专利名称：Pcr-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测引物、试剂盒和检测方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及PCR-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测引物、试剂盒和检测方法。
背景技术：
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, VP)是一种引起食源性疾病的重要病原，在近年来沿海地区的食物中毒病例中，该菌已成为首要病原。随着分子生物学的发展，已有用普通PCR或荧光PCR检测VP的报道，虽然这些方法可达到快速、高通量的目的，但却无法获得分子诊断的黄金标准-基因序列，因此有出现假阳性的可能。副溶血性弧菌的分子检测方面，以tdh基因为目的基因判断其有无致病性非常实用，但tdh基因家族广泛存在于人类致病性弧菌中，如大多数霍利斯弧菌，某些拟态弧菌，非01群霍乱弧菌等，因此，用tdh检 测VP存在一定的局限性。以tlh为目的基因也可能出现同样的情况，Robert Pillot等的研究发现，溶藻弧菌和副溶血性弧菌的同源性非常高，靶定tlh基因的引物不能用于两者的鉴别。Ooci等评估了不同靶基因的副溶血性弧菌的PCR鉴定方法，指出toxR作为靶基因的PCR具有最高的准确性，该基因可作为VP分子鉴别的参考方法。焦磷酸测序(pyrosequencing)技术是近年来发明的一项实时地进行短片段DNA测序技术，其是一种基于合成的新型DNA测序技术，在特异引物的引导下，根据待测序列分别加入四种核苷酸，在延伸的过程中释放焦磷酸，后者在ATP硫酸化酶和荧光酶的偶联反应中释放荧光，通过检测器检测相应的荧光强度，从而获得检测样本中的核苷酸序列，是一种非常实用的短序列实时检测技术，已应用于临床微生物的分型鉴定及耐药监测，其定量准确、易于自动化、能实现高通量的大样本的快速检测，具有DNA测序法无法比拟的优势，由于该技术在DNA序列分析时不需要电泳和荧光标记，直接测定测序引物后面的碱基序列，通过提供可靠的序列信息来确认PCR产物，同时由于主要分析PCR产物双链中的一条链的序列，避免了由于DNA链的二级结构造成的人工假象，使测序结果更加准确。
发明内容
本发明的目的是提供简便、快捷、准确性高、特异性强的PCR-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测引物、试剂盒和检测方法。本发明根据VP的toxR基因(GenBank: AB063113)，设计扩增弓丨物和测序弓I物，建立了结合PCR-焦磷酸测序从DNA碱基序列水平上检测VP的方法，从而实现了本发明的目的。本发明的PCR-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测引物，其特征在于，包括PCR引物和测序引物PCR 引物上游引物 F GAGATTCCGCTGGGTTTGTAA ；(如 SEQ ID NO. I 所示)下游引物R TGAACCAGAAGCGCCAGTAGTAC ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)测序引物S AAATAACGCGTGGAAT (如 SEQ ID NO. 3 所示)。
本发明的第二个目的是提供PCR-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测试剂盒，包括DNA提取试剂，PCR反应试剂，单链模板制备试剂，焦磷酸测序试剂，PCR引物和测序引物，其特征在于，所述的PCR引物和测序引物为PCR 引物上游引物 F GAGATTCCGCTGGGTTTGTAA ；(如 SEQ ID NO. I 所示)下游引物R TGAACCAGAAGCGCCAGTAGTAC ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)测序引物S AAATAACGCGTGGAAT (如 SEQ ID NO. 3 所示)。本发明的第三个目的是提供非诊断目的的PCR-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤(I)对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；
(2 )使用上述PCR弓丨物进行PCR反应，回收PCR产物，制备单链模版，然后应用上述测序引物对PCR产物进行焦磷酸测序，自测序引物3\端后的第一个碱基开始测序，测序引物后的34个碱基序列为CCAAGGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTT TT时，判断样品中含有副溶血弧菌。优选，所述的PCR 反应，其扩增体系 50 μ L，PCR Mix Buffer 25 μ 1，Taq 酶 5 μ 1，MgCl2I μ I, 10 μ M上、下游引物各2 μ I, DNA模板I μ I,去离子水14 μ I,所述的PCR反应条件为预变性 95°C 4min ；95°C 15s，65。。30s, ,72°C 30s，43 个循环；72°C 12min。本发明根据副溶血弧菌toxR基因(GenBank:NC_004603. I)序列中的保守区域，用PyroMark Assay Design软件设计PCR引物和测序引物,建立了 PCR-焦磷酸测序,从DNA碱基序列水平上检测副溶血弧菌的方法。本发明先对目标片段进行PCR扩增，保证扩增片段的特异性，再用扩增产物制备单链模板，在测序引物的引导下进行焦磷酸测序。检测的所得喊基序列，用NCBI网站的BLAST功能反复比对时发现，toxR基因测序引物后的喊基序列具有良好的特异性，测序引物后34bp连续DNA序列为CCAAGGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTT的就可鉴定VP。试验结果，PCR扩增引物和测序引物表现出良好的特异性和准确性，PCR扩增试验结果，20株VP均扩增出大小137bp大小的DNA片段，而创伤弧菌等其他对照菌株未扩增出DNA条带。虽然一株大肠杆菌在137bp位置出现扩增带，但测序试验结果判断为非特异性扩增。20株检测的VP DNA碱基序列与测序引物后的碱基序列比对，100%匹配的碱基数分别为35bp-48bp，均超过需检测的34个DNA碱基序列，而其他创伤弧菌等对照菌株未测出DNA碱基序列或检测结果与测序引物后的序列不匹配。模拟样品检测结果，焦磷酸测序结果与传统检测方法一致，但在检测周期上传统方法需要培养、划线分离、生化鉴定等，需要3d-4d，而焦磷酸测序方法增菌8h-10h、核酸提取、PCR扩增和焦磷酸测序3h-4h，整个试验llh-14h完成，简便快捷，而且可通DNA碱基序列的水平上检测VP，避免了单纯PCR扩增检测易污染造成的假阳性结果，准确性高，具有较好的应用前景，能应用于食品检测中。
图I是tox基因的PCR扩增产物电泳图，其中M:50bpmaker、l:VPATCC17802、2-20:VPl-VP19、21:去离子水；图2是tox基因的PCR扩增产物电泳图，M:50bp makerU :VP ATCC17802、2:创伤弧菌、3:溶藻弧菌、4:海蛹弧菌、5:弗氏弧菌、6:最小弧菌、7:大肠杆菌、8:阪崎肠杆菌、9:痢疾志贺氏菌、10:小肠结肠炎耶尔森氏菌、11 :塔氏弧菌、12:单增李斯特菌、13:去离子水；图3是大肠杆菌焦磷酸测序结果图；图4是VP ATCC17802焦磷酸测序结果图；图5是VPl焦磷酸测序结果图；图6是VP2焦磷酸测序结果图；图7是VP3焦磷酸测序结果图；图8是VP4焦磷酸测序结果9是VP5焦磷酸测序结果图；图10是VP6焦磷酸测序结果图；
图11是VP7焦磷酸测序结果图；图12是VP8焦磷酸测序结果图；图13是VP9焦磷酸测序结果图；图14是VPlO焦磷酸测序结果图；图15是VPll焦磷酸测序结果图；图16是VP12焦磷酸测序结果图；图17是VP13焦磷酸测序结果图；图18是VP14焦磷酸测序结果图；图19是VP15焦磷酸测序结果图；图20是VP16焦磷酸测序结果图；图21是VP17焦磷酸测序结果图；图22是VP18焦磷酸测序结果图；图23是VP19焦磷酸测序结果图；图24是创伤弧菌焦磷酸测序结果图。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例I :I材料和方法I. I菌株信息副溶血性弧菌菌株共20株，其中标准菌株I株，食品中分离的菌株19株，菌株信息见表I。阴性对照株11株，分别为创伤弧菌ATCC27562、溶藻弧菌CGMCCI. 1833、海蛹弧菌 CGMCC1. 1623、弗氏弧菌 CGMCC1. 1613、最小弧菌 CGMCC1. 1969、大肠杆菌ATCC25922、单增李斯特菌ATCC19115、阪崎肠杆菌ATCC29544、痢疾志贺氏菌NICPBP51252、小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221，塔氏弧菌分离株。上述菌株来自中国普通微生物菌种保藏管理中心、中国药品生物制品鉴定所、中国科学院南海水产研究所、辽宁出入境检验检疫局技术中心和广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心。所有菌株均经VITEK2和API试剂条进行确证。表I :副溶血性弧菌菌株信息菌株编号样品名菌株编号样品名菌株编号样m名菌株编号样m名
VPl无头冻虾 VP2冻虾仁 VP3熟风尾虾VP4冻虾f:
VP5冻去头!li卜 VP6冻虾i W7无头冻虾VP8无头冻虾
VP9冻全虾 VPlO虾 VPll 珠江水VP12冻鱼
VP13SF ΛΤ14无头冻虾 VPl 5 冻墨鱼VP16冰蚝
VP17冻带鱼 VP18生蚝 VP19 生蚝ATCCl 7802标准菌株I. 2主要仪器和试剂焦磷酸测序PyroMark ID系统-瑞 典Biotage公司；PCR扩增仪-PE9700型；核酸提取仪-日本PSS公司；PCR用Buffer、dNTP、琼脂糖、PCR分子量标记(50_500bp) Taq酶-宝生物工程(大连)有限公司；链亲和素标记磁珠(sepharosebeads) -GE. Healthcare公司；焦磷酸测序用酶、dNTP、结合缓冲液(Binding Buffer)、退火缓冲液(Annealing Buffer)、变性缓冲液(Denaturation Buffer)、洗漆缓冲液(WashingBuffer)等-QIAGEN上海办事处；碱性蛋白胨水-北京陆桥有限公司。I. 3引物设计根据VP的toxR基因(GenBank:NC_004603. I)序列中的保守区域，用Py roMark Assay Design软件设计PCR引物和测序引物，上游引物F :GAGATTCCGCTGGGTTTGTAA，下游引物 R TGAACCAGAAGCGCCAGTAGTAC,测序引物 S AAATAACGCGTGGAAT,扩增片段为137bp，下游引物端标记生物素，委托宝生物工程(大连)有限公司合成。I. 4模板制备所有菌株分别均用3%碱性蛋白胨水36°C培养8h_10h，取Iml菌悬液移入离心管，12000r/min离心5min去上清,用Iml去离子水漂浮沉淀，12000r/min离心3min去上清，重复两次，最后加200 μ I去离子水在核酸提取仪上提取DNA，作为DNA模板用于PCR扩增。I. 5PCR扩增体系及电泳参数扩增体系50 μ L, PCR Mix Buffer 25 μ 1，Taq酶
5μ I，MgCl21 μ I，10 μ M 上、下游引物各 2 μ I (上游引物 F GAGATTCCGCTGGGTTTGTAA,下游引物R TGAACCAGAAGCGCCAGTAGTAC), DNA模板I μ 1，去离子水14 μ I。循环参数为预变性950C 4min,95°C 15s，65。。30s, ,72°C 30s，43 个循环，72°C 12min，4°C保存。PCR 扩增产物一
部分在2%琼脂糖凝胶上电泳，另一部分用于焦磷酸测序。PCR扩增产物电泳结果toxR基因的PCR扩增产物结果，20株VP均扩增出137bp大小的DNA片段(图I),而创伤弧菌、溶藻弧菌、海蛹弧菌、弗氏弧菌、最小弧菌、阪崎肠杆菌、痢疾志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、塔氏弧菌、单增李斯特菌未见扩增条带(图2)。图2观察，第7泳道的大肠杆菌在100bp-150bp处有DNA扩增条带，其扩增产物用焦磷酸测序检测，仪器读出的DNA碱基序列为CTGTTTCTTCTCCC (图3)，该序列与测序引物后的碱基序列CCAAGGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTT比对，结果完全不匹配，因此,可判断该菌株为非VP，是PCR非特异性扩增。I. 6单链模板制备及焦磷酸测序将15 μ I PCR扩增产物转移至96孔PCR板中，力口入 2 μ I 磁珠(sepharose beads), 20 μ I 结合缓冲液(Binding Buffer)和 43 μ I 纯水，常温震荡混20min ;打开真空泵,将真空预装工具prep tool在高纯水中清洗30秒,将prep tool移到96孔PCR板中，抓取其中的磁珠，待磁珠基本抓取完毕后将携带有磁珠的prep tool放入70%乙醇中5秒，再分别在变性缓冲液Denaturation Buffer和洗漆缓冲液WashingBuffer中各清洗20s 30s,再将prep tool放在装有退火预混液PSQ96板(预先加入43 μ I退火缓冲液Annealing Buffer和2μ I测序引物)的上方，关掉真空泵，轻轻摇动释放磁珠，将PSQ96板在80°C放置5min，自然冷却至室温后进行焦磷酸测序反应。测序程序采用SQA模式，按ATCG的碱基排列顺序，依次循环加入15次，根据软件给出的剂量在试剂仓中加入底物混合物、酶混合物和4种脱氧核糖核苷酸,将PSQ96孔板和试剂仓放入PyroMarkID系统中进行焦磷酸测序。测序峰及相应的DNA碱基序列由仪器SQA软件自动分析产生。I. 7焦磷酸测序结果判断20株VP焦磷酸测序结果，根据模版浓度等条件的不同，测出44bp_48bp大小不等的DNA碱基序列(表2，图4-图23)，而11株对照菌株创伤弧菌、溶藻弧菌、海蛹弧菌、弗氏弧菌、最小弧菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、痢疾志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、塔氏弧菌、单增李斯特菌，未测出DNA碱基序列或测得结果与测序引物后的序列不匹配(本研究只列出创伤弧菌和大肠杆菌的焦磷酸测序结果图。图3，图24)。表2和图4观察到，VP标准菌株ATCC17802的第4个碱基为T，在NCBI网站查找ATCC17802的toxR基因序列(GenBank:JF930556. 1)，发现该位点的碱基为A，表明试验菌株在该位点发生了 A-T的突 变。查找toxR基因编码蛋白氨基酸序列，共292个氨基酸组成，突变位点是toxR蛋白的第176个氨基酸-脯氨酸位点，该位点发生A-T的突变后，密码子CCU变成CCA，而两个密码子都是脯氨酸的密码子，表明该位点虽然发生了突变但其氨基酸序列没有改变，以至该基因表达的跨膜转录激活蛋白没有变化。20株VP测序所得DNA碱基序列，分别与测序引物后的DNA序列比对，发现100%匹配的DNA碱基数为35bp_48bp，所有有效测序结果均超过35个碱基(表2)，表明测序引物的特异性较好，并且可用CCAAGGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTT的DNA碱基序列特异性地检测VP。表2 :副溶血性弧菌测序检测结果
权利要求
1.一种PCR-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测引物，其特征在于，包括PCR引物和测序引物 PCR 引物上游引物 F GAGATTCCGCTGGGTTTGTAA ； 下游引物 R TGAACCAGAAGCGCCAGTAGTAC ； 测序引物 S AAATAACGCGTGGAATo
2.—种PCR-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测试剂盒，包括DNA提取试剂，PCR反应试齐U，单链模板制备试剂，焦磷酸测序试剂，PCR引物和测序引物，其特征在于，所述的PCR引物和测序引物为 PCR 引物上游引物 F GAGATTCCGCTGGGTTTGTAA ；下游引物 R TGAACCAGAAGCGCCAGTAGTAC ； 测序引物 S AAATAACGCGTGGAATo
3.一种非诊断目的的PCR-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板； (2)使用权利要求I所述的PCR引物进行PCR反应，回收PCR产物，制备单链模版，然后应用权利要求I所述的测序引物对PCR产物进行焦磷酸测序，自测序引物3\端后的第一个碱基开始测序，测序引物后的34个碱基序列为CCAAGGATTCACAGCAGAAGC CACAGGTGCTTTT时，判断样品中含有副溶血弧囷。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的PCR反应，其扩增体系50u L，PCR Mix Buffer 25 y 1，Taq 酶 5 y 1，MgCl2 I ii 1，10 y M 上、下游引物各 2 y 1，DNA 模板lul，去离子水 14iil，反应条件为预变性 95°C 4min ；95°C 15s，65。。30s, ,72 °C 30s，43 个循环；72°C 12min。
全文摘要
本发明公开了一种PCR-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测引物、试剂盒和检测方法。本发明根据副溶血弧菌toxR基因(GenBank:NC_004603.1)序列中的保守区域，用PyroMark Assay Design软件设计PCR引物和测序引物，建立了PCR-焦磷酸测序，从DNA碱基序列水平上检测副溶血弧菌的方法。本发明先对目标片段进行PCR扩增，保证扩增片段的特异性，再用扩增产物制备单链模板，在测序引物的引导下进行焦磷酸测序。检测的所得碱基序列，用NCBI网站的BLAST功能反复比对时发现，toxR基因测序引物后的碱基序列具有良好的特异性，测序引物后34bp连续DNA序列为CCAAGGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTT的就可鉴定含有VP。
文档编号C12R1/63GK102808024SQ20121027273
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月1日 优先权日2012年8月1日
发明者许龙岩, 袁慕云, 曹际娟, 唐勤, 邹志飞 申请人:许龙岩, 袁慕云, 曹际娟, 唐勤, 邹志飞