专利名称：一种鸭黄病毒检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及一种鸭黄病毒检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
蛋鸭新减蛋综合征是2010年4月在宁波乃至全国新爆发的一种疫病，本病来势凶猛、传播迅速，造成宁波市养鸭户经济损失至少6000万元。据国家水禽体系专家初步统计，本病在养鸭业造成的损失至少100亿元。目前已知的蛋鸭新减蛋综合征是由一种与坦布苏病毒同源性很相近的黄病毒属的病毒引起的传染病，有研究者称该病原为鸭坦布苏病毒也有称鸭黄病毒。为了有效保护·养鸭产业的健康发展，以减少养鸭业的经济损失，确保农民利益，需要对本病的病原鸭黄病毒的特性、检测方法和防控措施等进行系列、深入的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种鸭黄病毒检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高，结果准确，可以在蛋鸭感染减蛋综合征的早期阶段对从病鸭采集的病料进行快速、灵敏、准确的检测，同时也可以对病毒分离物鸭胚/鸡胚尿囊液进行检测验证，使对该病的防控及时采取措施，大大减少了蛋鸭新减蛋病造成的危害。本发明所要解决的技术问题还在于提供上述鸭黄病毒检测试剂盒的检测方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是一种鸭黄病毒检测试剂盒，所述试剂盒包括i、RNA提取试剂，包括Trizol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水；i i、反转录PCR试剂，包括反转录反应试剂和PCR反应试剂；所述反转录反应试剂包括O. 2 μ g/μ I 的 Random primer、DEPC 水、5Xbuffer、IOmM 的 dNTP、20u/ μ I 的 Rnase 抑制剂、200u/ μ I 的 M-MuLV 以及样品总 RNA ；所述PCR反应试剂包括20ιι/μ I的ExTaq酶、IOmM的鸭黄病毒通用上游引物DFV-FUOmM的鸭黄病毒通用下游引物DFV-R，2. 5mM的dNTPUOXbuffer ； 所述鸭黄病毒通用上游引物DFV-F为5' -AATTCGACACATGAGATGTAC-3'；所述鸭黄病毒通用下游引物DFV-R为Y -CCAAGCCACATGTACCA-3'；i i i、鸭黄病毒鸭胚尿囊毒阳性对照和阴性样品。上述鸭黄病毒检测试剂盒的检测方法，其步骤包括第一步，从待测鸭胚尿囊液样品中提取总RNA，其提取方法是1. 5mlEP管中加O. 2ml待测鸭胚尿囊液样品后，加入O. 8ml Trizol试剂，混匀，室温静置10_30min ;加0. 2ml氯仿，振荡混勻15s,室温静置10-15min ；4°C, 12000g离心15min ;取水层,加等体积的异丙醇，混匀，室温静置IOmin ;4°C，12000g离心IOmin ;弃去上清，加Iml 75%乙醇，4°C，7500g离心5min ;弃去上清,沉淀干燥5-lOmin,加20 μ I DEPC水溶解,得总RNA ；
第二步，以所述第一步提取的总RNA为模板，进行反转录反应，反转录反应的步骤为1μ g 总 RNA 加 1μ I Random primer 加 DEPC 水至 12 μ 1，65°C冰浴 5min ;再力卩 4 μ I5Xbuffer,2 μ I IOmM dNTPU μ I RNase 抑制剂、I μ I M-MuLV、混匀，25°C 5min，42°C lh，70°C 5min，得反转录产物；第三步，以所述反转录产物为模板，进行PCR扩增，所述PCR体系为=ExTaq酶O. 25 μ I，IOmM 的引物 DFV-F 和 IOmM 的引物 DFV-R 各 2 μ l，2.5mM 的 dNTP 4 μ I, IOXbufer5 μ 1，模板2. 5 μ 1，加水至50 μ I ;所述PCR反应体系的反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s, 54°C退火30s, 72°C延伸50s, 30个循环，72°C延伸IOmin ；第四步，取所述第三步PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，用EB染色，在紫外光下观察，看到明亮的DNA条带为阳性结果，如无肉眼可见的条带则为阴性结果。本发明与现有技术相比，具有如下优点
( I)本发明试剂盒能特异地检测到从疑似病料中分离到的3株鸭黄病毒，而对其它禽病病毒如鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒、小鹅瘟病毒、流感病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒检测结果为阴性。该试剂盒可以最低检测到3. 2ng/ul的反转录产物cDNA。因此该试剂盒检测灵敏度高，结果准确，可以在蛋鸭感染黄病毒后对其进行快速、灵敏、准确的检测，大大减少了蛋鸭新减蛋综合征造成的危害。(2)本试剂盒所用的引物是根据黄病毒高度保守的非结构蛋白NS5蛋白基因设计合成的，因此，对鸭黄病毒不同毒株的检测具有通用性。(3)利用本发明引物可特异地检测到鸭黄病毒的核酸，对黄病毒核酸的最低检测量为3. 2ng/y I。序列测定和分析表明本发明方法扩增的DNA片段为NS5的基因片段，长度为 806bp。(4)本发明建立了一种快速、特异、准确的鸭黄病毒检测方法，为今后对该病的流行监测和防控提供了检测工具。
图I为鸭黄病毒核酸RT-PCR扩增结果图。1，ZJ_1分离株阳性结果；2，阴性对照。图2为鸭黄病毒核酸检测RT-PCR特异性。1_3，鸭黄病毒3个分离株RT-PCR ;4_9，分别为鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒、小鹅瘟病毒、流感病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR ; 10，阴性对照。图3为鸭黄病毒核酸检测敏感性。1,3. 2X IO3Hg/U I ;2,3. 2X102ng/u I ;3,3. 2X lO^g/ μ I ;4，3· 2Χ 10°ng/ μ I ;5，3· 2Χ 10_1ng/ μ I ;6，3· 2Χ l(T2ng/y I ；7,
3.2Xl(T3ng/y I ;8，3· 2Xl(T4ng/y I ;9，3· 2Xl(T5ng/y I ;10，3· 2Xl(T6ng/y I。
具体实施例方式I.将本实验室从疑似病料中分离到的鸭黄病毒株接种10-11日龄鸭胚或9-10日龄鸡胚。收获接种24小时后的死胚尿囊液，-70°C保存，作为总RNA提取的材料。同时收获未接种的鸭胚尿囊液做为阴性对照。2.根据黄病毒非结构蛋白NS5基因上的保守序列，设计合成了如下引物DFV-F 为 5' -AATTCGACACATGAGATGTAC-3'；
DFV-R 为 5' -CCAAGCCACATGTACCA-3'；预计扩增鸭黄病毒806bp的DNA片段。3.取上述收获的尿囊液O. 2ml加入I. 5ml EP管中，然后加入O. 8ml Trizol试剂，混匀，室温静置10-30min ;再加入O. 2ml氯仿，振荡混匀15s，室温静置10_15min ；4°C,12000g离心15min ;取水层，加等体积的异丙醇，混匀，室温静置IOmin ;4°C，12000g离心IOmin ;弃去上清,力口 Iml 75%乙醇,4。。，7500g离心5min ;弃去上清,沉淀干燥5-lOmin,加20 μ I DEPC水溶解，得总RNA ;用Nanodrop测定RNA的浓度。4.取 I μ g 上述总 RNA 加入 I μ I Random primer 后，加 DEPC 水至 12 μ I。65°C冰浴 5min 后；体系中再加入 4μ I 5Xbuffer,2 μ I IOmM dNTP、I μ IRNase 抑制剂、I μ IM-MuLV，混匀，然后经25°C 5min，42°C lh,70°C 5min进行RT反应，最后获得反转录产物。反转录产物也经Nanodrop测定的浓度。 5.取来自感染和未感染鸭胚尿囊液的反转录产物cDNA各2. 5 μ 1，分别加入IOmM的引物 DFV-F 和 IOmM 的引物 DFV-R 各 2 μ I，2. 5mM 的 dNTP4 μ I, IOXbuffer 5 μ I，模板2. 5μ 1，加水至50μ I ;上述PCR反应体系经94°C预变性5min，94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸50s，30个循环，72°C延伸IOmin的程序进行PCR扩增。PCR产物经I. 5%的琼脂糖凝胶电泳后，EB染色，在紫外线下观察。结果如图I所示，黄病毒分离株感染的样品在806bp的位置出现了明亮的DNA条带，而阴性样品没有条带出现。6.回收阳性的PCR产物。回收的PCR产物连接到T载体后，送测序公司测序。序列分析的结果显示，扩增的片段为806bp (SEQ ID NO: I)，序列为黄病毒的NS基因序列。7. PCR反应的特异性检测取本实验室分离到的3个毒株的鸭胚尿囊毒和其它禽病病毒鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒、小鹅瘟病毒、流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒的鸭胚或鸡胚尿囊毒的核酸的反转录产物在相同条件下进行PCR。结果如图2所示，只有从3个鸭黄病毒的分离株中扩增到预期大小的目的DNA片段，而从其它选用的禽病病毒中未扩增出任何DNA条带，说明建立的RT-PCR方法具有强的特异性。8. RT-PCR反应的敏感性试验。将浓度为3. 2X103ng/U I的鸭黄病毒阳性模板cDNA做10倍系列稀释后进行PCR反应。图3结果显示，模板稀释到3. 2 X10°ng/U I时，还能明显看到扩增条带，再往下稀释到3. ZXlO'g/y 1，也还能隐约看到有目的片段。因此，建立的鸭黄病毒的RT-PCR方法至少能检测到每微升里的3. 2ng的cDNA。如上，便可以较好地实现本发明。
权利要求
1. 一种鸭黄病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括 1.RNA提取试剂，包括Trizol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水； ii、反转录PCR试剂，包括反转录反应试剂和PCR反应试剂； 所述反转录反应试剂包括O. 2 μ g/ μ I的Random primer、DEPC水、5Xbuffer、10mM的dNTP、20u/y I 的 Rnase 抑制剂、200ιι/μ I 的 M-MuLV 以及样品总 RNA ； 所述PCR反应试剂包括20ιι/μ I的ExTaq酶、IOmM的鸭黄病毒通用上游引物DFV-F、IOmM的鸭黄病毒通用下游引物DFV-R，2. 5mM的dNTP、10Xbuffer ； 所述鸭黄病毒通用上游弓I物DFV-F为5' -AATTCGACACATGAGATGTAC-3'； 所述鸭黄病毒通用下游引物DFV-R为5' -CCAAGCCACATGTACCA-3'； i i i、鸭黄病毒鸭胚尿囊毒阳性对照和阴性样品。
2.根据权利要求I所述的鸭黄病毒检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂扩增获得的PCR产物为SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求I所述的鸭黄病毒检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂扩增获 得的PCR产物为与SEQ ID NO: I所示同源性在99%以上的核苷酸序列。
4.权利要求I所述的鸭黄病毒检测试剂盒的检测方法，其特征在于，其步骤包括 第一步，从待测鸭胚尿囊液样品中提取总RNA，其提取方法是1. 5mlEP管中加O. 2ml待测鸭胚尿囊液样品后，加入O. 8ml Trizol试剂，混匀，室温静置10_30min ;加O. 2ml氯仿，振荡混勻15s,室温静置10-15min ;4°C, 12000g离心15min ;取水层,加等体积的异丙醇,混勻，室温静置IOmin ；4°C, 12000g离心IOmin ;弃去上清,力口 Iml 75%乙醇，4°C,7500g离心5min ;弃去上清，沉淀干燥5-10min，加20 μ I DEPC水溶解，得总RNA ； 第二步，以所述第一步提取的总RNA为模板，进行反转录反应，反转录反应的步骤为I U g 总 RNA 加 I μ I Random primer 加 DEPC 水至 12 μ 1,65 °C 冰浴 5min ;再力卩 4 μ I5 Xbuffer,2 μ I IOmM dNTPU μ I RNase 抑制剂、I μ I M-MuLV、混匀，25°C 5min，42°C lh，70°C 5min，得反转录产物； 第三步，以所述反转录产物为模板，进行PCR扩增，所述PCR体系为ExTaq酶O. 25μ I,IOmM 的引物 DFV-F 和 IOmM 的引物 DFV-R 各 2 μ 1,2. 5mM 的 dNTP 4 μ 1，IOXbuffer 5 μ 1，模板2. 5 μ 1，加水至50 μ I ;所述PCR反应体系的反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s, 54°C退火 30s, 72°C延伸 50s, 30 个循环，72°C延伸 IOmin ； 第四步，取所述第三步PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色后判断结果。
5.根据权利要求2所述的鸭黄病毒检测试剂盒的检测方法，其特征在于，扩增获得的PCR产物为SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求2所述的鸭黄病毒检测试剂盒的检测方法，其特征在于，扩增获得的PCR产物为与SEQ ID NO: I所示同源性在99%以上的核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种鸭黄病毒检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括i、RNA提取试剂，ii、反转录PCR试剂，包括反转录反应试剂和PCR反应试剂，iii、鸭黄病毒鸭胚尿囊毒阳性对照和阴性样品。所述检测方法包括第一步，从待测鸭胚尿囊液样品中提取总RNA；第二步，以所述第一步提取的总RNA为模板，进行反转录反应；第三步，以所述反转录产物为模板，进行PCR扩增；第四步，取所述第三步PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色后判断结果。本发明可特异地检测到鸭黄病毒的核酸，最低检测量为3.2ng/μl；建立了一种快速、特异、准确的鸭黄病毒检测方法，为今后对该病的流行监测和防控提供了检测工具。
文档编号C12Q1/70GK102839225SQ201210323150
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者陆新浩, 廖敏, 陈秋英, 刘鸿, 朱梦代, 吴勇, 周继勇, 任祖伊 申请人:余姚市禽畜病防治研究所