专利名称：一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法
技术领域：
本发明涉及ー种转基因番茄的制备方法。
背景技术：
心血管疾病与骨质疏松症正威胁着人类的生命健康，尤其给老年人的生活带来严重影响。目前治疗两种疾病的有效药物分别是降钙素基因相关肽(haCGRP)和鲑鱼降钙素(sCT)。降钙素(Calcitonin，CT)具有调节钙-磷代谢、抑制骨基质分解、促进成骨的功 能。现在广泛应用的是鲑鱼降钙素(sCT)，其活性比人降钙素活性高40倍。降I丐素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide, CGRP)是迄今所知的人体最強的舒血管物质。CGRP在扩张正常、病变冠状动脉的同时，还可增加侧支循环，改善血液供应。但目前临床用h a CGRP与sCT主要是通过组织提取或化学合成的方法获得，存在来源有限和价格昂贵等问题。
发明内容
本发明是要解决目前降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素的来源有限且价格昂贵的问题，提供一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法。本发明表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，按以下步骤进行—、将宇番一号番茄种子用无菌水浸泡2d，然后用体积浓度70%的こ醇溶液消毒Imin,再采用消毒液消毒18min ；ニ、将消毒后的番茄种子用无菌蒸馏水洗浄，吸干表面水分后放入1/2MS培养基上，在26 28°C下光照培养11 13d，光照强度为21001x，光照时间为18h/d，得番茄幼苗；三、在番茄幼苗的第一片真叶长出前，取番茄幼苗子叶中部0. 5X0. 5cm作为外植体，将上表皮向下接种于预培养培养基上，进行预培养2d ；四、用接菌环挑取一环降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株，接种于50mL含有50mg/L Rif和100mg/L Km的YEB培养基中，于28°C、220rpm振荡培养，至菌液OD6tltl为0. 4，将菌液于4°C、4500rpm离心收集菌体，然后重悬于50mL YEB培养基中，作为转化用的侵染液；五、将步骤三预培养后的外植体投入步骤四得到的侵染液中侵染6min，然后取出外植体吸干表面侵染液，转入共培养培养基上，于25 27°C暗培养；六、将暗培养后的外植体转至脱菌培养基中，于25 27°C培养5d，光照强度为20001x，光照时间为18h/d，然后将外植体转至筛选培养基上，于25 27°C培养，光照强度为20001x，光周期为16h光照8h黑暗，每IOd更换一次筛选培养基，培养至外植体上长出2 3cm的抗性芽，将抗性芽切下转接到生根培养基上培养16 20d，炼苗，植入装有沙壤土的花盆中，获得再生苗，对再生苗进行鉴定，获得的阳性植株即为转基因番茄；其中步骤一中消毒液为10% NaC10+2% SDS的水溶液。本发明利用转基因植物表达sCT和ha CGRP融合基因。此种方法安全、生产成本低、易于操作，为利用转基因植物大規模生产治疗性蛋白奠定基础。结果在1083个外植体得到的131株转基因抗性植株中，有78株显示出与质粒所扩增的目的片段大小一致的条带，阳性率59. 54%，转化率7. 20%。
图I为具体实施方式
九中测序峰图；图2为具体实施方式
九中测序峰图；图3为具体实施方式
九中测序峰图；图4为具体实施方式
九中测序结果与目的基因序列比对结果 图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式表达降I丐素基因相关肽与鲑鱼降I丐素融合基因的转基因番茄的制备方法，按以下步骤进行一、将宇番一号番茄种子用无菌水浸泡2d，然后用体积浓度70%的こ醇溶液消毒Imin,再采用消毒液消毒18min ；ニ、将消毒后的番茄种子用无菌蒸馏水洗浄，吸干表面水分后放入1/2MS培养基上，在26 28°C下光照培养11 13d，光照强度为21001x，光照时间为18h/d，得番茄幼苗；三、在番茄幼苗的第一片真叶长出前，取番茄幼苗子叶中部0. 5X0. 5cm作为外植体，将上表皮向下接种于预培养培养基上，进行预培养2d ；四、用接菌环挑取一环降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株，接种于50mL含有50mg/L Rif和100mg/L Km的YEB培养基中，于28°C、220rpm振荡培养，至菌液OD6tltl为0. 4，将菌液于4°C、4500rpm离心收集菌体，然后重悬于50mL YEB培养基中，作为转化用的侵染液；五、将步骤三预培养后的外植体投入步骤四得到的侵染液中侵染6min，然后取出外植体吸干表面侵染液，转入共培养培养基上，于25 27°C暗培养；六、将暗培养后的外植体转至脱菌培养基中，于25 27°C培养5d,光照强度为20001x，光照时间为18h/d，然后将外植体转至筛选培养基上，于25 27°C培养，光照强度为20001x，光周期为16h光照8h黑暗，每IOd更换一次筛选培养基，培养至外植体上长出2 3cm的抗性芽，将抗性芽切下转接到生根培养基上培养16 20d，炼苗，植入装有沙壤土的花盆中，获得再生苗，对再生苗进行鉴定，获得的阳性植株即为转基因番茄；其中步骤一中消毒液为10% NaC10+2% SDS的水溶液。本实施方式步骤一中所述宇番一号番茄种子购买自哈尔滨市农业科学研究所。本实施方式步骤四中降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株已在专利文献《降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因序列及其转基因工程菌株》中公开，申请号为200810064960. 9。所述降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌转入了 sCT和h a CGRP融合基因。步骤一中10% NaC10+2% SDS的水溶液为体积浓度为10%的NaClO和体积浓度为2%的SDS的水溶液。本实施方式步骤四中每升YEB培养基由5g牛肉浸膏、Ig酵母浸膏、5g蛋白胨、5g鹿糖、0. 5g MgSO4 H2O和余量的蒸懼水组成，pH为7. O。
具体实施方式
ニ 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤三中预培养培养 基为含有0. 5mg/L ZT和0. 5mg/L IAA的MS培养基。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或ニ不同的是步骤三中预培养的条件为在26 28°C下光照培养，光照强度为21001x，光照时间为18h/d。其它与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤五中共培养培养基为含有0. 5mg/L ZT和0. 5mg/L IAA的MS培养基。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一不同的是步骤六中脱菌培养基为含有0. 5mg/L ZT、0. 5mg/L IAA和500mg/L Cef的MS培养基。其它与具体实施方式
一至四之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤六中筛选培养基为含有0. 5mg/L ZT、0.5mg/L IAA、500mg/L Cef和50mg/L Km的MS培养基。其它
与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至六之一不同的是步骤六中生根培养基为含有0. lmg/L IAA、250mg/L Cef和25mg/L Km的MS培养基。其它与具体实施方式
一至六之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至七之一不同的是步骤六中在生根培养基上培养的条件为在26 28°C下光照培养，光照强度为21001x，光照时间为18h/d。其它与具体实施方式
一至七之一相同。
具体实施方式
九本实施方式表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，按以下步骤进行—、将宇番一号番茄种子用无菌水浸泡2d，然后用体积浓度70%的こ醇溶液消毒Imin,再采用消毒液消毒18min ；ニ、将消毒后的番茄种子用无菌蒸馏水洗浄，吸干表面水分后放入1/2MS培养基上，在26 28°C下光照培养12d，光照强度为21001x，光照时间为18h/d，得番茄幼苗；三、在番茄幼苗的第一片真叶长出前，取番茄幼苗子叶中部0. 5X0. 5cm作为外植体，将上表皮向下接种于预培养培养基上，进行预培养2d ；四、用接菌环挑取一环降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株，接种于50mL含有50mg/L Rif和100mg/L Km的YEB培养基中，于28°C、220rpm振荡培养，至菌液OD6tltl为0. 4，将菌液于4°C、4500rpm离心收集菌体，然后重悬于50mL YEB培养基中，作为转化用的侵染液；五、将步骤三预培养后的外植体投入步骤四得到的侵染液中侵染6min，然后取出外植体吸干表面侵染液，转入共培养培养基上，于26°C暗培养；六、将暗培养后的外植体转至脱菌培养基中，于26°C培养5d,光照强度为20001x,光照时间为18h/d，然后将外植体转至筛选培养基上，于26°C培养，光照强度为20001x，光周期为16h光照8h黑暗，每IOd更换一次筛选培养基，培养至外植体上长出2 3cm的抗性芽，将抗性芽切下转接到生根培养基上培养18d，炼苗，植入装有沙壤土的花盆中，获得再生苗，对再生苗进行鉴定，获得的阳性植株即为转基因番茄；其中步骤一中消毒液为10%NaC10+2% SDS的水溶液。本实施方式步骤四中降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株在构建时加入了抗Km基因，对Km具有抗性，可在含一定浓度的含有Km的培养基上生长，而非转化体则不能生长，因此筛选培养和生根培养后可初步证明目的基因(即sCT和h a CGRP 融合基因)己导入到受体植物中。但由于假阳性植株的存在，还要进行进ー步鉴定——PCR检测及PCR产物测序。具体步骤如下使用TaKaRa植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取步骤六中获得的再生苗的基因组DNA ；以再生苗的基因组DNA为模板，以P1、P2为引物进行PCR扩增(同时设置阳性对照为含有目的基因片段的转基因工程菌株质粒，阴性对照为非转化番茄植株，空白对照为ddH20)，反应体系如下
权利要求
1.一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，其特征在于表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，按以下步骤进行 一、将宇番一号番茄种子用无菌水浸泡2d，然后用体积浓度70%的乙醇溶液消毒Imin,再采用消毒液消毒18min ； 二、将消毒后的番茄种子用无菌蒸馏水洗净，吸干表面水分后放入1/2MS培养基上，在26 28°C下光照培养11 13d，光照强度为21001x，光照时间为18h/d，得番茄幼苗； 三、在番茄幼苗的第一片真叶长出前，取番茄幼苗子叶中部O.5X0. 5cm作为外植体，将上表皮向下接种于预培养培养基上，进行预培养2d ； 四、用接菌环挑取一环降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株，接 种于50mL含有50mg/L Rif和100mg/L Km的YEB培养基中，于28°C、220rpm振荡培养，至菌液OD6tltl为O. 4，将菌液于4°C、4500rpm离心收集菌体，然后重悬于50mL YEB培养基中，作为转化用的侵染液； 五、将步骤三预培养后的外植体投入步骤四得到的侵染液中侵染6min，然后取出外植体吸干表面侵染液，转入共培养培养基上，于25 27°C暗培养； 六、将暗培养后的外植体转至脱菌培养基中，于25 27°C培养5d，光照强度为20001x，光照时间为18h/d,然后将外植体转至筛选培养基上，于25 27°C培养，光照强度为20001x,光周期为16h光照8h黑暗，每IOd更换一次筛选培养基，培养至外植体上长出2 3cm的抗性芽，将抗性芽切下转接到生根培养基上培养16 20d，炼苗，植入装有沙壤土的花盆中，获得再生苗，对再生苗进行鉴定，获得的阳性植株即为转基因番茄；其中步骤一中消毒液为10% NaC10+2% SDS的水溶液。
2.根据权利要求I所述的一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，其特征在于步骤三中预培养培养基为含有O. 5mg/L ZT和O. 5mg/L IAA的MS培养基。
3.根据权利要求I所述的一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，其特征在于步骤三中预培养的条件为在26 28°C下光照培养，光照强度为21001x，光照时间为18h/d。
4.根据权利要求I所述的一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，其特征在于步骤五中共培养培养基为含有O. 5mg/L ZT和O. 5mg/L IAA的MS培养基。
5.根据权利要求I所述的一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，其特征在于步骤六中脱菌培养基为含有O. 5mg/L ZT,O. 5mg/L IAA和500mg/L Cef 的 MS 培养基。
6.根据权利要求I所述的一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，其特征在于步骤六中筛选培养基为含有O. 5mg/L ZT、0. 5mg/L IAA,500mg/L Cef 和 50mg/L Km 的 MS 培养基。
7.根据权利要求I所述的一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，其特征在于步骤六中生根培养基为含有O. lmg/L IAA、250mg/L Cef和25mg/LKm的MS培养基。
8.根据权利要求I所述的一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，其特征在于步骤六中在生根培养基上培养的条件为在26 28°C下光照培养，光照强度为21001x，光照时间为18h/d。
全文摘要
一种表达降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因的转基因番茄的制备方法，涉及一种转基因番茄的制备方法。本发明是要解决目前降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素的来源有限且价格昂贵的问题。方法一、将番茄种子浸泡消毒；二、洗净后放入1/2MS培养基上，光照培养得番茄幼苗；三、取幼苗子叶中部为外植体，接种于预培养培养基；四、制备转化用的侵染液；五、侵染，转入共培养培养基；六、转至脱菌培养基，再转至筛选培养基上，培养至外植体上长出抗性芽，将抗性芽转接到生根培养基上，炼苗，植入土中获得再生苗，鉴定，获得的阳性植株即为转基因番茄。本发明利用转基因植物表达sCT和hαCGRP融合基因，安全、生产成本低、易于操作。
文档编号C12N15/84GK102757979SQ20121027346
公开日2012年10月31日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者余琼 申请人:黑龙江大学