专利名称：：一种HIV-1肽Env<sub>120-128</sub>特异性TCR、其重组逆转录病毒载体与应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明属于生物工程领域，具体涉及一种Hiv-I肽特异性T细胞受体(TCR)，以及利用该TCR制备得到的一种用于艾滋及艾滋/结核共感染疾病基因治疗的逆转录病毒载体，逆转录病毒载体转染得到的CD8+T细胞及其在制备抗艾滋及艾滋/结核共感染疾病药物中的应用。
背景技术：
：人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus,HIV)即艾滋病病毒,入侵人体后将严重破坏人体免疫力，使各种罕见感染及癌症得以在人体内发生，最终形成艾滋病(获得性免疫缺陷综合症)。HIV主要存在于HIV感染者或艾滋病患者体液中，任何能够引起体液交换的行为都有传播HIV的可能，包括性接触传播、血液传播及母婴传播。自上世纪80年代HIV开始在人类中传播以来，将近6000万人感染，其中2500万人死亡。目前尚无可根除HIV、根治艾滋病的药物，也没有证据表明人体会对HIV产生保护性免疫，因此大多数艾滋病病人死于反复继发感染及肿瘤。艾滋病的治疗一方面是抑制病毒在体内的繁殖，增强免疫功能；另一方面是防治机会性感染，缓解症状，延长生命。早期治疗和预防其它感染可延缓病程发展，提高生活质量。目前临床上常用的治疗方法有以下几个方面(1)联合使用几种抗逆转录毒药物的“鸡尾酒疗法”实施抗逆转录病毒治疗，其在降低发病率和病死率、提高生活质量方面有明显作用；(2)针对各种机会性感染的抗生素对症治疗与预防，包括肿瘤的化疗和对症治疗；(3)其他，包括免疫调节治疗、营养支持治疗和中医药治疗等。HIV-I肽Env12Q_128，即艾滋病病毒HIV-1包膜蛋白gpl60的第120-128位氨基酸构成的肽表位(KLTPLCVTL)，存在于80%的多变性HIV-I肽序列中，在HIV-IB亚型病毒株中具有最高度的保守性，可被表达HLA-A*0201的个体识别。T细胞抗原受体(Tcellreceptor,TCR)是所有T细胞表面的特征性标志，在T细胞抗原识别中起关键作用。TCR是由α、β两条肽链构成的异二聚体，每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区(C区)，跨膜区和胞质区等几部分；其胞质区很短，信号传递主要通过与其以非共价键结合的CD3分子进行。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区；V区(Va、νβ)又各有三个高变区⑶R1、⑶R2、⑶R3，其中以⑶R3变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，⑶R1XDR2识别和结合MHC分子抗原结合槽的侧壁，而CDR3直接与抗原肽相结合。根据TCRνα、νβ基因的同源性，可将80多个TCRVa基因分为32个家族、60多个TCRνβ基因分为24个家族。利用每个T细胞克隆均有其独特CDR3序列的特点，采用CDR3谱型分析技术，可测定各TCR家族各CDR3出现的频率，由此反映T细胞的克隆性。未接受抗原刺激的T细胞中，针对各种抗原的T细胞克隆分布均匀，表现为多家族和多克隆性，具体地，表现为各家族均出现呈高斯分布的约8个CDR3峰；抗原刺激则引起识别该抗原的某一个或几个特异TCR家族T细胞反应性增生，表现为该家族CDR3成员出现少于4个峰的寡克隆或单克隆分布，其中具有单克隆CDR3分布(表现为单峰)的TCR家族即是抗原特异单克隆增生的TCR家族。对该家族PCR产物进行测序，可获得抗原特异TCRCDR3序列。
发明内容本发明的目的在于筛选出HIV-I肽Env12Q_128(KLTPLCVTL)特异的TCR基因，利用逆转录病毒载体将其转染到⑶8+T细胞中，获得表达HIV-I肽Eiw12ch128特异TCR的⑶8+T细胞，以及该经过TCR基因修饰的⑶8+T细胞在制备抗HIV药物中的应用。本发明所采用的技术方案是HIV-I肽Eiw12ch128特异性T细胞受体(TCR)，包括α链和β链，其中，α链的CDR3区含有SEQIDNO:3所述的序列；β链的⑶R3区含有SEQIDNO:4所示的序列。优选的，所述HIV-I肽Eiw12ch128特异性TCR的α链是由SEQIDNO:10所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性β链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β链是由SEQIDNO:6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性α链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。优选的，所述Hiv-I肽Env120^128特异性TCR的α链氨基酸序列如SEQIDNO:12所示，β链的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。编码Hiv-I肽Eiw12ch128特异性TCR的基因。一种HIV-I肽Eiw12ch128特异性TCR的融合基因，其序列如SEQIDNO:13所示。一种重组逆转录病毒载体，含有编码HIV-I肽Eiw12ch128特异性TCR的基因。一种重组逆转录病毒载体，含有SEQIDNO:13所示基因。优选的，上述重组逆转录病毒载体的出发载体为pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。上述的重组逆转录病毒载体经包装后得到的逆转录病毒。上述逆转录病毒转染的⑶8+T细胞。HIV-I肽Eiw12ch128特异性TCR，编码该TCR的基因，含有该基因的重组逆转录病毒载体、逆转录病毒，该逆转录病毒转染的CD8+T细胞在制备抗艾滋病、艾滋/结核共感染疾病药物中的应用。实现上述技术方案的具体步骤流程如下I、筛选HIV肽Env12Q_128(KLTPLCVTL)特异的TCR①采用淋巴细胞分离液分离HLA-A*0201型健康志愿者外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)；②计数PBMC，调整PBMC数目为IXIO6/孔，每孔细胞分别加入含HIV肽Eiw12ch12850ng/ml的10%FBS-1640培养基2ml；③培养2h后，加入25U/mlIL-2,第3天补加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2100U/ml，之后以此浓度继续培养11天；④磁珠分选出⑶8+T细胞，提取其mRNA，并逆转录为cDNA；⑤互补决定区3(complementaritydeterminingregion3,CDR3)谱型分析检测刺激前后⑶R3谱型，找出刺激后呈单克隆增生的HIV肽Env12Q_128(KLTPLCVTL)特异的TCRα、β基因家族。2、构建重组逆转录病毒载体①根据GeneBank报道的人TCRα、β基因家族上游可变区(variableregion,V)和下游恒定区(constantregion,C)基因序列，设计TCRα、β链全长基因上、下游引物,扩增出HIV肽特异的TCRα、β全长基因。②设计含TCRα、β链C区下游与⑶3ζ分子融合位点的重组引物，将HIV肽特异的TCRα、β基因片段与⑶3ζ分子进行融合。该步骤的目的在于减少内外源性TCRα、β链的错配，因为⑶8+T细胞存在内源性TCRα、β基因的表达，通过以⑶3ζ链替换α、β全长基因部分C区可以促使外源性α与β基因表达的蛋白正确装配成TCR蛋白分子并稳定表达在CD8+T细胞表面，同时可以避免竞争结合CD8+T细胞表面的CD3分子，增强内外源性TCR的信号传导功能，提高修饰后CD8+T细胞的抗HIV活性。当然，此处还可以采取其他策略来减少内外源性TCRα、β链的错配，如将α、β链C区的9个氨基酸分别用鼠C区相应位点的氨基酸替换(LuoW，ZhangXB,HuangYT,HaoPP,JiangZM,WenQ,ZhouMQ,JinQ,MaL.DevelopmentofgeneticallyengineeredCD4+andCD8+T-cellsexpressingTCRsspecificfora38kDaM.tuberculosisantigen.JMolMed.2011,89(9):903-13);在外源性α、β基因C区引入二硫键(Boulter,J.M.etal.(2003)Stable,solubleT—cellreceptormoleculesforcrystallizationandtherapeutics.ProteinEng.16，707-711);突变外源性α、β基因C区关键氨基酸以改变α、β链之间的静电荷(Voss,R.H.etal.(2008)MoleculardesignoftheCabinterfacefavorsspecificpairingofintroducedTCRabinhumanTcells.J.Tmmunol·180,391-401);将外源性α、β基因V区合并为一条单链TCR并与CD3ζ链融合(Willemsen，R.A.etal.(2000)GraftingprimaryhumanTlymphocyteswithcancer-specificchimericsinglechainandtwochainTCR.GeneTher.7,1369-1377);利用2A连接外源性ct、β基因实现平衡表达(LeisegangM,EngelsB,MeyerhuberP,KiebackE,SommermeyerD,XueSA,ReussS，StaussH,Uckertff.EnhancedfunctionalityofTcellreceptor-redirectedTcellsisdefinedbythetransgenecassette.JMolMed.2008,86:573-583.)等。③通过F2A上的AgeI酶切位点将HIV肽特异的α-⑶3ζ、β-⑶3ζ融合基因进行拼接。④将测序正确的1^011(^-0)34424-1^0}^0-0)34融合基因插入逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP并酶切鉴定。⑤采用脂质体转染法，将pMX-hVβhCβ-CD3ζ_F2A_hVahCa-CD3ζ-IRES-GFP与包膜蛋白质粒VSV-G共转染GP2-293包装细胞。⑥收集48h_72h病毒上清，低温超速离心浓缩纯化病毒。⑦重组病毒感染NIH3T3细胞，流式细胞术检测病毒滴度，计算公式病毒滴度(IU/ml)=NIH3T3细胞数XGFP阳性率/病毒浓缩液量(ml)。3、鉴定重组逆转录病毒转染的⑶8+T细胞的抗结核和抗HIV活性①采用Ficoll密度梯度离心法，分离HLA-A*0201型供者外周血PBMC；②磁珠分选CD8+T细胞；③IL-2和抗CD3单抗活化分选出的T细胞；④按感染复数(multiplicityofinfection,MOI)=13将上述重组逆转录病毒感染CD8.T细胞；⑤使用IL-2和抗⑶3单抗刺激感染后的⑶8+T细胞；⑥流式细胞术检测病毒感染后GFP表达阳性细胞的百分比；⑦测定病毒转染的⑶8+T细胞的抗HIV活性实验设置阴性对照组(HIV肽Eiw12ch128特异TCR基因修饰的⑶8+T细胞+树突状细胞(dendriticcells，DC))、未转染组(未转染CD8.T细胞+负载HIV肽Env120^128的DC)、空载体转染组(空载体转染CD8+T细胞+负载HIV肽Eiw12ch128的DC)、无关肽组(HIV肽Eiw12ch128特异TCR基因修饰的CD8+T细胞+负载CMVpp65495_503的DC)、HIVTd+HIV-DC组(HIV肽Env120^128特异TCR基因修饰的CD8+T细胞+负载HIV肽Eiw12ch128的DC)。用酶联免疫吸附分析法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测上述各组细胞培养上清中IFN-Y、TNF-α的分泌水平；用时间分辨荧光免疫分析技术(time-resolvedfluoroimmuno-assay,TRFIA)检测CD8+T细胞对DC的杀伤活性。其中，CD8+T细胞是人体内的一种细胞亚群，可由人外周血中分离获得，并进行体外扩增培养，分离和培养的实验设备要求低，技术成熟。逆转录病毒载体是由一种逆转录病毒序列构建的基因运载工具，能够携带外源基因或DNA进入宿主细胞，并整合到染色体基因组上，目前已成为商业化产品，容易购买和获得。重组逆转录病毒载体的构建方法为本领域常用的分子克隆技术，重组逆转录病毒转染方法是目前常用的生物技术手段，除本发明中使用的人工脂质体法外，还可以使用其它化学转染法，包括=DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法；以及物理方法，包括显微注射、电穿孔、基因枪等。本发明的有益效果在于本发明成功筛选出HIV肽Eiw12ch128特异的TCR，携带该肽特异TCR基因的逆转录病毒转染的⑶8+T细胞可成功表达外源性TCR基因，特异性识别HIV肽Eiw12ch128并介导IFN-Y、TNF-α细胞因子分泌和细胞毒活性，具有艾滋病及艾滋/结核共感染疾病基因治疗的应用价值，可为艾滋病及艾滋/结核共感染疾病的过继细胞免疫治疗开辟新径。图IHIV肽Env120^128刺激前后CD8.T细胞TCRα和β链CDR3谱型分析；图2重组逆转录病毒载体pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ_F2A_hVαIlhCα-CD3ζ-IRES-GFP构建示意图3pMX-hVβ18hCP-CD3ζ-F2A-hVaIlhCa-CD3ζ-IRES-GFP的酶切鉴定(Μ.DL15000marker；1.pMX-IRES-GFP空载体；2.pMX-IRES-GFP空载体的XhoI酶切产物；3.pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ_F2A_hVαIIhCα-CD3ζ-IRES-GFP；4.pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ-F2A-hVαIIhCα-CD3ζ-IRES-GFP的XhoI酶切产物；5.pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ_F2A_hVα11hCα-CD3ζ-IRES-GFP的Xhol+Notl双酶切产物)；图4荧光显微镜观察重组病毒转染后NIH3T3细胞GFP的表达(XlO)(a.明场；b.荧光；c.置加图);图5流式细胞术检测重组病毒转染后NIH3T3细胞的GFP表达阳性率(a.未转染；b.pMX-hVβ18hCβ-CD3ζ_F2A_hVαIlhCα-CD3ζ-IRES-GFP)；图6荧光显微镜观察重组病毒转染后⑶8+T细胞GFP的表达(X10；EmTd:空载体转染组；HIVTd:重组病毒转染组)；图7流式细胞术检测重组病毒转染后⑶8+T细胞GFP的表达(UnTd:未转染组；EmTd空载体转染组；HIVTd:重组病毒转染组)；图8ELISA检测⑶8+T细胞IFN-Y的分泌水平；图9ELISA检测⑶8+T细胞TNF-α的分泌水平；图10TRFIA检测⑶8+T细胞的杀伤活性。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件操作，例如Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(第三版)(SambrookJ,RussellDW,JanssenK,ArgentineJ.黄培堂等译，2002，北京科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中，所有计量资料结果用±s表示，采用单因素方差分析(One-Way八勵￥4)比较各组间细胞因子正^￥、了即-0分泌水平的差异，方差不齐时用Welch校正，采用LSD法进行各组间两两比较，方差不齐时采用Dunnett’sT3法校正。检验水准α=0.05，双侧检验。采用SPSS17.Oforwindows统计软件包进行数据分析。实施例I.筛选HIV-I肽Env12Q_128(KLTPLCVTL)特异的TCRI.I密度梯度离心法分离纯化PBMC(1)在15ml刻度无菌离心管加入适量Ficoll淋巴细胞分离液；(2)取肝素抗凝的外周静脉血与等量RPMI1640液充分混匀稀释，用巴斯德滴管吸取2倍体积的抗凝血沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液上，注意保持界面完整。If20°C，1800"2000rpm/min水平离心2030min；(3)离心后管内液体分为四层，上层为血浆和稀释液，管底主要为红细胞和粒细胞层。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的灰白色云雾层；(4)用吸管插到灰白色层，吸取单个核细胞，置于另一离心管内，加入5倍以上体积的RPMI1640液，1820°C，1500rpm/min离心lOmin，洗涤细胞两次去除大部分混杂的血小板后为PBMC；(5)细胞计数及细胞活力检测PBMC细胞悬液与1/10体积的O.4%台酚蓝染液混合，于血球计数板上计数板上角上四个大方格总细胞数，总细胞数的四分之一数乘以IO4即为每毫升浓度；死细胞可着色台盼蓝，活的不着色，计数200个淋巴细胞，计算活细胞百分率[活细胞率％=(活细胞数/总细胞数)X100%]。I.2制备HIV肽Eiw12ch128特异T细胞克隆(1)计数PBMC,调整PBMC数目为IXIO6/孔，分别加入含HIV-1肽Env120^12850ng/ml的10%FBS-1640培养基2ml；(2)37。C、5%CO2条件下培养2h后，加入IL-225U/ml；(3)第3天补加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2100U/ml，之后以此浓度继续培养11天。I.3免疫磁珠(德国美天旎生物公司)分选⑶8+T细胞I.4总RNA提取试剂盒(OMEGA)提取上述收集到的细胞沉淀的总RNAI.5逆转录(RT)试剂盒(Fermentas)合成cDNA。I.6PCR扩增34个TCRVa基因家族CDR3片段(参照文献XIN_SHENG等，2006，Clinical&LaboratoryHaematology,28:405-415.)利用34条TCRVa家族特异性上游引物和共用下游Cα外、内侧引物做半巢式PCR:第一轮PCR:每样本做34个PCR反应管，第I34管分别加入TCRVaI至Va34家族上游引物，每管加共用下游Cα外侧引物Iμ1，各引物浓度均为10μΜ。每PCR反应管体积为25μ1，含cDNA模板I.0μ1，10mmol/LdNTP0.5μI,IOXBuffer2·5μ1，25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U。PCR反应条件95°C预变性3min;95°C30s,60°C30s，72。Clmin，35个循环；72。C延伸lOmin。第二轮PCR:反应总体积为25μ1，含第一轮PCR产物2μl，10mmol/LdNTP0.5μI,IOXBuffer2.5μl,25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U，TCRVα34条家族上游引物1μ1，下游FAM标记内侧Ca引物Iμ1，各引物浓度均为10μM。PCR反应条件95。C2min；60°C2min，72。C10min，4个循环。I.7PCR扩增24个TCRνβ基因家族CDR3片段(参照文献XIN_SHENG等，2006，Clinical&LaboratoryHaematology,28:405-415.)每样本做24个PCR反应管，每管加入TCRCβ-FAM下游引物Iμ1，第I至第24管分别加入TCRνβ至TCRVβ24上游引物Iμ1，各引物浓度均为10μM15PCR反应体积为25μ1，含cDNA模板Iμ1，10mmol/LdNTP0.5μI,IOXBuffer2.5μl,25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U。PCR反应条件94。C变性3min;94。Clmin,55°Clmin，72。Clmin,35个循环；72°C延伸lOmin。1.8琼脂糖凝胶电泳取34个TCRVa和24个TCRνβ基因家族PCR产物各5μ1，2%琼脂糖凝胶电泳，110V，20min,采用凝胶成像系统照相。剩余PCR产物-20°C保存备用。I.9CDR3谱型分析取34个Va、24个νβ基因家族FAM荧光标记PCR产物2μ1，在373DNA序列分析仪(ABI,PerkinElmer)上进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，收集电泳过程中不同时间出现的不同强度的荧光信号，GeneScan672软件自动分析收集的数据，转换为不同位置、高度和形态的峰，代表各TCR家族CDR3成员出现的频率，由此反映各TCR家族的克隆性。其中，具有单峰分布的TCR家族即是抗原特异性单克隆增生的TCR家族。⑶R3谱型分析结果显示，抗原肽刺激⑶8+T细胞后，部分TCR基因家族谱型发生改变，由原来的8个或多于8个峰型的高斯分布变为少于8个峰的单寡峰分布，表明这些家族是由于抗原肽持续刺激引起的寡克隆或单克隆增生。比较刺激前后CDR3谱型的变化，找出刺激前为多克隆，HIV肽刺激后分别呈单克隆扩增的Va11、νβ18基因家族(图I)。测序显示，HIV-I肽Env120_128(KLTPLCVTL)特异的TCRVa11、νβ18的CDR3区的核苷酸序列如SEQIDNO:I和SEQIDNO:2所示，两条⑶R3序列编码的氨基酸序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。2.构建重组逆转录病毒载体(构建流程见图2)2.I合成引物依据TCR⑶R3谱型，筛选出刺激前呈多克隆峰型、刺激后为单峰的TCRVa、νβ基因家族，依据GeneBank报道的该基因家族V区序列设计全长基因上、下游引物，依据文献报道设计与CD3(分子融合处的重组引物，依据F2A肽连接序列设计重组引物，全部引物由Invitrogen上海英骏生物技术有限公司合成，引物名称和序列(5，to3’)如下权利要求1.HIV-l肽EnVl2(l_128特异性T细胞受体(TCR)，包括α链和β链，其中，α链的⑶R3区含有SEQIDNO:3所述的序列；β链的⑶R3区含有SEQIDNO:4所示的序列。2.根据权利要求I所述的HIV-I肽Eiw12ch128特异性TCR，其特征在于，所述TCR的α链是由SEQIDNO:10所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性β链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β链是由SEQIDNO:6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性α链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的HIV-I肽Eiw12ch128特异性TCR，其特征在于，所述α链的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示，β链的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。4.编码权利要求I3任一项所述TCR的基因。5.—种HIV-I肽Env120^128特异性TCR的融合基因，其序列如SEQIDNO:13所示。6.一种重组逆转录病毒载体，含有权利要求4或5所述的基因。7.根据权利要求6所述的重组逆转录病毒载体，其特征在于，出发载体包括pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。8.权利要求6或7所述的重组逆转录病毒载体经包装后得到的逆转录病毒。9.权利要求8所述的逆转录病毒转染的CD8+T细胞。10.权利要求I3任一项所述的HIV-I肽Eiw12ch128特异性TCR、权利要求4或5所述的基因、权利要求6或7所述的重组逆转录病毒载体、权利要求8所述的逆转录病毒、权利要求9所述的逆转录病毒转染的CD8+T细胞在制备抗艾滋病、艾滋/结核共感染疾病药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种HIV-1肽Env120-128特异性TCR、其重组逆转录病毒载体与应用。本发明成功筛选出HIV-1肽Env120-128(KLTPLCVTL)特异的TCR基因，利用逆转录病毒载体将其转染到CD8+T细胞中，获得表达HIV-1肽Env120-128特异TCR的CD8+T细胞。该经过TCR基因修饰的CD8+T细胞可成功表达外源性TCR基因，特异性识别HIV肽Env120-128并介导IFN-γ、TNF-α细胞因子分泌和细胞毒活性，具有艾滋病及艾滋/结核共感染疾病基因治疗的应用价值，可为艾滋病及艾滋/结核共感染疾病的过继细胞免疫治疗开辟新径。文档编号C12N15/867GK102875667SQ201210326568公开日2013年1月16日申请日期2012年9月5日优先权日2012年9月5日发明者马骊,郝佩佩,温茜,罗微申请人:南方医科大学