专利名称：分离自土壤的高抗草甘膦epsp合酶及其编码序列的制备和用途的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及分离来自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的制备与用途，具体涉及从草甘膦污染土壤微生物群体DNA库中分离的具有草甘膦耐受性的5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSP合酶)基因及其蛋白产物的制备与用途。
背景技术：
草甘膦(Glyphosate)为内吸传导型、广谱灭生性除草剂，其作用机制是通过抑制植物体内5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSPS)活性，阻断植物体内芳香族氨基酸的 生物合成，导致植物死亡。应用化学诱变细菌产生的aroA突变体，抗药性机理研究确证了 aroA基因是草甘膦作用靶标EPSP合酶的编码基因。近年来包括美国和中国在内的国家，草甘膦产量急剧增加还与系列转基因抗草甘膦作物品种的选育和大面积推广有直接的关系。美国Mosanto和Calegene等公司在EPSP合酶的编码基因及其抗草甘膦转基因植物等方面已申请了 100余份专利，获得转基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等系列作物品种，其中大豆等多种转基因作物已进入商品化生产。抗草甘膦转基因植物的研究开发对农业发展可起到巨大推进作用，因此，为选育新的高抗草甘膦的转基因作物本领域迫切需要开发新的具有抗草甘膦用途的5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种可提高植物草甘膦抗性的EPSP合酶及其编码序列的制备和用途，本发明通过从草甘膦极端污染环境中采集土壤样品，构建草甘膦污染土壤微生物群落水平DNA库，分离获得了一种EPSP合酶，并且通过实验证实了它具有高抗草甘膦抗性，并且转入植物后，可导致植物抗草甘膦抗性的提高。本发明通过如下技术方案实现
一种分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，用于提高植物对草甘膦的抗性。分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶包含SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶为如下多肽，
(a)具有SEQID NO: 2氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQID N0:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。
分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶的酶活性为25. 57U/mg。分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，编码所述高抗草甘膦EPSP合酶的多核苷酸序列选自下组(a)编码上述EPSP合酶多肽的SEQ ID NO: I的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，所述编码EPSP合酶多肽的SEQ ID N0:1的多核苷酸序列选自下组的一种
(a)具有SEQ ID NO: I中1-1335位的序列；
(b)具有SEQID NO: I中1-1338位的序列。
一种用于提高植物对草甘膦的抗性的载体，含有如上所述的多核苷酸。一种用于提高植物对草甘膦的抗性的宿主细胞，含有如上所述的载体。分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶的制备方法，(a)培养上述含有如权利要求7所述的多核苷酸的载体转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有活性的多肽。一种能与如上所述的高抗草甘膦EPSP合酶特异性结合的抗体。一种改变植物抗草甘膦抗性的方法，它包括步骤
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有EPSP合酶DNA编码序列，所述的EPSP合酶选自下组
(a)具有SEQID NO: 2氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQID N0:2氨基酸序列经过一个到二十个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽；
(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(I)中的农杆菌接触，从而使EPSP合酶DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(3)选择出转入EPSP合酶DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；
(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。在本发明中，术语“ EPSPS ”、“ EPSP合酶”、“ EPSP合成酶” “ EPSP多肽”或“ 5_烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶”可互换使用，都指具有5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSPS)氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的EPSP合酶。如发明所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如发明所用，“分离的EPSP合酶或多肽”是指EPSP多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化EPSP合酶。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。 本发明还包括EPSP合酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然EPSP合酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语“EPSP多肽”指具有EPSP合酶活性的SEQ ID NO. 2序列的多肽。该术语还包括具有与EPSP合酶相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括EPSP合酶的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与EPSPS DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗EPSP多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含EPSP多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了 EPSP多肽的可溶性片段。通常，该片段具有EPSP多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。发明还提供EPSP合酶或多肽的类似物。这些类似物与天然EPSP多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到。在本发明中，“EPSP合酶保守性变异多肽”指与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。表I
夏￥的残基I代表性的取代I优选的坂 T
Ala(A)Val; Leu; HeVal
Arg(R)Lys;Gin;AsnLys
Asn (N)Gln;His;Lys;ArgGln
Asp (D)GluGlu
Cys (C)SerSer
Gln (Q)AsnAsn
Glu(E)AspAsp
Gly(G)Pro;AlaAla
His (H)Asn;Gln;Lys;ArgArg
He (I)Leu; Val; Met; Ala; PheLeu
权利要求
1.一种分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，所述编码序列包含SEQ ID NO: 1，其特征在于用于提高植物对草甘膦的抗性。
2.如权利要求I所述的分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，其特征在于高抗草甘膦EPSP合酶包含SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
3.如权利要求2所述的分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，其特征在于高抗草甘膦EPSP合酶为如下多肽， (a)具有SEQID NO: 2氨基酸序列的多肽； (b)将SEQID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。
4.如权利要求3所述的分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，其特征在于高抗草甘膦EPSP合酶的酶活性为25. 57U/mg。
5.如权利要求4所述的分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，其特征在于高抗草甘膦EPSP合酶的夂值为0. 0443 ±0. 012。
6.如权利要求5所述的分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，其特征在于高抗草甘膦EPSP合酶的&值为0. 746 ±0. 007。
7.如权利要求6所述的分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，其特征在于编码所述高抗草甘膦EPSP合酶的多核苷酸序列选自下组(a)编码上述EPSP合酶多肽的SEQ ID NO: I的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
8.如权利要求7所述的分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，其特征在于所述编码EPSP合酶多肽的SEQ ID NO:l的多核苷酸序列选自下组的一种 (a)具有SEQ ID NO: I中1-1335位的序列； (b)具有SEQ ID NO: I中1-1338位的序列。
9.一种含有如权利要求8所述的多核苷酸的用于提高植物对草甘膦的抗性的载体。
10.一种含有如权利要求9所述的载体用于提高植物对草甘膦的抗性的宿主细胞。
全文摘要
本发明提供一种可提高植物草甘膦抗性的EPSP合酶及其编码序列的制备和用途，本发明通过从草甘膦极端污染环境中采集土壤样品，构建草甘膦污染土壤微生物群落水平DNA库，分离获得了一种EPSP合酶，并且通过实验证实了它具有高抗草甘膦抗性，并且转入植物后，可导致植物抗草甘膦抗性的提高。
文档编号C12N15/82GK102776161SQ20121028770
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月14日 优先权日2012年8月14日
发明者何军光, 刘英新, 吴涛, 张维, 徐京, 林敏 , 楼亿圆, 燕永亮, 王伟, 王林辉, 陆伟, 陈明, 黄明春 申请人:中国农业科学院生物技术研究所, 浙江新安化工集团股份有限公司