专利名称:一种检测Leber病调控子的试剂盒及用途的利记博彩app
技术领域:
本发明属生物技术领域,涉及一种与Leber病调控子相关的线粒体基因突变的检测方法,特别涉及检测线粒体tRNAMet A4435G突变的方法,还涉及用于检测与Leber病调控子相关的线粒体DNA A4435G突变的试剂盒,以及上述方法或上述的试剂盒在检测与Leber病调控子相关的线粒体DNA A4435G突变中的应用。
背景技术:
Leber 遗传性视神经病变(Leber,s Hereditary Optic Neuropathy, LH0N,简称Leber病)是视神经病变的一种类型,主要累及视网膜、巩膜筛板前部视乳头黄斑束纤维,导致视神经退行性变的母系遗传病,严重的影响着人们正常的生产、生活。根据国家卫生部(http://www. moh. gov. cn/)最新数据统计我国现有的低视力人口约有710万,盲人约有500万,占总人数的0. 4%,成为世界上视力损伤最严重的国家之一。其中,由视神经病变引起的约为55万。1871年德国眼科医生Theodor Leber首次报道该病的临床症状、体征和遗传特性。1972年Erickson等发现LHON的遗传方式呈典型的母系遗传特征。1988年WallaceDC等发现了第一个与LHON相关的线粒体基因组DNA (mitochondria DNA, mtDNA)突变位為、ND4 G11778A。目前已报道50多种线粒体DNA突变位点与LHON致病相关(http://WWW.mitomap. org/),其中 tRNAMet A4435G 和 tRNAThr A15951G 等被称为 “Leber 病调控子”。与线粒体DNA突变相关的Leber遗传性视神经病变在早期临床症状不明显,早期的检查常常会因此被耽误,尤其在我国偏远农村地区,这种情况普遍存在。因此,在高危人群和易感人群中开展mtDNA突变筛查,对于预防和控制与线粒体相关的LHON的发生有着极其重要的作用。自发现与mtDNA突变相关的疾病以来,检测线粒体突变位点的检测方法主要还是序列测定。直接测序法是鉴定突变的黄金标准,但该操作繁琐,费用昂贵限制了它的广泛应用。近年来,国内相继报道了 Leber遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒及其检测方法,以满足对线粒体突变突变进行广泛筛查的需要,如福建医科大学于2005年申请了的基因诊断试剂盒及其检测方法专利(专利号200510006097. 8),该发明是根据90 %以上的Leber氏遗传性视神经病变患者的线粒体DNA突变属于3个原发性致病位点突变(G11778A、G3460A和T14484C),设计和合成位点特异性PCR引物,直接以全血样作PCR的DNA模板,利用等位基因特异性多重PCR技术,单管一次性PCR反应,同时检测LHON患者的线粒体DNA的3个原发性致病突变位点,具有简便快速、高效、费用低、特异性好、只需微量血液样本等优点,为LHON患者的快速临床基因诊断提供一种简易、可靠的方法和试剂盒,具有巨大的普及推广应用价值。但是该方法存在血液中直接PCR扩增的难度加大,实验中采取的多重PCR的条件要求将会增加,检测方法跟普通的方法没有本质的区别。2006年杭州优思达生物科技有限公司建立一种以单核苷酸多态性核酸试纸快速检测LHON线粒体DNA中G11778A位点突变的新方法(专利号200610003429. I)。在应用单核苷酸多态性核酸检测试纸条进行多态位点或突变位点的检测时,需要设计一条特异性延伸引物,这条引物的3’端碱基紧临多态性碱基或突变碱基,其在DNA聚合酶的作用下开始延伸,带有抗原标记与模板对应的双脱氧单核苷酸(ddNTP)被连接到延伸引物上。虽然该方法能够实现短时间内的检测阳性位点,但PCR 扩增条件严格,存在假阴性的几率大大增加。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测Leber病调控子相关的线粒体DNA突变的试剂盒,由引物序列、提取样本基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、阳性标本对照、阴性标本对照以及使用说明书构成,其中,提取样本基因组DNA的试剂主要由细胞裂解液和溶液I (主要成分是蛋白酶K)组成;PCR扩增反应试剂包括dNTP、10XPCR缓冲液、MgCl2、三蒸水和Taq酶,所述的引物序列外前向引物F: TGG CTC CTT TAA CCT CTC CA,外反向引物R: AAG GATTAT GGA TGC GGT TG;内前向引物 F: CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT,内反向引物 R: AATCAG TGC GAG CTT AGC GC ;限制性内切酶包括限制性内切酶III ;阳性标本对照是含有线粒体序列第4435位点发生A>G突变的酶切样本、阴性标本对照是不含有线粒体序列第4435位点发生A>G突变的酶切样本。在上述试剂盒中,在PCR扩增反应试剂中添加用于提高延伸反应特异性的少许二甲基亚砜(0. 1-0. 2 y I为宜)。本发明的再一个目的是提供所述试剂盒在检测与Leber病调控子相关的线粒体基因mtDNA A4435G突变中的应用。通过以下步骤实现
(1)基因组DNA的提取运用蛋白酶K消化裂解法,从少量的血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片、血滤纸片或唾液的样本中提取基因组DNA ;
(2)特异性PCR扩增使用Primer5. 0软件和01igo7. 0软件根据SEQ ID N0:5所示的人类线粒体基因序列设计引物包含突变位点的基因片段3777-4679,外前向引物F: TGGCTC CTT TAA CCT CTC CA (SEQ ID NO: 1),外反向引物 R: AAG GAT TAT GGA TGC GGT TG(SEQ ID NO: 2);内前向引物 F: CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT (SEQ ID NO: 3),内反向引物 R: AAT CAG TGC GAG CTT AGC GC (SEQ ID N0:4);
(3)酶切鉴定将上述PCR产物用限制性内切酶A^aIII对A4435G突变位点处进行酶切;
(4)突变检测琼脂糖凝胶电泳检测,直接根据酶切PCR产物产生的DNA片段数量及DNA片段大小,检测mtDNA是否发生A4435G突变。在上述检测A4435G突变的方法的步骤(I)中,样本来源于从毛细血管静脉血标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片、血滤纸片或唾液,根据取样方式或被测样本形式不同,对不同样本进行相应的预处理,样本预处理方法如下
(1)血标本或血滤纸片取20 200ill少量血标本(如一滴血)或Icm2的血滤纸片放A I. 5ml EP 管(Eppendorf 管),加入 900 U I 红细胞裂解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl,pH
7.6)室温静置lOmin,充分裂解红细胞,12000rpm离心lmin,收集白细胞沉淀;
(2)带毛囊的毛发用70%乙醇洗带毛囊的毛发I次,后再用蒸馏水冲洗毛发2次。在1.5ml EP管中分别放入2 4根毛发,毛囊置于EP管底部,用干净的剪刀剪去毛发高于EP管的部分;
(3)口腔粘膜刮片或唾液收集唾液前,必须让被收集者漱口。以除去口腔中过多的老化细胞、食物残渣、牙膏、咖啡、烟等物质。半小时内不要喝水、进食、吸烟,然后开始收集口腔粘膜刮片或唾液,可视条件选择如下方法收集唾液样本①舌头围绕口腔刮取粘膜细胞,将约0. Iml唾液直接吐进EP管内生理盐水漱口,吐进EP管内,吸取PBS溶液至装有通过上述任一种方法收集的唾液样本的EP管中,反复吹打后,12000rpm离心5min,除去上清,重复该过程一次用棉拭子反复刮拭面颊内壁6次,空气中干燥,然后用灭菌过的镊子小心撕去其外表面,放入EP管中将唾液吐在滤纸上,空气中干燥后形成唾液斑,再用干净的剪刀剪成大小约Icm2碎纸片置于EP管中。
在步骤(I)中经过上述预处理后,用细胞裂解液和蛋白酶K对上述样本进行消化裂解,再盐析法去除蛋白等杂质,异丙醇沉淀DNA,最后用高压灭菌水或TE缓冲液溶解后于-20°C保存备用。在上述检测方法的步骤(2)中,引物设计的指导思想是,针对A4435G位点存在的位置,利用巢式PCR扩增基因片段;针对4435位点设计内外巢式引物(参照图I)。在上述检测方法的步骤(3)中,针对特异性PCR扩增后,A4435G位点形成了新的酶切位点。其酶切位点是由mtDNA A4435G突变形成的,其中的限制性内切酶为犯a III ;
用以上设计的引物,以相应的被检测样本的DNA为模板,通过PCR外引物扩增后分别获得明亮清晰的大小约903bp的恒定扩增带,在使用内引物扩增出365bp扩增带4435突变位点在扩增片段上。在上述检测Leber病调控子突变的方法中,结合特异性PCR技术和酶切技术,每份DNA样本分别用特异性引物即外/内引物于PCR反应管中进行巢式PCR扩增,然后进行突变位点处的酶切,通过PCR酶切后便可在几小时内检出Leber病调控子相关的mtDNA A4435G突变。理论上,基因组DNA样本经PCR反应,即体系中仅加入针对突变型位点A4435G引物F#/R#后,扩增后以此产物为模板再在引物F@/R#下进行巢式PCR扩增,然后用限制性内切酶III进行酶切,就可进行检测。也就是说,同DNA样本经巢式PCR-酶切,从而使检测结果更为准确、可信。用本发明的方法及其制备的体外检测Leber病调控子相关的线粒体基因mtDNAA4435G突变试剂盒具有以下特点
I.传统上获得Leber遗传性视神经病变患者基因组DNA的方法是从血液中提取,每人大约需要3 5ml。这种采血方法给很多被检者尤其是婴幼儿带来了一些痛苦和伤害,而且在跨地区传递样本时存在一定的风险和麻烦。本发明运用蛋白酶K消化裂解法,从少量的血液标本(如一滴血)、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片血滤纸片或唾液等样本中快速提取基因组DNA。该方法解决了传统上从Leber遗传性视神经病变患者血液中提取DNA的问题,减轻被检者的痛苦;而且还解决了跨地区传递样本的问题,血滤纸片、毛发以及口腔粘膜刮片(棉拭子)或唾液斑滤纸片等可以很容易的放在信封内,并可通过邮寄的方式跨地区传递。2.目前国内外有几种线粒体相关的母系遗传性疾病基因诊断方法,如直接测序法荧光定量PCR检测方法、基因芯片检测方法等,由于其自身的缺陷,如费时费力、操作繁琐以及检测费用偏高而不易在临床进行推广。与这些方法相比较,PCR-酶切技术则结合了特异性PCR技术及酶切技术两者的优点,每份DNA样本用特异性引物即引物F/R于PCR反应管中进行特异性巢式PCR扩增,通过巢式PCR-酶切便可在几小时内同时检出mtDNA A4435G突变。另外值得一提的是,本方法所用的引物均经过仔细设计。首先,正常和突变等位基因间不同的碱基在酶切过程中对特异性限制性内切酶形成的位点不同,因而大大提高了酶切的特异性;另外由正常对照和空白对照的产物可作为整个PCR反应的分子内控指标,从而避免假阴性结果的出现,提高检测结果的稳定性。通过调整不同引物的浓度和比例以及对PCR反应条件进行优化,以确保结果的特异性和稳定性。3.应用本发明提供的试剂盒进行mtDNA A4435G突变检测,成本较其他检测方法更低;检测流程简便、快速,结果判读直观;对实验设备及操作人员无特殊要求,适合在一般医院、分子生物实验室开展,便于在全国范围内特别是欠发达地区实行Leber病调控子相关的mtDNA A4435G突变的大规模筛查和预防性检查。4.本发明是针对目前检测tRNAMet A4435G突变的方法所存在的缺点提出的一种快速、简便、准确、经济的LHON相关基因突变检测方法。
图I是本发明的基因特异性巢式PCR扩增方案示意图。图2是携带A4435G突变(WZL4家系)Leber遗传性视神经病变家系系谱图。图3是本发明的基因特异性巢式PCR引物示意图。图4是基因特异性巢式PCR扩增酶切鉴定mtDNA A4435G突变的7%聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图I和2中F#为特异性巢式PCR第一次扩增的正向引物;R#为特异性巢式PCR第一次扩增的反向引物,与F#配对使用;F#为特异性巢式PCR第二次扩增的正向引物,R内为特异性巢式PCR第二次扩增的反向引物,与F肖配对使用;A4435G表示为线粒体DNA第4435位,野生型为A,发生基因突变后为G。图3中□为正常男性个体;〇为正常女性个体;■为发病男性个体;籲为发病女性个体;,为先证者;/为已死亡的个体;I为该家系的第一代成员;II为该家系的第二代成员;111为该家系的第三代成员。图4中Rl表示野生型位点检测的PCR扩增产物的电泳图(正常对照者);R2表示先证者(WZL4- III -2)携带A4435G突变位点检测的PCR扩增产物(未酶切)的电泳图;R3为携带A4435G突变的先证者父亲(WZL4- II -I) ;R4表示先证者携带A4435G突变位点检测的PCR扩增产物酶切鉴定的电泳图;R5为携带A4435G突变的先证者母亲(WZL4- II -2);R6-R12分别为母系成员携带A4435G突变并且LHON患者。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例I携带线粒体基因A4435G突变和原发性G11778A突变的Leber遗传性视神经病变家系的检测,见图I。I.检测样本
选择I个携带A4435G突变的Leber遗传性视神经病变家系(WZL4家系)。其家系图见图2。这个家系呈现典型的母系遗传,发病者均以视力下降不能矫正为唯一的临床症状,但是家系中每个成员的视力损伤程度从轻度到极重度不等。这个家系总人数为25人,其中母系成员数为14人,视力下降患者有8人。2.基因组DNA的提取
分别获取这8名受检者的血滤纸片(一滴血),将血滤纸片用干净的剪刀剪成大小约Icm2的碎纸片放入I. 5ml EP管(Eppendorf管),加入900 y I红细胞裂解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl,pH 7. 6)室温静置lOmin,充分裂解红细胞,12000rpm离心lmin,收集白细胞沉淀;然后加入600 u I细胞裂解液,混匀后再加入溶液I,使得蛋白酶K的工作浓度为20 V- g/mlo充分混勻后55°C消化裂解,接着以盐析法去除蛋白等杂质,异丙醇沉淀DNA,最后用高压灭菌水或TE缓冲液溶解后于_20°C保存备用。3.引物设计
使用Primer 5. 0软件和01igo7. 0软件协助设计改良引物,根据已公开的人类线粒体基因剑桥参考序列(SEQ ID N0:5)进行设计,引物的设计方案(见图3)如下
针对mtDNA 4435位点,保证引物设计的特异性,我们设计巢式PCR两对引物F#/R外,F;它们长度、退火温度相近便于实验条件稳定,以增强特异性。由此设计出的4435位点的巢式PCR引物为外前向引物F外TGG CTC CTT TAA CCT CTC CA,外反向引物R外AAGGAT TAT GGA TGC GGT TG;内前向引物 F 内CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT,内反向引物 R: AAT CAG TGC GAG CTT AGC GC。4.基因特异性巢式PCR扩增
根据上述设计的4条引物序列,通过人工合成(委托生物公司)获得2对引物,以上述提取的被检样本基因组DNA为模板,进行基因特异性巢式PCR扩增和7%的聚丙烯酰胺凝胶电泳酶切鉴定。表I基因特异性巢式PCR扩增反应体系(TAKARA公司产品)
PCR扩増反应试剂所需量
10 X PCR缓冲液1^1
dHTP (200 nmol/L)0.8M-1
MgCl; (25 umol/L)0.8 M-1
Fj-! F *0.4 M-I
引物--
R R *o.4Hi
Taq 聚合酶(5 U/M-l)0.2M-1
模板MA20ng
二塞水 UP t0 一__10 M-1
巢式PCR循环参数使用外引物为94°C预变性5min,接着94°C变性30s,58°C退火30s,72 °C延伸30s,重复循环30次后,然后使用内引物94°C变性30s,55°C退火30s,72 °〇延伸30s,重复循环30次后,最后于72 °C再延伸5 min。PCR产物5 10 yl在7%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳,经EB染色后在凝胶成像仪上观察并照相记录结果。5.结果
根据图4可知,当先证者和正常对照样本的基因组DNA分别经2对引物F#/R#,F内/R@巢式PCR酶切鉴定后,只产生一条365bp恒定扩增带,经限制性内切酶酶切鉴定后,产生的恒定扩增带被限制性内切酶切成两段(参见图4泳道R4),证明先证者样品含mtDNA A4435G突变;而经限制性内切酶酶切鉴定后,产生的恒定扩增带没有被限制性内切酶切成两段(参见图4泳道R1),证明该样品不含mtDNA A4435G突变。家系WZL4的先证者(WZ4L- III -2)的基因组DNA经2对引物F外/R外,、/1^进行巢式PCR后,出现了 I条365bp的恒定扩增带(参见图4泳道R2);而经限制性内切酶酶切后,出现了两条分别为251bp和114bp条酶切条带(参见图4泳道R4),证明了该样品携带mtDNA A4435G突变。R3为携带A4435G突变的先证者父亲(WZL4- II -I) ;R4表示先证者携带A4435G突变位点检测的PCR扩增产物酶 切鉴定的电泳图;R5为携带A4435G突变的先证者母亲(WZL4- II -2) ;R6_R12分别为母系成员携带A4435G突变并且LHON患者。6.基因特异性巢式PCR扩增检测方法可靠性的检验
经基因特异性巢式PCR扩增酶切鉴定后,我们在家系母系成员中检测出携带A4435G突变阳性个体。进一步将这些标本的PCR扩增产物进行测序分析,测序结果与基因特异性巢式PCR扩增结果相吻合,说明使用本发明方法检测线粒体基因A4435G突变的可靠性和稳定性。基因特异性巢式PCR技术与荧光定量PCR技术、测序及基因芯片技术相比具有如下优点(见表3)。表3本专利与其他相关专利技术指标对照
权利要求
1.一种检测Leber病调控子相关的线粒体DNA突变的试剂盒,由引物序列、提取样本基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、阳性标本对照、阴性标本对照以及使用说明书构成;其中,提取样本基因组DNA的试剂由细胞裂解液和主要成分是蛋白酶K的溶液I组成;PCR扩增反应试剂包括dNTP、10XPCR缓冲液、MgCl2、三蒸Taq水和酶;引物序列是外前向引物 F: TGG CTC CTT TAA CCT CTC CA,外反向引物 R: AAG GAT TAT GGA TGC GGT TG;内前向引物 F: CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT,内反向引物 R: AAT CAG TGC GAG CTT AGC GC;限制性内切酶包括限制性内切酶犯a III;阳性标本对照是含有线粒体序列第4435位点发生A>G突变的酶切样本、阴性标本对照是不含有线粒体序列第4435位点发生A>G突变的酶切样本。
2.根据权利要求I所述的一种检测Leber病调控子相关的线粒体DNA突变的试剂盒,其特征在于,在上述试剂盒中,在PCR扩增反应试剂中添加0. 1-0. 2u I 二甲基亚砜。
3.权利要求I所述的一种检测Leber病调控子相关的线粒体DNA突变的试剂盒在检测与Leber病调控子相关的线粒体基因mtDNA A4435G突变中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,通过以下步骤实现· (1)基因组DNA的提取运用蛋白酶K消化裂解法,从少量的血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片、血滤纸片或唾液的样本中提取基因组DNA ; (2)特异性PCR扩增使用Primer5. 0软件和01igo7. 0软件根据SEQ ID NO: 5所示的人类线粒体基因序列设计引物包含突变位点的基因片段3777-4679,外前向引物F: TGGCTC CTT TAA CCT CTC CA,外反向引物 R: AAG GAT TAT GGA TGC GGT TG;内前向引物 F:CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT,内反向引物 R: AAT CAG TGC GAG CTT AGC GC ; (3)酶切鉴定将上述PCR产物用限制性内切酶A^aIII对A4435G突变位点处进行酶切; (4)突变检测琼脂糖凝胶电泳检测,直接根据酶切PCR产物产生的DNA片段数量及DNA片段大小,检测mtDNA是否发生A4435G突变。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,在步骤(I)中,样本来源于从毛细血管静脉血标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片、血滤纸片或唾液,根据取样方式或被测样本形式不同,对不同样本进行预处理,样本预处理方法如下 (1)血标本或血滤纸片取20 200ii I血标本或Icm2的血滤纸片放入I. 5mlEppendorf管,加入900 ill红细胞裂解缓冲液室温静置lOmin,充分裂解红细胞,12000rpm离心lmin,收集白细胞沉淀;所用缓冲液为20mmol/L Tris-HCl, pH 7. 6 ; (2)带毛囊的毛发用70%乙醇洗带毛囊的毛发I次,后再用蒸馏水冲洗毛发2次,在1.5ml Eppendorf管中分别放入2 4根毛发,毛囊置于Eppendorf管底部,用干净的剪刀剪去毛发高于Eppendorf管的部分; (3)口腔粘膜刮片或唾液收集唾液前,必须让被收集者漱口,以除去口腔中过多的老化细胞、食物残渣、牙膏、咖啡、烟,半小时内不喝水、进食、吸烟,然后开始收集口腔粘膜刮片或唾液,选择如下方法收集唾液样本①舌头围绕口腔刮取粘膜细胞,将0. Iml唾液直接吐进Eppendorf管内!②生理盐水漱口,吐进Eppendorf管内,吸取PBS溶液至装有通过上述任一种方法收集的唾液样本的Eppendorf管中,反复吹打后,12000rpm离心5min,除去上清,重复该过程一次用棉拭子反复刮拭面颊内壁6次,空气中干燥,然后用灭菌过的镊子小心撕去其外表面,放入Eppendorf管中;@将唾液吐在滤纸上,空气中干燥后形成唾液斑,再用干净的剪刀剪成Icm2碎纸片置于Eppendorf管中。
6.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,在步骤(I)中经过预处理后,用细胞裂解液和蛋白酶K对上述样本进行消化裂解,再盐析法去除蛋白等杂质,异丙醇沉淀DNA,最后用高压灭菌水或TE缓冲液溶解后于_20°C保存备用。
全文摘要
本发明提供一种检测Leber病调控子相关的线粒体DNA突变的试剂盒,由引物序列、提取样本基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、阳性标本对照、阴性标本对照以及使用说明书构成,限制性内切酶包括限制性内切酶NlaⅢ;阳性标本对照是含有线粒体序列第4435位点发生A>G突变的酶切样本。本发明的试剂盒可在检测与Leber病调控子相关的线粒体基因mtDNAA4435G突变中的应用。本发明可确保检测结果的特异性和稳定性,成本较其他检测方法更低,是检测流程简便、快速,准确、经济的LHON相关基因突变检测方法。
文档编号C12Q1/68GK102747152SQ20121020765
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月24日 优先权日2012年6月24日
发明者冀延春, 张娟娟, 管敏鑫, 肖云, 蒋萍萍 申请人:浙江大学