专利名称：微量血液rna核酸吸附快速分离方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域中血液RNA分离方法，具体涉及从微量血液中快速分离RNA，采用特定的RNA分离试剂与核酸吸附离心套管联合应用，能快速分离血液中的RNA,其分离出的RNA产量和纯度高，无蛋白质和基因组DNA污染，操作简便、耗时短。
背景技术：
目前，国内外对于血液中RNA的提取，多采用淋巴细胞分离液先分离出单个核细胞，然后进行裂解提取。因为分离单个核细胞需要大量的血液，这样给取样带来了困难和不便，更重要地是给病人带来不必要的痛苦和心理负担，以及影响并限制了临床对疾病的检测诊断和研究工作。另外，由于血液中含有大量的RNA酶和红细胞中的某些成分，如果处理不干净会严重影响RNA的提取质量及后续实验的成功，传统的提取RNA方法包括使用淋巴细胞分离液很难做到这一点，且耗时长、操作繁琐。这也是影响血液中RNA提取时容易降解和产量低及不纯的重要原因。
发明内容
针对上述存在的不足和影响因素，本发明的目的在干，提供ー种微量血液RNA核酸吸附快速分离方法，有效抑制内源性RNA酶降解RNA的活性及除去红细胞碎片和成分，操作简单快速，而且纯度高、无蛋白质及基因组DNA污染，产量高。为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案ー种微量血液RNA核酸吸附快速分离方法，其特征在干，该方法采用核酸吸附离心套管，用RNA提取试剂从微量血液中快速分离RNA，所述的RNA提取试剂由红细胞裂解溶液，离解溶液，清除溶液，洗涤液溶和分离溶液组成，具体按操作过程是首先通过红细胞裂解溶液裂解除去微量血液中的红细胞及碎片，再用离解溶液使单个核细胞中的RNA分离，同时抑制内源性RNA酶降解RNA的活性，其溶液通过核酸吸附管中吸附层使RNA被吸附，用清除溶液清除蛋白质及其他杂质成分，再用洗涤溶液清洗，最后用分离溶液使RNA与核酸吸附层脱离,从而获得超纯的RNA ；所述的RNA提取试剂各组分及物质浓度(摩尔/升)组成按终浓度体积为红细胞裂解溶液0.01-lmol/L 的 NH4Cl，0. 0001-0. 3mol/L 的 KHCO3,0. 00001-lmol/L EDTA余量为去离子水；离解溶液0.l-10mol/L 的胍盐，0. 005-0. 5mol/L 的 C6H5Na3O7,0. 0001-lmol/L 的C15H28NaNO3, ,0. 01_2mol/L 的 C2H6OS, 0.ト 10mol/L 的 NaAc，余量为去离子水；清除溶液0. 01-20mol/L的胍盐，0. 001-0. 60mol/L C4H11NO3,余量为こ醇和去离子水的溶液；洗涤溶液0.001-2mol/L NaCl, 0. 0001-2mol/L C4H11NO3,余量为こ醇和去离子水的溶液，所述的核酸吸附离心套管包含内层吸附管和外层收集管，内层吸附管中含吸附介质层，外层套管为液体收集管，使用时将内层吸附管插入到外层收集管中。本发明的微量血液RNA核酸吸附快速分离方法，操作简便，耗时短，取样量少，提取的RNA纯度高，无蛋白质及DNA污染，显示其较传统提取血液RNA方法的优势，更体现出具有普及临床对疾病诊断和研究的应用价值。
图I是实验流程图下面结合附图和实施例对发明进ー步详细说明。
具体实施例方式按照本发明的技术方案，本发明的微量血液RNA核酸吸附快速分离方法，整个实验过程耗时短，井能有效抑制RNA酶活性，加上特异性吸附作用，使得提取的RNA不发生降解，活性高、纯度高。核酸吸附离心套管包括内层吸附管和外层收集管，其中，内层吸附管中含吸附介质层，外层套管为液体收集管，当每加一次试剂时需将内层吸附管插入到外层收集管中，经离心后弃去收集管中废液，再将吸附管返回收集管中，当最后加分离液时，需将吸附管插入到ー干净(新的)的收集管中，再经过离心获得纯化的RNA。核酸吸附材料为圆形纸片，RNA提取试剂由红细胞裂解溶液，离解溶液，清除溶液，洗涤液溶和分离溶液组成。RNA提取试剂各组分及物质浓度(摩尔/升)组成按终浓度体积为红细胞裂解溶液0.01-lmol/L 的 NH4Cl，0. 0001-0. 3mol/L 的 KHCO3,
0.00001-lmol/L EDTA，余量为去离子水；离解溶液:0.l-10mol/L 的胍盐，0. 005-0. 5mol/L 的 C6H5Na3O7,0. 0001-lmol/L 的C15H28NaNO3, ,0. 01_2mol/L 的 C2H6OS, 0.ト 10mol/L 的 NaAc，余量为去离子水；清除溶液0. 01-20mol/L的胍盐，0. 001-0. 60mol/L C4H11NO3,余量为こ醇和去离子水的混合溶液(こ醇去离子水=2:1，v/v)；洗涤溶液0.001_2mol/L NaCl, 0. 0001-2mol/L C4H11NO3,余量为こ醇和去离子水的混合溶液(こ醇去离子水=2:1，v/v)。以下是发明人给出的具体实施例，操作流程參见图I所示I、取0. 5-lml血液，加入3倍体积红细胞裂解溶液混匀，室温放置5min。2>4000r离心Imin弃去上清；3、沉淀中加入Iml离解溶液混匀，室温放置5min。4、将液体吸入核酸吸附管中，室温放置2min。5、12000r离心30s，弃去收集管中的废液，将吸附管插回收集管中。6、加清除溶液，12000r离心30s，弃去收集管中的废液，将吸附管插回收集管中。7、加洗涤溶液，12000r,离心30s，弃去收集管中的废液。8、将吸附管插入ー干净的离心管中，加分离溶液室温放置2min后，12000r离心Imin，即获得纯化的RNA。
权利要求
1.一种微量血液RNA核酸吸附快速分尚方法,其特征在于，该方法米用核酸吸附尚心套管，用RNA提取试剂从微量血液中快速分离RNA，所述的RNA提取试剂由红细胞裂解溶液，离解溶液，清除溶液，洗涤液溶和分离溶液组成，具体按操作步骤是 首先通过红细胞裂解溶液裂解除去微量血液中的红细胞及碎片，再用离解溶液使单个核细胞中的RNA分离，同时抑制内源性RNA酶降解RNA的活性，其溶液通过核酸吸附管中吸附层使RNA被吸附，用清除溶液清除蛋白质及其他杂质成分，再用洗涤溶液清洗，最后用分离溶液使RNA与核酸吸附层脱离,从而获得超纯的RNA ； 所述的RNA提取试剂各组分及物质浓度(摩尔/升)组成按终浓度体积为红细胞裂解溶液:0. 01-lmol/L 的 NH4CIjO. 0001-0. 3mol/L 的 KHCO3,0. 00001-lmol/LEDTA余量为去离子水； 离解溶液:0. l-10mol/L 的月瓜盐，0. 005-0. 5mol/L 的 C6H5Na3O7,0. 0001-lmol/L 的C15H28NaNO3, ,0. 01_2mol/L 的 C2H6OS, 0.ト 10mol/L 的 NaAc，余量为去离子水； 清除溶液0. 01-20mol/L的胍盐，0. 001-0. 60mol/L C4H11NO3,余量为こ醇和去离子水的混合溶液； 洗涤溶液0. 001-2mol/L NaCl,0. 0001-2mol/L C4H11NO3，余量为こ醇和去离子水的混合溶液。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的核酸吸附离心套管包括内层吸附管和外层收集管，其中，内层吸附管中含吸附介质层，外层套管为液体收集管，使用时将内层吸附管插入到外层收集管中。
全文摘要
本发明公开了一种微量血液RNA核酸吸附快速分离方法，采用核酸吸附离心套管，用RNA提取试剂从微量血液中快速分离RNA，RNA提取试剂由红细胞裂解溶液，离解溶液，清除溶液，洗涤液溶和分离溶液组成。本发明操作简便，耗时短，取样量少，提取的RNA纯度高，无蛋白质及DNA污染，显示其较传统提取血液RNA方法的优势，更体现出具有普及临床对疾病诊断和研究的应用价值。
文档编号C12N15/10GK102864140SQ20121033275
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者饶国洲, 李昂, 李晓红, 周洪 申请人:西安交通大学口腔医院