专利名称：高表达耐拉米夫定hbv病毒肝癌细胞株的利记博彩app
技术领域：
本发明属微生物动物细胞系领域，涉及基于H印G2稳定高表达HBV YVDD变异株细胞系，具体涉及基于HepG2稳定高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株，尤其涉及高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株H印G2. HS204V及其制备方法。本发明的细胞株可用于筛选抗HBV药物、研究HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的HBV细胞模型。
背景技术：
现有技术公开了 HBV细胞模型是筛选抗药物、研究其生物学特点及其与细胞间相互作用的必要工具，尤其在研究有关肝疾病的发病机制、免疫机制、抗病毒药物的筛选中具有重要作用；其中，Hep2. 2. 15细胞是HBV细胞模型开发研究的里程碑，有研究显示，其用含2个HBV头对尾二聚体的pDolt-HBV-Ι重组载体转染H印G2细胞，经G418筛选后获得一个 产高水平HBsAg和HBeAg的细胞克隆，其胞内外均能检测到HBV-DNA以及具有感染性的完整病毒颗粒。迄今，Hep2. 2. 15仍是相关领域应用最为广泛的HBV细胞模型。近年来，临床治疗有关肝疾病多采用以拉米夫定为代表的核苷类似物类抗HBV药物，取得了较好的疗效，为众多慢性乙型肝炎(CHB)患者带来福音，但同时，也产生了严重的耐药问题；因此，对于HBV耐核苷类药物的分子生物学机制的研究成为目前临床治疗的重中之重。在HBV耐药株逐年上升的临床背景下，!fep2. 2. 15显然已经不能完全满足对于耐核苷类药物HBV病毒株的研究，为进一步研究HBV耐药的分子生物学机制以及新的抗HBV药物的筛选，需要建立一种能够稳定表达HBV耐药变异株细胞系。目前，已知耐核苷类药物HBV的基因变异主要集中于反转录区(RT区)，临床实践中最广泛的耐药病毒株为rtM204V即YVDD变异，其可导致HBV对于拉米夫定(LAM)的敏感性明显下降，低于对照野毒株越45倍左右；但是，通过细胞转染可发现，LAM诱导的rtM204V变异株复制效率大约比野毒株低100倍左右，表现为pgRNA、子代DNA包装、病毒颗粒释放减少以及聚合酶活性降低等方面。rtM204V的补偿变异rtL180M可能在一定程度上对YVDD变异株的复制有所补偿，但也明显低于野毒株的复制能力。由于耐核苷类药物HBV变异株的复制能力大幅下降，由HBV耐药变异株基因构建稳定表达HBV变异株细胞系的难度也明显增高。有研究尝试，在含核心启动子I. 3-1. 7倍体或外源性CMV启动子I. I倍体HBV真核表达载体直接诱变为耐药基因型转染H印G2细胞，构建HBV变异株细胞系；但总体结果显示，HBV-DNA合成、HBsAg与HBeAg等病毒蛋白以及病毒颗粒释放水平明显低于Ifep2. 2. 15细胞。至今未见有关适合的基于!fepG2稳定高表达HBV YVDD变异株细胞系的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种基于H印G2稳定高表达HBVYVDD变异株细胞系，具体涉及基于HepG2稳定高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株，尤其涉及高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株H印G2. HS204V及其制备方法。本发明的细胞株可用于筛选抗HBV药物、研究HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的HBV细胞模型。本发明的基于!fepG2稳定高表达HBV YVDD变异株细胞系，能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内有HBV复制，并可产生HBV颗粒；与目前广泛使用的Ifep2. 2. 15相比，本发明的细胞系表达HBsAg及HBeAg明显高于H印2. 2. 15，细胞上清HBV颗粒水平与H印2. 2. 15基本持平。本发明提供了一种高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株，该细胞对LAM不敏感而对ADV敏感；HBV胞内复制水平随LAM浓度上升无明显下降，而随ADV浓度上升逐步下降。本发明将HBV真核表达质粒PREP-HBV-YVDD转染H印G2细胞后，通过潮霉素筛选，然后检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生，并与Hep2. 2. 15细胞株相 比较，最终建成基于H印G2稳定高表达HBV YVDD变异株细胞系，获得高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株H印G2.HS204V，已于2011年5月13日保藏，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)Jia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号=CGMCC No. 4859，分类命名高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株(!fepG2· HS204V)。本发明中，所述的HBV真核表达质粒pREP-HBV-YVDD，来源于福建医科大学分子病
毒实验室；所述质粒的载体骨架为pREPIO载体,该载体的优势在于潮霉素Hygromycin抗性基因有利于细胞筛选工作及EBNA-I基因转录蛋白能够上调含OriP复制原点的真核表达质粒中基因转录和表达；所述的HBV复制子为含cp启动子及完整HBV前基因组的HBV1. 2倍体，并定点诱变为拉米夫定耐药基因型L180M+M204V后插入切除RSV启动子的pREPIO，构建成HBV真核表达质粒 pREP-HBV-YVDD。本发明的细胞株具有以下生物学特性能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内有HBV复制，并可产生HBV颗粒；其与目前广泛使用的H印2. 2. 15相比，该细胞系表达HBsAg及HBeAg明显高于Ifep2· 2. 15，细胞上清HBV颗粒水平与Ifep2· 2. 15基本持平。本发明提供了所述的细胞株的制备方法，包括以下步骤(I)质粒转染H印G2细胞①细胞培养!fepG2细胞以DMEM培养液培养；所述培养液来源于Gibco公司，培养液中含10%小牛血清，100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素，O. 03%谷氨酰胺；②细胞转染将处于生长对数期的细胞，以O. 25%胰酶消化，吸去胰酶后，用细胞培养液吹打成单个细胞悬液，计数；按5X IO5细胞/孔的浓度接种至6孔培养板，培养18-24小时后，待细胞约80-90%融合成片时，换新鲜无抗生素的培养液，准备转染；按照每孔转染2μ g的量，将50μ I OptiDMEM培养液与5μ I Lipofectamin2000转染试剂(Invitrogen)混合，同时将2 μ g质粒DNA稀释于50 μ I OptiDMEM培养液中，混匀后室温静置5分钟；将稀释的Lipofectamin2000与质粒DNA混和，室温静置20分钟；将混合物均匀滴加入6孔板中，6小时后用PBS清洗2遍后换新鲜培养液，继续培养；
(2)潮霉素筛选细胞克隆①转染后细胞培养24小时后扩大培养至IOcm培养皿，并设空白对照(未转染HepG2 细胞)；②待细胞贴壁后加入潮霉素浓度至300ug/ml ；③每3天换液一次；④约14-21天待空白对照细胞全部死亡后观察细胞克隆生长情况；⑤挑取细胞克隆至24孔培养板，以潮霉素浓度150ug/ml继续培养；
⑥待24孔培养板中细胞克隆密度至60-70%后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA 水平；⑦获取4株HBsAg、HBeAg及HBV-DNA阳性克隆，将阳性克隆传至6孔培养板以潮霉素浓度150ug/ml继续培养；(3)细胞克隆的有限稀释步骤(2)中获得的4株阳性克隆中的I株细胞克隆，HBsAg、HBeAg及HBV-DNA水平较高，经定量后上清HBsAg为200IU/ml左右，HBeAg水平200PeIU/ml左右，HBV-DNA水平维持于105-106COpieS/ml ;细胞传至10代左右，采用有限稀释法获取更纯净以及高水平表达蛋白细胞克隆；将处于生长对数期的细胞，以O. 25%胰酶消化，吸去胰酶后，用细胞培养液吹打成单个细胞悬液，计数后细胞密度稀释为IOcelΙ/ml，接种96孔培养板，每孔150ul培养基(含潮霉素浓度150ug/ml);显微镜下观察每孔细胞数，标记只接种Icell的培养孔，继续培养，每周换液一次；2_3周后待细胞密度约60%左右后传至24孔培养板继续培养；待24孔中细胞密度至60-70%后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，构建成HBV真核表达质粒pREP-HBV-YVDD ；(4)高表达HBV YVDD变异株的生物学特征及表型耐药分析①细胞上清HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平检测所述的HBsAg及HBeAg精确定量试剂盒采用Abbott公司Archipct HBsAg Reagentkit和Archipct HBeAg Reagent kit，HBV-DNA检测采用上海科华生物工程有限公司乙肝病毒核酸定量检测试剂盒，检测步骤按照试剂盒提供的说明书中记载的步骤，real-time PCR扩增仪采用ABI-7300，检测结果如图I所示；②细胞内病毒复制检测细胞总DNA抽提，6孔板中细胞90%汇合度时加入400ul细胞裂解液，37°C过夜，加入等量的的酚进行DNA抽提、沉淀后DNA溶解于20ul TE ; I. 3%凝胶电泳后20XSSC转膜，southern-blot杂交；结果显示HBV杂交信号提示胞内HBV复制；所述的细胞裂解液为lXSDS/Pronase buffer, 2mg/ml pronase、50mM Tris.HClPh7. 5、IOmM EDTAUOOmM NaCl、0. 2%SDS ；③HBV YVDD变异株细胞表型耐药分析IO5Cell/孔细胞密度接种12孔板，细胞贴壁后加入核苷类抗病毒药物，拉米夫定设 0、10uM、100uM、1000uM 4 个浓度梯度，阿德福韦设 0、0· luM、0. 3uM、luM、3uM、IOuM 6 个浓度梯度，每个浓度梯度设复孔，隔天换液，第10天检测细胞上清HBV-DNA水平，细胞抽提胞内总DNA检测胞内HBV复制情况。
检测分析所述的高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株H印G2. HS204V,结果表明，细胞上清HBV-DNA水平随LAM浓度梯度升高无明显下降，随ADV浓度梯度升高从IO5下降至检测水平以下，结果表明，所述细胞株对LAM不敏感而对ADV敏感(如图2所示)；杂交结果显示HBV胞内复制水平随LAM浓度上升无明显下降，而随ADV浓度上升逐步下降。本发明建立了一种能够稳定表达HBV耐药变异株细胞系，该细胞系表达HBsAg及HBeAg明显高于H印2. 2. 15，细胞上清HBV颗粒水平与H印2. 2. 15基本持平，可用于研究HBV耐药的分子生物学机制以及新的抗HBV药物的筛选。
图I 显示了 pREP-HBV (L180M+M204V) HBV 耐药变异细胞株上清 HBsAg、HBeAg 和HBV-DNA表达水平，HBsAg水平维持于150-250IU/ml之间，为H印2. 2. 15细胞15-25倍左右；HBeAg水平150-250S/C0之间，为H印2. 2. 15细胞10-20倍左右，HBV-DNA维持于IO5-IO6之
间，略高于ifep2. 2. 15细胞，并随传代次数增加无明显下降。图2显示了 pREP-HBV (L180M+M204V) HBV耐药变异细胞株耐药表型分析，细胞上清HBV-DNA水平随LAM浓度梯度升高无明显下降，随ADV浓度梯度升高从IO5下降至IO3之下，表明对LAM不敏感而对ADV敏感。图3为pREP-HBV (L180M+M204V)细胞上清HBV-DNA基因测序结果表明L180M+M204V,与转染质粒相同。图4为本发明中pREP-HBV (L180M+M204V)细胞株镜下细胞形态图，其中，左图为高倍镜下(20 X )形态图，右图为低倍镜下(10 X )形态图。图5为YVDD变异株(左图)与H印G2. 2. 15野生株(右图)LAM表型耐药分析图，其中，左图显示YVDD变异株随LAM浓度上升胞内HBV复制无明显下降，IC50>1000uM，表明对LAM耐药；右图显示H印G2. 2. 15胞内HBV复制随LAM浓度上升逐渐下降提示对LAM敏感。图6为VDD变异株ADV表型分析图，其中，胞内HBV复制随ADV浓度上升逐渐下降，显示对 ADV 敏感，IC50=1. 93uM。图7显示了 Southernblot表明细胞株随传代次数胞内HBV复制无明显下降。图8显示了 southern blot表明YVDD变异株细胞系胞内HBV复制高于H印G2. 2. 15。
具体实施例方式实施例I建立H印G2. HS204V细胞株将HBV真核表达质粒pREP-HBV-YVDD转染H印G2细胞后，通过潮霉素筛选，然后检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生，并与Hep2. 2. 15细胞株相比较，最终建成基于H印G2稳定高表达HBV YVDD变异株细胞系，获得高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株H印G2.HS204V，已于2011年5月13日保藏，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)Jia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号=CGMCC No. 4859，分类命名高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株。所述的细胞株的制备方法包括以下步骤
(I)质粒转染H印G2细胞①细胞培养!fepG2细胞以DMEM培养液培养；所述培养液来源于Gibco公司，培养液中含10%小牛血清，100U/ml青霉素，
100μ g/ml链霉素，O. 03%谷氨酰胺；②细胞转染将处于生长对数期的细胞，以O. 25%胰酶消化，吸去胰酶后，用细胞培养液吹打成单个细胞悬液，计数；按5X IO5细胞/孔的浓度接种至6孔培养板，培养18-24小时后，待细胞约80-90%融合成片时，换新鲜无抗生素的培养液，准备转染；按照每孔转染2μ g的量，将50μ I OptiDMEM培养液与5μ I Lipofectamin2000转染试剂(Invitrogen)混合，同时将2 μ g质粒DNA稀释于50 μ I OptiDMEM培养液中，混匀后室温静置5分钟；将稀释的Lipofectamin2000与质粒DNA混和，室温静置20分钟；将混合物均匀滴加入6孔板中，6小时后用PBS清洗2遍后换新鲜培养液，继续培养；
(2)潮霉素筛选细胞克隆①转染后细胞培养24小时后扩大培养至IOcm培养皿，并设空白对照(未转染HepG2 细胞)；②待细胞贴壁后加入潮霉素浓度至300ug/ml ；③每3天换液一次；④约14-21天待空白对照细胞全部死亡后观察细胞克隆生长情况；⑤挑取细胞克隆至24孔培养板，以潮霉素浓度150ug/ml继续培养；⑥待24孔培养板中细胞克隆密度至60-70%后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA 水平；⑦获取4株HBsAg、HBeAg及HBV-DNA阳性克隆，将阳性克隆传至6孔培养板以潮霉素浓度150ug/ml继续培养；(3)细胞克隆的有限稀释步骤(2)中获得的4株阳性克隆中的I株细胞克隆，HBsAg、HBeAg及HBV-DNA水平较高，经定量后上清HBsAg为200IU/ml左右，HBeAg水平200PeIU/ml左右，HBV-DNA水平维持于105-106COpieS/ml ;细胞传至10代左右，采用有限稀释法获取更纯净以及高水平表达蛋白细胞克隆；将处于生长对数期的细胞，以O. 25%胰酶消化，吸去胰酶后，用细胞培养液吹打成单个细胞悬液，计数后细胞密度稀释为IOcelΙ/ml，接种96孔培养板，每孔150ul培养基(含潮霉素浓度150ug/ml);显微镜下观察每孔细胞数，标记只接种Icell的培养孔，继续培养，每周换液一次；2_3周后待细胞密度约60%左右后传至24孔培养板继续培养；待24孔中细胞密度至60-70%后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，将HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA 水平定义为 pREP-HBV-YVDD ；(4)高表达HBV YVDD变异株的生物学特征及表型耐药分析①细胞上清HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平检测所述的HBsAg及HBeAg精确定量试剂盒采用Abbott公司Archipct HBsAg Reagentkit和Archipct HBeAg Reagent kit，HBV-DNA检测采用上海科华生物工程有限公司乙肝病毒核酸定量检测试剂盒，检测步骤按照试剂盒提供的说明书中记载的步骤，real-time PCR扩增仪采用ABI-7300 ；
②细胞内病毒复制检测细胞总DNA抽提，6孔板中细胞90%汇合度时加入400ul细胞裂解液，37°C过夜，加入等量的的酚进行DNA抽提、沉淀后DNA溶解于20ul TE ; I. 3%凝胶电泳后20XSSC转膜，southern-blot杂交；结果显示HBV杂交信号提示胞内HBV复制；所述的细胞裂解液为lXSDS/Pronase buffer, 2mg/ml pronase、50mM Tris.HClPh7. 5、IOmM EDTAUOOmM NaCl、0. 2%SDS ；③HBV YVDD变异株细胞表型耐药分析IO5Cell/孔细胞密度接种12孔板，细胞贴壁后加入核苷类抗病毒药物，拉米夫定设 0、10uM、100uM、1000uM 4 个浓度梯度，阿德福韦设 0、0· luM、0. 3uM、luM、3uM、IOuM 6 个浓度梯度，每个浓度梯度设复孔，隔天换液，第10天检测细胞上清HBV-DNA水平，细胞抽提胞内总DNA检测胞内HBV复制情况。
实施例2测试H印G2. HS204V细胞株如图I所示，pREP-HBV-YVDD HBV耐药变异细胞株上清HBsAg、HBeAg和HBV-DNA表达水平，HBsAg水平维持于150-300IU/ml之间，为!fep2· 2. 15细胞15-30倍左右；HBeAg水平150-250PeIU/ml之间，为H印2. 2. 15细胞10-20倍左右，HBV-DNA维持于IO5-IO6之间，略高于Hep2. 2. 15细胞，并随传代次数增加无明显下降。如图2所示，pREP-HBV-YVDD HBV耐药变异细胞株耐药表型分析的结果表明，细胞上清HBV-DNA水平随LAM浓度梯度升高无明显下降，随ADV浓度梯度升高从IO5下降至IO3之下，表明对LAM不敏感而对ADV敏感。如图3所示，pREP-HBV (L180M+M204V)细胞上清HBV-DNA基因测序结果表明L180M+M204V,与转染质粒相同。结果显示，所述的高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株H印G2. HS204V,细胞上清HBV-DNA水平随LAM浓度梯度升高无明显下降，随ADV浓度梯度升高从IO5下降至检测水平以下，表明对LAM不敏感而对ADV敏感；杂交结果显示HBV胞内复制水平随LAM浓度上升无明显下降，而随ADV浓度上升逐步下降。
权利要求
1.一种高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株，其特征在于，所述细胞株为高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株H印G2. HS204V,保藏编号CGMCC No. 4859，分类命名高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株；具有生物学特性能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内有HBV复制，并产生HBV颗粒；表达HBsAg及HBeAg高于H印2. 2. 15，细胞上清HBV颗粒水平与H印2. 2. 15基本持平。
2.按权利要求I所述的细胞株，其特征在于，该细胞对LAM不敏感而对ADV敏感；HBV胞内复制水平随LAM浓度上升无明显下降，随ADV浓度上升逐步下降。
3.权利要求I所述的细胞株的制备方法，其特征在于，将HBV真核表达质粒pREP-HBV-YVDD转染H印G2细胞后，通过潮霉素筛选，然后检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生，并与H印2. 2. 15细胞株相比较，最终建成基于H印G2稳定高表达HBV YVDD变异株细胞系，获得高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株H印G2. HS204V。
4.按权利要求3方法，其特征在于，所述的HBV真核表达质粒pREP-HBV-YVDD的载体骨架为pREPIO载体。
5.按权利要求3方法，其特征在于，所述的HBV真核表达质粒pREP-HBV-YVDDHBV通过含cp启动子及完整HBV前基因组的HBV1. 2倍体的复制子并定点诱变为拉米夫定耐药基因型L180M+M204V后插入切除RSV启动子的pREPIO，构建成HBV真核表达质粒pREP-HBV-YVDDo
6.权利要求I的高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株在筛选抗HBV药物中的用途。
全文摘要
本发明属微生物动物细胞系领域，涉及基于HepG2稳定高表达HBV YVDD变异株细胞系，具体涉及基于HepG2稳定高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株，尤其涉及高表达耐拉米夫定HBV病毒肝癌细胞株HepG2.HS204V及其制备方法。该细胞株能持续表达HBsAg及HBeAg且高于Hep2.2.15，胞内有HBV复制，并产生HBV颗粒，细胞上清HBV颗粒水平与Hep2.2.15基本持平，该细胞对LAM不敏感而对ADV敏感；HBV胞内复制水平随LAM浓度上升无明显下降，随ADV浓度上升逐步下降。本发明的细胞株可用于筛选抗HBV药物、研究HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的HBV细胞模型。
文档编号C12N15/85GK102807971SQ20121017502
公开日2012年12月5日 申请日期2012年5月31日 优先权日2011年6月9日
发明者张继明, 张轶俊 申请人:复旦大学附属华山医院