专利名称：建立幽门螺杆菌核酸指纹图谱的方法及其产品的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种建立幽门螺杆菌核酸指纹图谱的方法，以及使用该方法，对幽门螺杆菌进行快速鉴定的方法。
背景技术：
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,简称Hp)首先由巴里 马歇尔(Barry J.Marshall)和罗宾 沃伦(J. Robin Warren) 二人发现。幽门螺杆菌属弯曲菌科螺杆菌属，是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌。长2. 5 4. Oii m，宽0. 5 I. Oii m，革兰染色阴性，有动力，在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形。在绵羊血琼脂培养基上生长时，除典型的湿润、无色透明、扁平状、边缘整齐。幽门螺杆菌是微需氧菌，环 境氧要求5 8%，在大气或绝对厌氧环境下不能生长。该菌对于青霉素、阿莫西林敏感，对万古霉素(vancomycin)、三甲氧节胺卩密唳乳酸盐(trimethoprim lactate)、两性霉素B(amphotercin B)、多粘菌素B (polymyxin B)等抗生素具有一定的抗性。幽门螺杆菌感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(WH0/IARC)将幽门螺杆菌定为I类致癌原。幽门螺杆菌的传染力很强，可通过手、不洁食物、不洁餐具、粪便等途径传染。行病学研究表明幽门螺杆菌感染了世界范围内一半以上的人口，其发病率各个国家不同，甚至同一国家的各个地区也不相同。目前已知发病率的高低与社会经济水平，人口密集程度，公共卫生条件以及水源供应有较密切的关系。也有报道指出，幽门螺杆菌的感染有明显的季节分布特征，以7 8月份为高峰。在亚洲地区，中国内地、中国香港、越南、印度等少年幽门螺杆菌的感染率分别60%、50%、40%、70%。慢性胃炎患者的胃粘膜活检标本中幽门螺杆菌检出率可达80% 90%，而消化性溃疡患者更高，可达95%以上，甚至接近100%。胃癌由于局部上皮细胞已发生异化，因此检出率高低报道不一。在自然人群中初出生的新生儿血清中抗幽门螺杆菌-IgG水平很高，接近成人水平，可能从母体获得被动免疫抗体之故。半年后迅速下降。在我国及大多数发展中国家中阳性率待降至10% 20%后又迅速回升。大约在10岁以后即迅速上升达到或接近成人阳性检出率水平。因此加紧对该菌的检测研究具有十分重要的意义。为了建立适合本病诊断和流行病学调查的快速、敏感、特异、准确的方法，国内外许多学者进行了大量研究，并取得了显著的成绩，已经有许多不同的技术用于幽门螺杆菌的测定。依据取材有无创伤性，目前测定幽门螺杆菌的方法可分为两大类①无创检查包括血清学方法、同位素标记尿素的呼气试验和胃液聚合酶链反应等。②创伤性检查均为胃镜依赖方法，包括多种形态学、微生物学和分子生物学技术等。例如快速脲酶试验(hpRut)、血清学EISA法、胃黏膜病理活检法、细菌培养、尿素[13C]片呼气试验等方法。快速脲酶试验的灵敏度、特异性、诊断效率、阴性预示值都相对较差，易因个人经验差异、试剂质量、活检标本中可能混人血液等因素影响；组织切片染色法易受菌体分布不均匀及其他革兰阴性杆菌存在的影响；幽门螺杆菌在微需氧环境下生长，培养条件要求高，不易存活，对细菌培养做临床诊断造成很大困难，不易推广；而呼气试验对患者和医务人员以及周围环境的污染尚未解决；血清学EISA法虽灵敏度较好，但痛苦大、所需仪器昂贵、操作步骤繁琐费时、需要专业人员。近年来，已经出现质谱技术来检测核酸和蛋白质领域，其中质谱技术应用于核酸检测领域的理论基础在于，组成遗传物质DNA的基本单元——四种核苷酸之间存在质量差异，如 ddAMP、ddCMP、ddGMP、ddTMP 的分子量依次为 271. 2Da、247. 2Da、287. 2Da、327. IDa(其中ddTMP是经过修饰的)，它们之间的最小分子量差异在16Da，完全可以通过质谱进行分辨。使用质谱能够对碱基突变或多态位点(SNP )、插入/缺失(InDeI)、甲基化位点、基因定量、拷贝数变化(copy number variation, CNV)等多种DNA变化类型进行检测。已有一些公开文献使用质谱技术对微生物进行分类和鉴定，例如，中国专利申请CN102337223A、“产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制备方法”，公开了一种检测产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的MALDI-T0F鉴定方法，其中从平板上挑取产黄青霉A096孢子接种于SGY液体培养基培养，预处理得到粗蛋白溶液在色谱柱上分离纯化，并在羧甲基阳离子交换色谱柱上分离纯化，收集各洗脱组分，各组分离心超滤浓缩至所需体积，以宛氏拟青霉为敏感受试指示菌，追踪抗真菌活性组分，确定的活性成分判断获得蛋白的纯度；割取 SDS-PAGE电泳图上的单一条带，进行MALDI-T0F鉴定。该方法仅适用于特定微生物，且需要多重蛋白纯化过程，最终用MALDI-T0F鉴定特征蛋白Pc-Arctin，其过程繁琐、适用面窄，不能实现质谱分类细菌或微生物的目的。中国专利申请200910157210、“一种李斯特菌属细胞中脂肪酸组分的分析方法”公开了一种利用气相色谱质谱(GC-MS)分析法针对细菌脂肪酸进行分类的方法，包括李斯特菌复壮，用牛津琼脂平板和胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂平板分别分离和纯化李斯特菌，培养单个典型菌落的李斯特菌并制成菌悬液，用甲醛灭活处理，把经甲醛处理后的菌悬液平均分装在离心管洗涤，用盐酸和甲醇的混合液甲酯化，把制得的脂肪酸进行气相色谱质谱(GC-MS)分析。虽然该方法打破传统细菌分类学的局限，减少人为因素对传统形态分类带来的误差，同时为新的菌种和毒种的分类鉴定提供强有力的工具，但该法仍然属于利用质谱法进行细胞化学分析分类，并未针对核酸进行检测。国际专利申请 W02010/021548、“Method for identifying biological materiale. g. bacteria in sample of patient, involves separating stream of liquidcontaining sample into successive portions to form flying drops and ionizingflying drops to measure mass spectra”,公开了一种使用 MALDI-MS (基质辅助激光解吸和电离质谱)用于识别生物材料的方法和装置，包括准备包含试样和MALDI基质材料的液体，并将其用于形成液体的连续流束。将该流束分散成接连的部分，以形成发射到飞行中的液滴，或将流束发射到飞行中，然后分散成液滴。可使用从喷墨印刷机中已知的液滴形成技术。对飞行中的液滴电离出材料。测量来自各个液滴的电离材料的质谱。但该方法目的在于如何改善MALDI-MS检测生物物质的灵敏度，并不涉及质谱鉴定和分类任意微生物，因此也不能解决上述技术问题。由于质谱技术检测细菌存在着难以确定标准质谱特征图谱的问题。也就是说，尽管不同细菌之间的基因组DNA存在差异，将产生不同的核酸指纹图谱，但如果没有建立标准的质谱图谱数据库，则因为出现每次质谱检测细菌的结果因待检的基因组过于庞大而缺乏重复性，导致准确度下降。例如，朱健等人(“高效液相色谱-电喷雾多级质谱法对格尔德霉素粗品中各组分的初步判别及分类”，《中国抗生素》，2011年03期)报道了应用高效液相色谱-电喷雾多级质谱法(LC-ESI-MSn)对格尔德霉素(GDM)粗品中各组分进行与质量数相关的结构信息方面的初步判别及分类。该方法针对格尔德霉素(GDM)中不同组分的多级质谱碎片进行的分析整理,并对各种化合物进行了准确分类,但并不涉及针对细菌特定物质(如核酸)进行检测从而对细菌进行分类的方法。刘海洪(“MALDI TOF MS在细菌检测和鉴定中的应用”，《微生物学免疫学进展》，2003年02期)报道了“细菌体内含有大量的生物标志分子能用于细菌的化学分类和鉴定，针对如根据细菌的组成成分获得指纹图谱检测和鉴定细菌”，并对该方法预测其理论上的可行性。然而，该研究仅仅是理论上探讨了利用MALDI TOF MS对细菌进行分类的方向，其既没有指明所针对细菌的何种组分进行检测，也没有说明具体研究方法和过程。由于细菌中可用于分类的组分(如蛋白、DNA、RNA、多糖等)种类太多，且质谱技术针对不同待测物也存在各种实验参数的组合和选择，因此在此之后的近10年内并没有利用MALDI TOF MS进 行细菌鉴定的新的报道。中国专利申请201110154723、“MALDI TOF MS辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法”和201110154469、“MALDI TOF MS辅助鉴定霍乱弧菌的方法”公开了一种利用MALDI TOF MS技术辅助鉴定细菌的方法，包括预处理细菌培养物，采集所有菌株样品的MALDI TOF MS图谱，根据软件制备细菌标准图谱，使用相同的方法检测并采集待测细菌的图谱，以及比较二者图谱，根据匹配分数进行判定。由于该方法使用常规的处理(通过无水乙醇、甲酸和乙腈处理，并辅以离心，最后吸取上清液进行检测)，尽管其在一定程度上能表征该细菌的特征图谱，但由于其待测物中含有蛋白质、脂类、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其它能被离子化的分子，其得到的图谱实质上是上述各种分子的图谱集合，因此既需要处理和比对的图谱信息量过大，并且因待检分子过于庞大而导致其图谱特征性偏低，只适用于某具体细菌而无法推广到其他大量的细菌检测中。由于质谱技术检测细菌存在的上述缺陷，导致目前使用质谱技术检测细菌甚至幽门螺杆菌一直没有进展。作为最接近的现有技术，李波清等人(“胃癌相关幽门螺杆菌蛋白图谱特征初步分析”，《中华流行病学杂志》2003年第6期)和游运辉等人(“胃癌及慢性胃炎幽门螺杆菌的蛋白质组学研究”，《中南大学学报(医学版))),2008第5期)报道了利用质谱技术分析幽门螺杆菌特征蛋白的指纹图谱，并根据NCBI数据库的相关蛋白序列库进行比对分析，从而鉴定幽门螺杆菌的特征蛋白。然而该方法仍然停留在对幽门螺杆菌的特征蛋白的分析上，并不涉及如何建立幽门螺杆菌相关核酸质谱特征库并利用该库进行细菌鉴定、分型的用途，因此也无法解决上述问题。因此目前需要新的布鲁氏菌的鉴定和分析方法(如质谱法)来实现快速、准确、廉价、便捷的分类结果。
发明内容
本发明原理在于组成遗传物质DNA的基本单元一四种核苷酸之间存在质量差异，对布鲁氏菌基因组DNA上某个或某几个片段进行PCR和酶切后，将产生分子量和丰度各异的片段，使用质谱检测可产生核酸指纹图谱，不同布鲁氏菌之间基因组DNA存在差异，将产生不同的核酸指纹图谱，建立数据库后，可以实验结果与数据库中幽门螺杆菌标准图谱信息进行比对，即可完成对幽门螺杆菌的鉴定。因此，针对幽门螺杆菌特定区域的DNA设计合适的引物进行PCR扩增，然后将PCR产物通过特定内切酶进行消化，产生一系列长度不一丰度不一的核酸片段，并通过MALDI-TOF MS质谱进行核酸分析检测，并形成谱图。对布鲁氏菌目标基因序列进行扩增后酶切，得到幽门螺杆菌的图谱。可以实验结果与数据库中布鲁氏菌标准图谱信息进行比对，即可完成对布鲁氏菌的分类和鉴定(鉴定、分型、分类等)。此方法具有特异性强，灵敏度高，成本低，操作简便，用时少等优势。因此，本发明第一目的是提供一种基于酶切的幽门螺杆菌核酸指纹图谱制备方法。其特征在于，它至少包括如下步骤(I )PCR反应使用针对幽门螺杆菌的PCR通用引物，进行PCR扩增，得到含扩增目 标区域的PCR产物；(2) SAP酶消化用碱性磷酸酶(SAP酶)处理步骤(I)得到的PCR产物；(3)转录和核酸酶切使用特定的转录和内切酶，分别在一个反应体系中，对步骤
(2)得到的各个细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段；(4)纯化使用树脂处理步骤(3)得到的酶切产物；(5)质谱仪检测将步骤(4)得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到幽门螺杆菌的特征核酸指纹谱图。在一个实施方案中，所述通用引物包括但不限于SEQ ID No :1至SEQ ID No :2所示序列。在另一实施方案中，步骤3所述的特定酶,包括但不限于RNaseA酶。在一个具体实施方案中，步骤5的纯化包括在转录和酶切产物中加入超纯水，混匀后，再加入树脂，上下颠倒混匀15分钟。在另一个具体实施方案中，其中所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪。本发明的第二目的是建立幽门螺杆菌的指纹图谱，至少包括上述步骤1-5，和；(6)将步骤5得到的核酸指纹特征图谱，通过计算机软件进行汇总和整理，得到幽门螺杆菌的标准核酸指纹特征图谱。在一个实施方案中，所述软件是发明人自行研究开发的BioExplore软件，其版权号为软著登字第136879号、登记号2009SR10700。本发明的第三目的是提供一种快速鉴定螺旋幽门杆菌的方法，包括(I )PCR反应使用针对幽门螺杆菌的PCR通用引物，扩增待测菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物；(2) SAP酶消化用碱性磷酸酶(SAP酶)处理步骤(I)得到的PCR产物；(3)转录和核酸酶切使用特定的转录和内切酶，在一个反应体系中，对步骤(2)得到的细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段；(4)纯化使用树脂处理步骤(3)得到的酶切产物；(5)质谱仪检测将步骤(4)得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到该细菌的核酸指纹特征图谱；
(6)将所得核酸指纹特征图谱与前述图谱库中幽门螺杆菌核酸指纹特征图谱进行比较，从而判断待测细菌是否为螺旋幽门杆菌。本发明的第四目的是提供能用于螺旋幽门杆菌分类和鉴定的试剂盒，包括( I)用于扩增螺旋幽门杆菌DNA的通用引物对及其缓冲液；(2) SAP酶及其缓冲液；(3) RNAase 及其缓冲液；(4)用于纯化酶切产物的树脂；(5)用于比对核酸指纹特征图谱的分析软件。
在一个实施方案中，其中所述引物是SEQ ID NO: 1-2。在另一实施方案中，其中所述软件是BioExplore软件，其版权号为(软著登字第136879 号、登记号 2009SR10700)。定义本发明所述的“细菌或幽门螺杆菌分类和鉴定”，包括对细菌进行鉴定和识别、分型、分种、分类。例如在食品安全检测中(如奶制品、肉制品)，通过幽门螺杆菌分类或鉴定，能准确识别传染源和细菌组成，以备采用合理措施进行保障食品安全。本发明所述的幽门螺杆菌DNA基因组上一个区域，优选是具有高度保守同时又具有一定多态性的区域。本发明所述的保守区域或保守片段，优选是幽门螺杆菌rRNA区域。rRNA是研究细菌进化和亲缘关系的重要指标，它含量达80%，并存在于所有细菌中，rRNA基因由保守区和可变区组成，在细菌中高度保守，素有“细菌化石”之称，是细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟。目前以16SrDNA进行幽门螺杆菌分类和鉴定的方法主要是采用PCR产物直接测序，结果与数据库进行比对的方法。测序法应用于临床检测，目前存在如下问题(1)成本高；(2)耗时；(3)对于混合样本，测序易产生套峰，难以进行有效区分；(4) 16S rDNA全长
I.5kb以上，一般需要经过两次测序并将结果进行拼接，在这个过程中易引入误差。如前所述，16S rDNA对幽门螺杆菌分类鉴定具有重要的意义，但是传统测序等方法检测成本高、耗时长；对于混合感染的样品，测序法将得到混合的序列峰图，难以进行有效的区分，并且利用质谱进行待测物分析，需要选择合适的待测物和优化质谱参数，因此目前需要新的细菌分类技术(如质谱法)来实现快速、准确、廉价、便捷的分类结果。本发明所述的“通用引物”是能位于各种细菌基因组的待扩增区域的上下游，能在不同细菌基因组中扩增相应片段的引物。其中，本发明所述的基因组上的待扩增区域选自与SEQ ID NO:3所示序列具有至少60%同源性的序列，优选该序列具有62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同源性的序列。由于对于细菌DNA (例如16S rDNA)而言，其序列通常由保守区和可变区组成，且可变区多为不连续或短片段甚至SNP形式夹杂在保守区中间或两端，因此使用通用引物即能在不同细菌基因组中扩增相应片段。因各种细菌的该片段均具有一定同源性，故在与SEQ IDN0:3所示序列具有至少60%同源性的片段中，经过酶切和质谱后能得到待测细菌的核酸指纹特征图谱。在一个实施方案中，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori 26695) 16S rDNA的特定区域是 16S rDNA 序列 AGAGITTGATCCTGGCTCAGAGTGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACAT GCAAGTCGAACGATGAAGCTTCTAGCTTGCTAGAGTGCTGATTAGTGGCGCACGGGTGAGTAACGCATAGGTTATGTGCCTCTTAGTTTGGGATAGCCATTGGAAACGATGATTAATACCAGATACTCCCTACGGGGGAAAGATTTATCGCTAAGAGATCAGCCTATGTCCTATCAGCTTGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCTATGACGGGTATCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGACACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGACGCAGCAG,即 SEQ ID NO:3。在一个具体实施方案中，该特定区域的引物是SEQ ID No 1和SEQ ID No :2。有益效果I、本发明建基于质谱检测技术，由于质谱检测的高灵敏性，使用本方案对螺旋幽门杆菌存在与否的检测下限能够远超出其他技术方案；2、对于不同的样本，本发明可比对它们产生的核酸指纹图谱，将实验产生的核酸指纹图谱与数据库中幽门螺杆菌标准菌株的图谱进行对比，经生物信息学分析，可以判断该菌是否为幽门螺杆菌分离株；3、使用本方案可以进行幽门螺杆菌的分类与鉴定，并可用于临床检验等方面。
4、相对于现有技术，全过程仅仅数小时内完成，省时省力；5、本发明的数据库是开放式的，可不断补充新的分离株，不断完善和扩大数据库，以便更为准确的完成幽门螺杆菌的鉴定；6、另外，本发明首次提出将幽门螺杆菌的16S rDNA区域作为待测物进行质谱检测，以获得幽门螺杆菌的不同分离株的核酸指纹图谱，用于该菌的分类与鉴定。
图1、2 :幽门螺杆菌的核酸指纹特征图谱。图3 :实施例二的待测细菌质谱检测特征图。图4 :实施例三的待测细菌的碱性品红染色图。图5 :PCR扩增后凝胶电泳图。图6 :实施例五的待测细菌质谱检测特征图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。实施例一幽门螺杆菌核酸指纹图谱的建立一、设计并选择合适弓I物根据幽门螺杆菌(Helicobacter pylori 26695)的16S基因序列，设计PCR引物，
分别为
权利要求
1.建立幽门螺杆菌核酸指纹图谱的方法及其产品，其特征在于，它至少包括如下步骤 (I )PCR反应使用针对幽门螺杆菌的PCR通用引物，进行PCR扩增，得到含扩增目标区域的PCR产物； (2)SAP酶消化用碱性磷酸酶(SAP酶)处理步骤(I)得到的PCR产物； (3)转录和核酸酶切使用特定的转录和内切酶，分别在一个反应体系中，对步骤(2)得到的各个消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段； (4)纯化使用树脂处理步骤(3)得到的酶切产物； (5)质谱仪检测将步骤(4)得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到不同细菌的特征核酸指纹谱图。
2.根据权利要求I的方法，其中通用引物包括但不限于SEQID No 1和SEQ ID No 2所示序列；且用于核酸酶切的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。
3.权利要求I或2的方法，其中步骤5的纯化包括在转录和酶切产物中加入超纯水，混匀后，再加入树脂，上下颠倒混匀15分钟；所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪。
4.利用权利要求I的方法用于建立幽门螺杆菌标准核酸指纹特征图谱的方法，至少包括上述步骤1-5，和； (6)将步骤5得到的幽门螺杆菌核酸指纹特征图谱，通过计算机软件进行汇总和整理，得到所述的幽门螺杆菌的标准核酸指纹特征图谱。
5.权利要求4的方法，其中所述软件是BioExplore软件，其版权号为软著登字第136879 号、登记号 2009SR10700。
6.利用权利要求4的方法所建立的幽门螺杆菌标准核酸指纹特征图谱，用于幽门螺杆菌鉴定或分类的方法，包括 (I )PCR反应使用针对细菌的PCR通用引物，扩增待测细菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物； (2)SAP酶消化用碱性磷酸酶(SAP酶)处理步骤(I)得到的PCR产物； (3)转录和核酸酶切使用特定的转录和内切酶，在一个反应体系中，对步骤(2)得到的细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段； (4)纯化使用树脂处理步骤(3)得到的酶切产物； (5)质谱仪检测将步骤(4)得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到该细菌的核酸指纹特征图谱； (6)将所得核酸指纹特征图谱与幽门螺杆菌标准核酸指纹特征图谱进行比较，从而判断待测细菌是否为幽门螺杆菌。
7.权利要求6的方法,其中步骤6通过BioExplore软件进行比较检测。
8.提供能用于幽门螺杆菌分类和鉴定的试剂盒，包括 (1)用于扩增细菌DNA的通用引物对及其缓冲液； (2)SAP酶及其缓冲液； (3)RNAase及其缓冲液； (4)用于纯化酶切产物的树脂； (5)用于比对核酸指纹特征图谱的分析软件。
9.权利要求8的试剂盒，其中所述引物是SEQID NO: 1-2o
10.权利要求8或9的试剂盒，其中所述软件是BioExplore软件，其版权号为(软著登字第 136879 号、登记号 2009SR10700)。
全文摘要
本发明公开了一种基于质谱技术快速鉴定幽门螺杆菌的方法，包括PCR扩增、SAP酶消化、转录和核酸酶切、纯化、质谱仪检测等步骤。基于该方法，建立螺旋幽门杆菌的核酸指纹图谱数据库。根据实验产生的质谱峰图，可对待检样品中的幽门螺杆菌进行快速鉴定，结果可广泛运用于幽门螺杆菌分型和分类、及环境卫生和公共安全检疫等领域。
文档编号C12Q1/68GK102827930SQ20121027253
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者马庆伟, 赵洪斌, 张海燕, 赵艳梅 申请人:向华