专利名称：水稻转录因子Os01g64730基因的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于遗传工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子0s01g64730基因的应用。
背景技术：
在长日照植物(LDP)拟南芥(Baurle和 Dean, 2006; Imaizumi 和 Kay, 2006)和短日照植物(SDP)水稻(Izawa，2007;Tuji等，2008)中，开花信号途径已得到了广泛的研究。GI-CO-FT是控制水稻开花保守的途径(Yano等，2000; Kojima等，2002; Hayama等，2002)。Hd3a是水稻中FT的同源基因，它受到一个B-型响应调控子Ehdl的诱导，该途径在短日照条件下独立于Hdl基因(Doi等，2004)。0sMADS51受OsGI的调控，该作用位于Ehdl的上游(Kim等，2007)。相反，在长日照条件下，Hdl抑制Hd3a的表达而推迟水稻开花(Hayama 等，2003)。最新研究表明，Hd3a与14-3-3蛋白形成复合体后转入细胞核内，与转录因子FDl结合形成三聚体FAC (f lorigen activation complex),诱导0sMADS15的转录,从而导致水稻开花。VP16最早在动物病毒基因中发现，现已被广泛应用到植物中，主要用于植物基因的转录调控的研究中。转录因子在体内的作用大体上可以分成两种一种为转录增强子，另一种为转录抑制子。当转录因子和VP16功能域基序融合之后，它就会增强转录因子的功能，从而在转基因植株中出现更明显的表型变化。
发明内容
本发明的目的是提供水稻转录因子0s01g64730基因的应用。为了实现本发明目的，本发明首先提供一种融合蛋白，该融合蛋白为0s01g64730-Linker- (VP16) n 或(VP16) n-Linker_0s01g64730 ;其中，n 为彡 I 的整数；Linker由1 20个柔性氨基酸串联而成(例如，GGGGG, GPPPG,或Gatway载体重组位点编码的氛基酸序列DPAFLYKVVPR) ；VP16为来自单纯抱疫病毒(Herpes simplex virus)的VP16蛋白；0s01g64730为水稻转录因子0s01g64730，其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。优选地，前述融合蛋白中n为4。其中，(VP16)4即VP64，是由4个VP16功能域基序融合在一起组成的增强子，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。更优选地，前述融合蛋白为0s01g64730-Linker_ (VP16)4。本发明还提供编码所述融合蛋白的基因，以及在严格条件下，可与该基因的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；其中，所述严格条件为65°C，在0. I X SSPE或0. 1XSSC、0. 1%SDS的溶液中杂交并洗膜。本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的载体。所述载体为任一种可引导外源基因在宿主中表达的载体。优选地，所述载体为植物双元表达载体(例如，PCAMBIA1301)。在将本发明编码所述融合蛋白的基因构建到植物表达载体中时，可在其转录起始核苷酸前添加任一种强启动子(例如，玉米强启动子Ubiquitin)或诱导型启动子。此外，在将本发明编码所述融合蛋白的基因构建到植物表达载体中时，还可以使用增强子，且这些增强子区域必须与编码序列的阅读框相同，以确保整条序列的翻译。本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的转基因细胞系。 本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的工程菌。本发明还提供编码所述融合蛋白的基因在推迟水稻抽穗、延长生育期中的应用。本发明进一步提供水稻转录因子0s01g64730基因的应用，其是将水稻转录因子0s01g64730基因的⑶S序列(完整翻译区)构建到4个转录因子激活基序VP16的上游，转化植物，筛选并最终获得转基因植物。 前述的应用，其是将水稻转录因子0s01g64730基因的CDS序列通过Gateway系统构建到4个转录因子激活基序VP16的上游，转化水稻(例如，水稻品种‘kitaake’)，从而推迟转基因水稻的抽穗期、延长生育期。其中，水稻转录因子0s01g64730基因的⑶S序列如SEQ ID No. 3所示,4个转录因子激活基序VP16的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。携带有编码所述融合蛋白的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York,第 411-463 页；Geiserson 和 Corey, 1998, Plant Molecular Biology,2nd Edition)。本发明首次利用转录因子激活基序VP64 (即4个转录因子激活基序VP16)与水稻转录因子0s01g64730基因融合构建得到组成型转录因子，并转化到农作物，如水稻中，从而推迟转基因水稻的抽穗期、延长生育期。对于详细阐明水稻抽穗调控的分子机理，具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，延长水稻生育期，改善水稻对不同生态区的适应能力，因此在生产中同样具有重要意义。
图I为本发明实施例I中cVP64-bar_asRED载体图谱。图2为本发明实施例I中ubi:cVP64-bar-asRED载体图谱。图3为本发明实施例3中Western Blot检测转基因阳性水稻株系的结果；其中，WT 为野生型水稻 ‘kitaake’，bzipl7_VP64_l、bzipl7_VP64_2 和 bzipl7_VP64_3 分别为0s01g64730-VP64转基因水稻的3个株系。图4为本发明实施例4中0s01g64730-VP64转基因水稻株系的表型分析结果；其中，WT 为野生型水稻 ‘kitaake’，VP64-bzipl7-l、VP64-bzipl7-2 和 VP64_bzipl7_3 分别为0s01g64730-VP64转基因水稻的3个株系。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例I水稻转录因子0s01g64730基因的获得及植物表达载体的构建登录 http://rice. plantbiology. msu. edu/analyses_search_locus. shtml 网站，找到水稻转录因子0s01g64730基因，根据其序列设计PCR扩增引物0s01g64730-F :5’-CAAAAAAGCAGGCTTCATGATGGCGTCGAGGGTG-3’0s01g64730-R:5’-CAAGAAAGCTGGGTCCCACTCCATCGAGTTTGTTCTTC-3’以水稻‘日本晴’叶片为材料，TRIzol法提取总RNA，反转录得cDNA，反应步骤如下(1)在冰上向不含核酸酶的PCR反应管中依次加入下列物质总RNA6 u I (0. lng-5 u g), Oligo (dT) 18 引物 lyl，不含核酸酶的 ddH20 5 yl，置于 PCR 仪中65°C反应5min ； (2)然后再加入下列物质5X反应缓冲液4 yl，RNase抑制剂I U 1，IOmMdNTP2u I, M-Mu IV反转录酶I yl，轻轻混匀，在PCR仪中45°C反应60min ; (3) PCR仪中，70 0C 5min,终止反应。以总cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增体系为反应缓冲液25 yl，dNTP4 u 1，ddH2017. 5u 1，Taq DNA 聚合酶 0. I，反应程序为热启动 98。。10s，57。。5s,72°C lmin,30个循环后，72°C延伸lOmin，最后25°C反应结束。 获得水稻转录因子0s01g64730基因的CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。根据Gateway克隆技术的要求，此过程中包含两轮PCR,第一轮PCR的引物用加部分adaptor attB接头的引物，而第二轮的模板用第一轮的PCR产物，并且引物采用完整的adaptor attB引物。将PCR产物克隆到连接PDONR克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。通过LR反应将0s01g64730基因构建到植物表达载体cVP64-bar_asRED (图I)上，获得载体ubi:0s01g64730-VP64 (图 2，载体全序列如 SEQ ID No. 5 所示)。其中，植物表达载体cVP64-bar_asRED的构建过程为以双元表达载体pCAMBIA1300左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将ubipromoter_Gateway-VP64 表达单兀、35S promoter-asRED 表达单兀和 35S promoter-bar 表达单元与之融合构建得到，载体cVP64-bar_asRED的全序列如SEQ ID No. 6所示。实施例2转基因水稻植株的获得取水稻‘kitaake’成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导法将ubi :0s01g64730-VP64转入水稻愈伤组织中，用含有100 y M的乙酰丁香酮和0. D.值为0. 7的农杆菌的AAM转化液进行转化，将转化液浸泡过的愈伤组织置于共培养基上进行共培养，25°C暗培养3d后置于筛选培养基上培养约30d,每IOd继代一次。然后将筛出的抗性愈伤转移到分化培养基上分化约20d，每IOd继代一次。将分化出绿色小苗的抗性愈伤转移到生根培养基上生根，待约7d长出发达根系后炼苗，并计算转化所获转基因苗数。炼苗7d后转移至大田生长。用Basta筛选转基因水稻，长出4片幼叶后开始喷洒Basta(l: 1000，v:v)，隔I天喷I次，共喷洒3次。共获得转基因水稻42株。其中，诱导培养基配方为N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2. 5mg/L2，4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5. 8^5. 9后加入植物凝胶4g/L。共培养基配方为N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2. 5mg/L 2，4D+0. 5g/L谷氨酰胺+0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制,调pH至5. 2后加入植物凝胶4g/L。灭菌后，50°C左右加入AS (乙酰丁香酮)10(T200y g/mL。筛选培养基配方为N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2. 5mg/L2，4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调PH至5. 8^5. 9后加入植物凝胶4g/L。灭菌后加入35mg/L潮霉素(购自上海纽津生物技术有限公司)或5mg/L Bialaphos (购自北京拜尔迪生物技术公司)。分化培养基配方为MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钴母液+0. 05mg/L NAA+2. Omg/L Kinetin (激动素)+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5. 8^5. 9后加入植物凝胶4g/L。实施例3 Western Blot检测转基因水稻中融合蛋白0s01g64730_VP64的表达为检测0s01g64730_VP64基因在T2代转基因水稻中的过表达情况，利用VP64抗体对其在蛋白质水平上进行鉴定，经过SDS-PAGE蛋白电泳一免疫印记一免疫荧光反应，Western Blot鉴定结果表明转基因植株存在目的蛋白，而野生型未杂出条带(图3)。具体的Western Blot实验流程如下
将适量样品放入液氮冰冻后研磨成粉末，加入适量上样缓冲液混匀，12000rpm离心10分钟;取5 ill上清加样，以90V电压SDS-PAGE电泳30分钟后，120V电泳60-90分钟，当溴酚蓝到达凝胶的底端即可停止电泳；电泳后采用半干转移法转膜，并用丽春红染色液对膜进行染色，观察转膜效果；转膜完毕后，将膜放入含5%的脱脂奶粉的PBST溶液中封闭室温封闭60分钟或4°C过夜；室温下一抗(VP64抗体)孵育I小时或4°C孵育过夜,然后用PBST洗涤3次，每次5分钟；室温下二抗(羊抗兔，购自Abmart，货号M21002S)孵育I小时，然后用PBST洗涤3次，每次5分钟；在膜上加入底物，进行曝光。其中，VP64抗体是由艾比玛特生物医药(上海)有限公司根据VP64的氨基酸序列合成多肽作为特异抗原而制备的兔源多抗。实施例4转基因水稻表型分析与野生型水稻‘kitaake’相0s01g64730_VP64转基因水稻株系(bzipl7-VP64-l、bzipl7-VP64-2和bzipl7-VP64_3)的抽穗期明显推迟，野生型虽已抽穗，但转基因株系的剑叶仍未完全抽出(图4)。以上提供的实施例是将水稻转录因子0s01g64730基因的CDS序列通过Gateway系统构建到4个转录因子激活基序VP16的上游，转化水稻品种‘kitaake’，从而推迟转基因水稻的抽穗期、延长生育期。同样地，将水稻转录因子0s01g64730基因的⑶S序列通过Gateway系统构建到彡I个转录因子激活基序VP16的下游,或通过Gateway系统构建到1 3个或4个以上转录因子激活基序VP16的上游，转化水稻品种，也能够达到推迟转基因水稻的抽穗期、延长生育期的效果。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白为Os01g64730-Linkei'- (VP16)n或(乂卩16)n-Linker-0s01g64730 ； 其中，η为彡I的整数；Linker由广20个柔性氨基酸串联而成；VP16为来自单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus)的 VP16 蛋白;0s01g64730 为水稻转录因子 0s01g64730。
2.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，η为4。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白为0s01g64730-Linker- (VP16)4。
4.编码权利要求1-3任一项所述融合蛋白的基因。
5.含有权利要求4所述基因的载体。
6.含有权利要求4所述基因的转基因细胞系。
7.含有权利要求4所述基因的工程菌。
8.权利要求4所述的基因在推迟水稻抽穗、延长生育期中的应用。
9.水稻转录因子0s01g64730基因的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子0s01g64730基因的⑶S序列构建到4个转录因子激活基序VP16的上游，转化植物，筛选并最终获得转基因植物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子0s01g64730基因的⑶S序列通过Gateway系统构建到4个转录因子激活基序VP16的上游，转化水稻，从而推迟转基因水稻的抽穗期、延长生育期。
全文摘要
本发明涉及水稻转录因子Os01g64730基因的应用，其是利用转录因子激活基序VP64(即4个转录因子激活基序VP16)与水稻转录因子Os01g64730基因融合构建得到组成型转录因子，并转化到农作物如水稻中，从而推迟转基因水稻的抽穗期、延长生育期。对于详细阐明水稻抽穗调控的分子机理，具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，延长水稻生育期，改善水稻对不同生态区的适应能力，因此在生产实践中同样具有重要意义。
文档编号C12N15/62GK102775499SQ20121027262
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月1日 优先权日2012年8月1日
发明者刘军, 刘斌, 张春雨, 李宏宇, 林辰涛, 赵涛 申请人:中国农业科学院作物科学研究所