专利名称：激光诱变海水小球藻快速积累油脂突变藻株的方法
技术领域：
本发明提供一种激光诱变海水 小球藻快速积累油脂突变藻株的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
小球藻(Chlorella)是一种常见的水生单细胞藻类，是绿藻小球藻科中的一个重要属，生态分布广泛，在海水和淡水中均有分布，目前包括大约10个种。小球藻细胞内含有丰富的蛋白质、必需氨基酸、多糖、脂类、叶绿素、胡萝卜素和维生素等等，在保健食品、水产养殖、化妆品、医药等领域内应用广泛，国内外市场供不应求。与美国、日本、以色列等国家相比，我国的小球藻工业化大规模培养水平相对滞后。小球藻是一种球形单细胞藻类，通常生长在富营养化的水体中，但在人工培养条件下能大量生长繁殖。营养盐、光照、PH值、温度、微量元素、碳酸氢铵等因素均能影响该藻生长。目前，小球藻产业化培养主要采用传统的开放式户外大池培养方式，该方式的培养生物量普遍较低，且具有生长周期长、易污染等缺点。光生物反应器培养是进行小球藻光合自养的经典途径，但成本高、规模小等缺点也限制了其发展。化石能源的短缺和严重的环境污染使得可再生能源的开发变得非常迫切。微藻因易培养、含油量高和不与农争地等优点被国内外专家视为唯一有可能完全替代化石能源的生物柴油原料。目前，利用微藻生产生物柴油成本还太高，价格上与化石能源相比没有竞争力。获取优良产油藻株是降低利用微藻制备生物柴油成本最关键和的最有效一步。激光是一种光量子流，作为一种新型基因突变诱变剂，具有能量密度高、单色性好、方向性强、操作简单、变异率高、速度快、造价低、损伤轻、无污染、安全性强等诸多优点。我国的激光诱变育种自上世纪70年代初起步以来，在粮食作物、经济作物、水产及微生物领域都取得了丰硕的成果。微藻是进行激光诱变的优良材料，其结构简单、生命周期短、光敏性强、代谢过程极易受环境影响，也容易被检测。国内有关激光对微藻的诱变效应研究起步于上世纪九十年代，仅限于螺旋藻、雨生红球藻等少数经济微藻，但均取得了比较理想的效果。福建师范大学庄慧如课题组从2000年开始在这方面作了一些有益的探索，利用激光对微藻进行诱变，得到的诱变株生长速率、色素、蛋白质、可溶性多糖含量等均比出发株有不同程度的提高。福建师范大学公布了一种激光-微波诱变选育富硒紫球藻变株的方法(200410039822)，涉及利用YAG激光和微波诱变结合富硒驯化，筛选富硒紫球藻变株的方法。所采用的激光、微波诱变设备简单、操作安全、诱变效果好，在微藻藻种选育中有较大的推广价值。目前，国内市场上已经公开了一些刺激小球藻快速生长的相关专利技术，大多数是针对培养基成分改良的。如华东理工大学公布了一种适合于普通小球藻高密度高品质培养的培养基组合物(200610024004)，所述培养基基本上由KNO3 (7 11克/升)、葡萄糖(25 35克/升)以及少量无机盐、微量元素和水组成。该发明的培养基可使普通小球藻达到高密度培养的前提下，藻体品质与异养培养相比有较大幅度提高，培养结束时达到光自养培养时的水平。清华大学提供了一种高密度培养异养小球藻的方法(200610078003)。该方法是在通气培养瓶中加入含葡萄糖的培养基和少许添加剂CSL，在异养条件下快速培养小球藻，该技术解决了异养小球藻对葡萄糖利用不充分的问题，从而简化了生产工艺、降低了生产成本、有利于异养小球藻的大规模高浓度培养，缺点是小球藻收获生物量偏低。还有一些是通过优化光生物反应器或发酵罐培养条件来实现小球藻的高密度培养。如华东理工大学提供了一种高密度高品质培养小球藻的方法(200610025618)，该培养方法包括生物反应器高密度异养培养、高密度藻液的稀释和光自养培养三个阶段。可使小球藻在较短的培养周期里细胞密度达到高密度培养的水平，还可使小球藻的品质与异养培养相比有较大幅度提高，达到了光自养培养时的水平。北京科技大学提供了一种能够无光照异养生长的小球藻种及培养方法(200510086288)，采用无光照异养批量和发酵培养方法，可以在3 6天时间内培养出小球藻，细胞干重浓度达到20 50g / L的小球藻培养物，经过离心、干燥和压片后可以作为人类健康食品或医药品。缺点是操作流程复杂，生产周期长，并涉及光生物反应器和发酵罐等仪器设备的使用。清华大学公开了一种利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法(200810100871)。该方法是以在生物反应器中高密度发酵培养的异养小球藻为原料，主要通过高生长速率与高油脂含量藻种的筛选、直接接种至摇瓶中作为一级种子培养和转接至发酵罐中进行二级高密度发酵培养，进行条件优化与过程控制，收集藻 体后经过分离、收集并干燥、抽提藻油，再经过转酯化反应来制备生物柴油。清华大学还同 时公开了一种从自养到异养两步培养小球藻生产生物柴油的方法(200810112998)，该专利中除了小球藻的初步培养技术略有差别，其余生产工艺相似。此外，清华大学最近公开了一种小球藻及其培养方法和它在生物柴油生产中的应用(200910083797)，筛选到一株小球藻YJ1，主要用于构建城市污水深度处理工艺，在处理污水的同时可获得生物柴油。上述相关促进小球藻生长和生产生物柴油的专利技术虽然先进，但均未涉及激光辐照诱变高产油微藻育种的内容，而且需要光生物反应器和发酵罐等大型专业设施，对设备要求比较高，技术工艺相对复杂，且费用高，这无疑增加了生产成本和技术推广的难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有操作简单、速度快、造价低、损伤轻、无污染、安全性强等诸多优点且能短期诱变出海水小球藻快速积累油脂突变藻株的方法。其具体的技术方案为一种激光诱变海水小球藻快速积累油脂突变藻株的方法，其特征在于采用如下步骤(I)制备藻液在温度20_25°C、光强为1800-20001x、光暗比为12h/12h条件下，以日光灯作光源培养海水小球藻(Chlorella vulgaris)细胞到对数生长期，获得将进行激光辐照诱变的藻液；(2)激光辐照诱变取20ml对数生长期藻液倒于小广口瓶中，用808nm半导体激光、辐照处理I. 9-2. lmin，辐照过程中用磁力搅拌保持辐照均匀，获得突变藻株；(3)突变藻株培养将辐照诱变后的藻液倒入装有f/2海水培养基的50ml三角瓶内，藻液中营养盐的终浓度为1/4倍，在20 25°C、光强180(Γ20001χ、光暗比为12h/12h条件下培养20天，然后将藻液转接到300ml三角瓶内，在上述条件下继续培养20天，再将藻液转接到IOOOml三角瓶内，在上述条件下继续培养26天，培养阶段每7天添加一次1/4倍浓度的f/2海水培养基，每天定时摇藻3次。所述的激光诱变海水小球藻快速积累油脂突变藻株的方法，步骤(2)中，半导体激光采用海特光电有限责任公司生产的L0S-BLD-0808-12W-C —体化光源激光器，功率6w。所述的激光诱变海水小球藻快速积累油脂突变藻株的方法，海水小球藻源自中国海洋大学。本发明与现有技术相比，其优点是I、本发明简单易行(短时间的激光辐照)、造价低、损伤轻、无污染、安全性强，原材料海水小球藻细胞可以按常规方法自行培养。2、本发明能诱变出显著提高总脂含量的海水小球藻突变株，实验证明，同等条件 下培养66天，半导体激光辐照31. 9-2. Imin的诱变组突变株与未经过激光辐照处理的出发株相比总油脂含量分别提高到出发株的2. 78-2. 97倍，总脂含量分别达到藻细胞干重的34. 98-36. 03%。
具体实施例方式以下实施例中海水小球藻均采用中国海洋大学，808nm半导体激光采用海特光电有限责任公司生产的L0S-BLD-0808-12W-C —体化光源激光器，功率6w。实施例I :步骤I、制备藻液在温度20°C、光强为18001x、光暗比为12h/12h条件下，以日光灯作光源培养海水小球藻细胞到对数生长期，使细胞浓度达IO8个/ ml，获得将进行激光辐照诱变的藻液；步骤2、激光辐照诱变取20ml对数生长期藻液倒于小广口瓶中，用808nm半导体激光辐照处理2. Omin，辐照过程中用磁力搅拌保持辐照均匀，获得突变藻株；步骤3、突变藻株培养将激光辐照细胞液冲洗入装有f/2海水培养基的50ml三角瓶内，藻液中营养盐的终浓度为1/4倍，在温度20°C、光强为18001x、光暗比为12h/12h培养条件下培养20天；然后将上述藻液转接到300ml三角瓶内，在上述条件下继续培养20天；再将上述藻液转接到IOOOml三角瓶内，在上述条件下继续培养26天。整个培养阶段每7天添加一次1/4倍浓度的f/2海水培养基，每天定时摇藻3次。测试结果在上述培养条件下培养66天后，油脂测试结果表明半导体激光辐照2. Omin的诱变组与未经过激光处理的出发株相比，油脂含量提高到出发株的2. 82倍，油脂含量达到细胞干重的35. 58%。实施例2:步骤I、制备藻液在温度23°C、光强为19001x、光暗比为12h/12h条件下，以日光灯作光源培养海水小球藻细胞到对数生长期，使细胞浓度达IO8个/ ml，获得将进行激光辐照诱变的藻液；步骤2、激光辐照诱变取20ml对数生长期藻液倒于小广口瓶中，用808nm半导体激光辐照处理2. lmin，辐照过程中用磁力搅拌保持辐照均匀，获得突变藻株；步骤3、突变藻株培养将激光辐照细胞液冲洗入装有f/2海水培养基的50ml三角瓶内，藻液中营养盐的终浓度为1/4倍，在温度23°C、光强为19001x、光暗比为12h/12h培养条件下培养20天；然后将上述藻液转接到300ml三角瓶内，在上述条件下继续培养20天；再将上述藻液转接到2个IOOOml三角瓶内，在上述条件下继续培养26天。整个培养阶段每7天添加一次1/4倍浓度的f/2海水培养基，每天定时摇藻3次。测试结果在上述培养条件下培养66天后，油脂测试结果表明半导体激光辐照
2.Imin诱变组与未经过激光处理的出发株相比，油脂含量提高到出发株的2. 88倍，油脂含量达到细胞干重的34. 98%。 实施例3 步骤I、制备藻液在温度25°C、光强为20001x、光暗比为12h/12h条件下，以日光灯作光源培养海水小球藻细胞到对数生长期，使细胞浓度达IO8个/ ml，获得将进行激光辐照诱变的藻液；步骤2、激光辐照诱变取20ml对数生长期藻液倒于小广口瓶中，用808nm半导体激光进行辐照处理I. 9min，辐照过程中用磁力搅拌保持辐照均匀，获得突变藻株；步骤3、突变藻株培养将激光辐照细胞液冲洗入装有f/2海水培养基的50ml三角瓶内，藻液中营养盐的终浓度为1/4倍，在温度25V、光强为20001x、光暗比为12h/12h培养条件下培养20天；然后将上述藻液转接到300ml三角瓶内，在上述条件下继续培养20天；再将上述藻液转接到IOOOml三角瓶内，在上述条件下继续培养26天。整个培养阶段每7天添加一次1/4倍浓度的f/2海水培养基，每天定时摇藻3次。测试结果在上述培养条件下培养66天后，油脂测试结果表明半导体激光辐照I. 9min诱变组与未经过激光处理的出发株相比，油脂含量提高到出发株的2. 97倍，达到细胞干重的36. 03%。实施例的结果测试采用以下方法，具体步骤是①将小球藻藻液转移至50ml的离心管中，配平后，在低温高速离心机中，于8000rpm下离心IOmin,弃去上清,应尽量弃除上清；将收集好的藻泥用于油脂含量测定；②将准备好的藻泥置于电热恒温鼓风干燥箱中100°C干燥过夜，分别测量各实验组干燥粉质量Mtl,并记录数据。研磨已称量的干燥粉，并加入等体积的氯仿和甲醇(1:2，现配现用)在功率40W、周期lmin、破壁15s、间隔5s、3个循环的条件下进行超声波破壁，然后将破壁完的藻液分装于两个50mL离心管中，配平后，于低温高速离心机中，IOOOOrmp条件下离心IOmin ;④离心完后,取上清液,按3:1 (氯仿上清液)的比例加入氯仿并涡旋混匀。之后再加入与氯仿等体积的水涡旋混匀，静置待其分层。取下层有机相转入预先称重(M1)的IOml离心管中，用氮吹仪吹干有机溶剂后称重M2并记录数据，氮吹仪水浴温度设定为61°C ;⑤总脂含量的计算公式为总脂含量百分比=(M2-M1)ZMciXlOO0/^
权利要求
1.一种激光诱变海水小球藻快速积累油脂突变藻株的方法，其特征在于采用如下步骤 (1)制备藻液在温度20-25°C、光强为1800-20001X、光暗比为12h/12h条件下，以日光灯作光源培养海水小球藻(Chlorella vulgaris)细胞到对数生长期,获得将进行激光福照诱变的藻液； (2)激光辐照诱变取20ml对数生长期藻液倒于小广口瓶中，用808nm半导体激光、辐照处理I. 9-2. lmin，辐照过程中用磁力搅拌保持辐照均匀，获得突变藻株； (3)突变藻株培养将辐照诱变后的藻液倒入装有f/2海水培养基的50ml三角瓶内，藻液中营养盐的终浓度为1/4倍，在2(T25°C、光强180(Γ20001χ、光暗比为12h/12h条件下培养20天，然后将藻液转接到300ml三角瓶内，在上述条件下继续培养20天，再将藻液转接到IOOOml三角瓶内，在上述条件下继续培养26天，培养阶段每7天添加一次1/4倍浓度的f/2海水培养基，每天定时摇藻3次。
2.根据权利要求I所述的激光诱变海水小球藻快速积累油脂突变藻株的方法，其特征在于步骤(2)中，半导体激光采用海特光电有限责任公司生产的L0S-BLD-0808-12W-C —体化光源激光器，功率6w。
3.根据权利要求I所述的激光诱变海水小球藻快速积累油脂突变藻株的方法，其特征在于海水小球藻源自中国海洋大学。
全文摘要
本发明提供一种激光诱变海水小球藻快速积累油脂突变藻株的方法，采用如下步骤(1)以日光灯作光源培养海水小球藻细胞到对数生长期；(2)取20ml对数生长期藻液倒于小广口瓶中，用半导体激光辐照处理1.9-2.1min，辐照过程中用磁力搅拌，获得突变藻株；(3)将辐照诱变后的藻液倒入装有f/2海水培养基的50ml三角瓶内，藻液中营养盐的终浓度为1/4倍，在20~25℃、光强1800~2000lx条件下培养20天，然后将藻液转接到300ml三角瓶内，继续培养20天，再将藻液转接到1000ml三角瓶内，继续培养26天，培养阶段每7天添加一次1/4倍浓度的改良配方的f/2海水培养基，每天定时摇藻3次。本发明简单易行、成本低廉、高效。
文档编号C12N13/00GK102776171SQ20121028723
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月12日 优先权日2012年8月12日
发明者付圣贵, 叶乃好, 孟春晓, 王元元, 苏远丰, 赵俞任, 高宏正, 高政权 申请人:山东理工大学