有特别限定于大肠埃希氏菌,还包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等芽孢杆菌属菌、酵母或放线菌等其他微生物菌株。作为这样的例子，可以举出MT-10822(该菌株基于国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，于1996年2月7日保藏在茨城县筑波市东I段I番3号的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所中，保藏编号为FERM BP-5785)。另外，表达下述变异型的腈水合酶的转化体也包括在第二发明中所说的微生物中，所述变异型的腈水合酶是使用重组DNA技术，用其他氨基酸置换或缺失、消除或插入构成该酶的I个或2个以上氨基酸，进一步提高丙烯酰胺耐性或丙烯腈耐性、温度耐性的变异型腈水合酶。使用上述微生物制备酰胺化合物时，通常使用该微生物的菌体或菌体处理物。菌体可以利用分子生物学、生物工程学、基因工程学领域公知的一般方法进行制备。例如，可以举出下述方法在LB培养基或M9培养基等通常的液体培养基中接种该微生物后，在适当的培养温度(通常为20°C 50°C，但为嗜热菌时，可以为50°C以上)下使其生长，然后，通过离心分离该微生物，从培养液分离、回收而得到。另外，第二发明的微生物的菌体处理物是指上述微生物菌体的提取物或磨碎物、分离精制该提取物或磨碎物的腈水合酶活性级分所得的后分离物、使用适当的载体将该微生物菌体或该菌体的提取物、磨碎物、后分离物固定得到的固定化物等，上述菌体处理物只要具有腈水合酶的活性，就可以用作第二发明中所说的菌体处理物。该物质可以使用单一种类，也可以同时或交替使用2种以上的不同形态的物质。〔水性介质〕另外，第二发明中的水性介质是指水、或以适当浓度溶解磷酸盐等缓冲剂、硫酸盐或碳酸盐等无机盐、碱金属的氢氧化物、或酰胺化合物等得到的水溶液。需要说明的是，本说明书中，将第二发明中的水性介质称为“水性介质(II) ”。〔反应条件〕
第二发明中，水性介质(II)中的丙烯腈的浓度在反应开始时，为该腈化合物的饱和浓度以上的浓度。该浓度的上限没有特别限定，但是过多地供给腈化合物时，为了完成反应，需要大量催化剂及具有超大容积的反应容器、以及用于除热的超大的热交换器等，在设备方面的经济负担加重。因此，作为丙烯腈的供给浓度，按该丙烯腈全部转化为对应的丙烯酰胺时理论生成液浓度以丙烯酰胺计处于40 80重量％的范围内进行供给，较具体而言，在相对于I重量份水丙烯腈为O. 4 I. 5重量份的范围内。另外，上述反应的反应时间也取决于催化剂使用量或温度等条件，通常在I 80小时的范围内，优选在2 40小时的范围内。反应形式没有特别限定，可以为分步式、半分步式，也可以进行连续式的反应。另夕卜，可以为悬浊床、固定床、移动床等中的任一种，通常较优选在备有搅拌器的槽型反应器、活塞式流动反应器中反应，还可以组合多种形式的反应器。催化剂的用量也依赖于反应条件或催化剂的种类及其形态，通常换算成该微生物 干燥菌体重量，相对于反应液的重量为10 50000ppm，优选为50 30000ppm。水合反应通常在常压或接近于常压下进行，为了提高腈化合物在水性介质(II)中的溶解度而在加压下进行。另外，反应温度只要在水性介质(II)的冰点以上即可，没有特别限定，通常优选在O 50°C的范围内进行，较优选在10 40°C的范围内。也可以在生成物析出于反应液中形成的浆料状态下进行反应。上述水合反应时的反应液的pH只要维持腈水合酶活性即可，没有特别限定，优选在PH6 10的范围内，较优选在pH7 9的范围内。另外，也可以通过部位特异性变异得到保持腈水合酶活性的氨基酸置换体，但基于特定的变异点与被置换的碱基的种类，以部位特异性变异以外的方法构筑重组质粒，将其导入宿主细胞，也可以得到相同的结果。例如，用DNA合成器等合成DNA片段，所述DNA片段具有相当于变异点的区域的DNA的碱基序列成为氨基酸置换后的序列的碱基序列，将得到的DNA片段与预先用其他方法分离的PPT-DBl的相当于该片段的区域置换，可以得到目标重组质粒。〔丙烯酰胺类聚合物的制备〕第二发明的丙烯酰胺类聚合物可以通过均聚如上所述地制得的丙烯酰胺、或共聚丙烯酰胺和能与丙烯酰胺共聚的至少一种不饱和单体而制备。作为能与丙烯酰胺共聚的不饱和单体，可以举出丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、马来酸、富马酸等不饱和羧酸及它们的盐；乙烯基磺酸、苯乙烯磺酸、丙烯酰胺甲基丙磺酸及它们的盐；甲基丙烯酸N，N-二甲基氨基乙酯、甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯、丙烯酸N，N-二甲基氨基乙酯等(甲基)丙烯酸的烷基氨基烷基酯、或它们的季铵衍生物；(N, N- 二甲基氨基丙基)甲基丙烯酰胺、N，N- 二甲基氨基丙基丙烯酰胺等N，N- 二烷基氨基烷基(甲基)丙烯酰胺、或它们的季铵衍生物；丙酮丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、(N，N-二甲基)甲基丙烯酰胺、(N-乙基)甲基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N, N- 二乙基丙烯酰胺、N-丙基丙烯酰胺等亲水性丙烯酰胺；N-丙烯酰基吡咯烷、N-丙烯酰基哌啶、N-丙烯酰基吗啉；
甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、丙烯酸羟丙酯；甲氧基聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、N-乙烯基-2-吡咯烷酮；甲基丙烯酰胺；N，N- 二-正丙基丙烯酰胺、N-正丁基丙烯酰胺、N-正己基丙烯酰胺、(N-正己基)甲基丙烯酰胺、N-正辛基丙烯酰胺、(N-正辛基)甲基丙烯酰胺、N-叔辛基丙烯酰胺、N-十二烷基丙烯酰胺、(N-正十二烷基)甲基丙烯酰胺等N-烷基(甲基)丙烯酰胺衍生物；N, N- 二缩水甘油基丙烯酰胺、N, N- 二缩水甘油基甲基丙烯酰胺、N-(4-环氧丙氧基丁基)丙烯酰胺、N-(4-环氧丙氧基丁基)甲基丙烯酰胺、N-(5-环氧丙氧基戊基)丙烯酰胺、N-(6-环氧丙氧基己基)丙烯酰胺等Ν-(ω-环氧丙氧基烷基)(甲基)丙烯酰胺衍生物；(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸月桂基酯、(甲基)丙烯酸2-乙基己酯、(甲基)丙烯酸缩水甘油基酯等(甲基)丙烯酸酯 衍生物；丙烯腈、甲基丙烯腈、乙酸乙烯基酯、氯乙烯、偏氯乙烯、乙烯、丙烯、丁烯等烯烃类、苯乙烯、α -甲基苯乙烯、丁二烯、异戍二烯等。上述单体可以单独使用I种，也可以并用2种以上。作为上述单体的聚合方法，例如有水溶液聚合、乳液聚合等。上述聚合方法中，采用水溶液聚合时，通常丙烯酰胺与根据需要添加的不饱和单体的总浓度为5 90重量％。作为聚合引发剂，例如可以使用自由基聚合弓I发剂。作为自由基聚合引发剂，可以举出过硫酸钾、过硫酸铵、过氧化氢、过氧化苯甲酰等过氧化物；偶氮二异丁腈、2，2’-偶氮二(4-脒基丙烷)2盐酸盐、4，4’-偶氮二(4-氰基戊酸钠)等偶氮类游离基引发剂；并用上述过氧化物和亚硫酸氢钠、三乙醇胺、硫酸亚铁铵等还原剂得到的所谓氧化还原类催化剂。上述聚合引发剂可以单独使用I种，也可以并用2种以上。聚合引发剂的量通常相对于单体的总重量在O. 001 5重量％的范围内。为单一聚合引发剂时，聚合温度通常在O 120°C的范围内，较优选在5 90°C的范围内。另外，聚合温度无需一直保持在一定的温度，可以伴随聚合的进行适当改变，通常，伴随聚合的进行，产生聚合热，聚合温度有上升的倾向，所以有时根据需要进行冷却。聚合时的气氛没有特别限定，从快速进行聚合的观点来看，例如优选在氮气等惰性气体气氛中聚合。聚合时间没有特别限定，通常在I 20小时的范围内。另外，聚合时的水溶液的pH也没有特别限定，可以根据需要调节pH进行聚合。作为此时能使用的PH调节剂，可以举出氢氧化钠、氢氧化钾、氨等碱；磷酸、硫酸、盐酸等无机酸；甲酸、乙酸等有机酸等。第二发明所得的聚合物的分子量没有特别限定，通常在10万 5000万的范围内，优选在50万 3000万的范围内。由此得到的第二发明的丙烯酰胺类聚合物为同时实现水溶性和高分子量化的聚合物，且具有优异的色调，优选用作凝集剂、制纸用添加剂、石油回收剂等。
[实施例]以下，基于实施例更具体地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。I.第一发明的实施例需要说明的是，利用气相色谱分析测定苯浓度。使用化学物质评价研究机构G-9501. 2mmX 40m (25 μ m)作为气相色谱分析的测定柱，使用He载气，利用FID检测器进行检测。另外，各实施例及比较例中的HPLC分析中，使用日本分光制的FiMpak SIL018-5(250Χ4.6Φ )作为柱，使用含有4体积％乙腈的IOmM磷酸水溶液作为展开液。另夕卜，丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺通过220nm的吸光度进行检测。[制备例1-1]在反应容器中装入具有Ikg活性炭(内部表面积为1000m2/kg)的活性炭固定床吸附剂。在温度10<€、流速200111/1^的条件下,用泵使苯浓度为26ppm的丙烯腈a从下方向上方通过吸附剂。测定通过后的该丙烯腈中的苯浓度，结果是苯浓度为4. Oppm。以下，将活性炭吸附处理后的丙烯腈称为丙烯腈b。[制备例1-2]直接使用所含苯的浓度为Ilppm的丙烯腈C。[制备例1-3]直接使用所含苯的浓度为8ppm的甲基丙烯腈。菌体的调制[调制例1-1] 培养含有来自嗜热假诺卡氏菌JCM3095的腈水合酶的微生物在500ml带有挡板(baffle)的三角烧瓶中调制IOOml培养基，该培养基具有培养基组成1-1所示的组成，在121°C下用高压釜灭菌20分钟后，添加氨苄西林直至终浓度为50μ g/ml，共准备30瓶。分别在各个带有挡板的三角烧瓶中接种一白金耳的MT-10822株(FERM BP-5785)，在37°C · 130rpm的条件下培养20小时。合并各个带有挡板的三角烧瓶中的培养液后，通过离心分离(15000GX15分钟)，由培养液中仅分离出菌体，然后，将该菌体再次混悬在50ml生理盐水中后，再次进行离心分离，得到湿菌体。[培养基组成1-1]
5.0g/L 酵母提取物 10.0g/L 聚胨
5.0g/L NaCl
10.Omg / L氯化钻·六水合物40.Omg / L疏酸铁·七水合物pH7. 5[调制例1-2]培养含有来源于紫红红球菌J-I株的腈水合酶的微生物使用特公平06-55148号记载的紫红红球菌J-I株(作为FERMBP-1478，基于国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，保藏在上述保藏机构，公众可以向该机构提出请求而获得该菌种)，得到湿菌体。在500ml带有挡板的三角烧瓶中调制IOOml培养基，该培养基具有培养基组成1-2所示的组成，在121°C下用高压釜灭菌20分钟。在该培养基上接种一白金耳的特公平06-55148号所记载的紫红红球菌J-I株(作为FERM BP-1478，基于国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约而保藏在所述保藏机构，公众可以向该机构提出请求而获得该菌种)，在30°C · 130rpm下培养72小时。通过离心分离(15000GX 15分钟)从该培养液中仅分离菌体，然后，将该菌体再次悬浊于50ml生理盐水后，再次进行离心分离，得到湿菌体。[培养基组成1-2]
10.0g/L 葡萄糖 0.5g/L 磷酸二氢钾 0.5g/L 磷酸一氢钾 0.5g / L 硫酸镁·七水合物 l.Og/L 酵母提取物 7.5g / L 胨 7.5g/L 尿素 10.Omg / L氯化钻*六水合物pH7. 2
[实施例1-1]腈化合物转化为酰胺化合物(I)用20mM-Tris -HCl缓冲液(pH7. 5)适当地稀释调制例1_1中所得的湿菌体，向其中添加制备例1-1中所述的丙烯腈b，直至反应液整体的丙烯腈浓度为20重量％，使其在20°C下反应10分钟。此时，水性介质(I)(反应液整体)中的苯浓度为0.8ppm。反应后，向反应液中添加与其等量的IM磷酸水溶液，停止反应，用HPLC分析测定生成的丙烯酰胺浓度。然后，计算每单位湿菌体及单位反应时间的丙烯酰胺的生成速度(=反应速度)。结果示于表1-1。以所得的反应速度为100%，与实施例1-2及实施例1-3、比较例1-1、比较例1-2进行比较。[实施例1-2]腈化合物转化为酰胺化合物(2)用20mM-Tris -HCl缓冲液(pH7. 5)适当地稀释调制例1_1中所得的湿菌体，向其中添加制备例1-2中所述的丙烯腈c至20重量％，使其在20°C下反应10分钟。此时，水性介质(I)中的苯浓度为2. 2ppm。之后与实施例1-1相同地操作。结果示于表1_1。[实施例1-3]腈化合物转化为酰胺化合物(3)在制备例1-1所述的丙烯腈b中添加苯，进行调制直至丙烯腈中的苯浓度为20ppm。将所用的丙烯腈替换为该丙烯腈，与实施例1-1相同地操作。此时，水性介质(I)中的苯浓度为4. Oppm0结果示于表1-1。[比较例1-1]腈化合物转化为酰胺化合物(I)将所用的丙烯腈替换为制备例1-1所述的丙烯腈a，与实施例1-1相同地操作。此时，水性介质(I)中的苯浓度为5. 2ppm。结果示于表1-1。[比较例1-2]腈化合物转化为酰胺化合物(2)在制备例1-1所述的丙烯腈b中添加苯，进行调制直至丙烯腈中的苯浓度为 26ppm。将所用的丙烯腈替换为该丙烯腈，与实施例1-1相同地操作。此时，水性介质(I)的苯浓度为5. 2ppm。结果不于表1-1。由表1-1可知，通过将水性介质⑴中的苯浓度设定在4. Oppm以下，可以抑制反应速度的降低，且导致反应速度降低的原因物质是苯。[实施例1-4]腈化合物转化为酰胺化合物(4)将所用的湿菌体替换为调制例1-2所得的湿菌体，与实施例1-1相同地操作。结果示于表1-2。以所得的反应速度为100%，与实施例1-5、比较例1-3进行比较。[实施例1-5]腈化合物转化为酰胺化合物(5)将所用的湿菌体替换为调制例1-2所得的湿菌体，与实施例1-3相同地操作。结果不于表1-2。[比较例1-3]腈化合物转化为酰胺化合物(3)将所用的湿菌体替换为调制例1-2中所得的湿菌体，与比较例1-1相同地操作。结果不于表1-2。[实施例1-6]腈化合物转化为酰胺化合物(6)用20mM-Tris -HCl缓冲液(pH7. 5)适当地稀释调制例1_1中所得的湿菌体，向其中添加制备例1-3中所述的甲基丙烯腈至20重量％，使其在20°C下反应10分钟。此时，水性介质(I)中的苯浓度为I. 6ppm。向反应液中添加与其等量的IM磷酸水溶液，使反应停止，用HPLC分析测定生成的甲基丙烯酰胺浓度。然后，计算每单位湿菌体及单位反应时间的甲基丙烯酰胺的生成速度(=反应速度)。结果示于表1-3。以所得的反应速度为100%，与实施例1-7、比较例1-4进行比较。[实施例1-7]腈化合物转化为酰胺化合物(7)在制备例1-3中所述的甲基丙烯腈中添加苯，进行调制直至甲基丙烯腈中的苯浓度为20ppm。将所用的甲基丙烯腈替换为该甲基丙烯腈，与实施例1-6相同地操作。此时水性介质(I)中的苯浓度为4. Oppm0结果示于表1-3。[比较例1-4]
腈化合物转化为酰胺化合物(4)在制备例1-3中所述的甲基丙烯腈中添加苯，进行调制直至甲基丙烯腈中的苯浓度为25ppm。将所用的甲基丙烯腈替换为该甲基丙烯腈，与实施例1-6相同地操作。此时水性介质(I)中的苯浓度为5. Oppm。结果示于表1-3。[实施例1-8]腈化合物转化为酰胺化合物(8)将所用的湿菌体替换为调制例1-2中所得的湿菌体，与实施例1-6相同地操作。结果示于表1-4。以所得的反应速度为100%，与实施例1-9、比较例1-5进行比较。[实施例1-9]
腈化合物转化为酰胺化合物(9)将所用的湿菌体替换为调制例1-2中所得的湿菌体，与实施例1-7相同地操作。结果不于表1-4。[比较例1-5]腈化合物转化为酰胺化合物(5)将所用的湿菌体替换为调制例1-2中所得的湿菌体，与比较例1-4相同地操作。结果不于表1-4。[表 1-1]表1-权利要求
1.一种丙烯酰胺的制备方法，其特征在于，所述方法用含有腈水合酶的微生物的菌体或该菌体处理物使丙烯醛浓度为Ippm以下的丙烯腈在水性介质中进行水合反应。
2.一种制备丙烯酰胺类聚合物的方法，所述方法均聚权利要求I所述的丙烯酰胺，或共聚所述丙烯酰胺和能与丙烯酰胺共聚的至少一种不饱和单体，制备丙烯酰胺类聚合物。
全文摘要
本发明提供一种丙烯酰胺的制备方法，其特征在于，所述方法用含有腈水合酶的微生物的菌体或该菌体处理物使丙烯醛浓度为1ppm以下的丙烯腈在水性介质中进行水合反应。
文档编号C12P13/02GK102911973SQ20121036291
公开日2013年2月6日 申请日期2006年10月6日 优先权日2005年10月7日
发明者柴本宽子, 相川敏和, 有井辉夫, 村本正则, 福田伟志, 伊藤洁, 阿部刚也, 羽间宗一 申请人:三井化学株式会社