一种新型细胞因子融合蛋白ip10单链抗体的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型细胞因子融合蛋白——趋化因子干扰素诱导蛋白10单链抗体的制备方法，包括以下步骤：S1、合成人源性IP10胞外端基因；S2、利用重组噬菌体抗体系统构建抗表皮生长因子受体突变体III（EGFRvIII）的单链抗体；S3、对(Gly4Ser)3柔性接头进行优化合成；S4、将IP10和抗EGFRvIII单链抗体依次克隆于真核表达载体中，并通过优化的(Gly4Ser)3柔性接头连接，获得IP10-scFv基因；S5、将该基因在大肠杆菌中高效表达，获得生物学活性的IP10-scFv。本发明的IP10-scFv具有更高的抗原-抗体结合率，临床上可以减少IP10用量，降低其毒副作用，进而还可以减少胶质瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）过继输入的数量和提高CTL活性。
【专利说明】一种新型细胞因子融合蛋白IP10单链抗体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学领域，具体涉及一种新型细胞因子融合蛋白一趋化因子干扰素诱导蛋白10 (IPlO)单链抗体的制备方法，及其体内活性检测方法。
【背景技术】
[0002]尽管有手术、放疗和化疗等综合治疗手段，在过去20多年，恶性脑胶质瘤特别是多形胶质母细胞瘤的预后并无明显改善，免疫治疗通过激发和补充机体的抗肿瘤免疫能力来杀灭肿瘤细胞，具有特异性强、毒副反应轻和长期记忆等特点，对于靶向清除侵润的残余肿瘤细胞是一种较理想的辅助治疗策略。过去认为中枢神经系统是免疫豁免区，免疫治疗难以奏效，但近年来越来越多的证据提示中枢神经系统并非免疫豁免区，有研究证实被激活的淋巴细胞可以穿过血脑屏障(Sehgal A, Berger MS.Basic concepts of immunologyand neuroimmunology.Neurosurg Focus.2000, 9(6): 1-6)。这使针对胶质瘤的免疫辅助治疗成为可能。随着胶质瘤特异性抗原被相继发现和鉴定，胶质瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)过继疗法成为最令人瞩目的生物治疗研究领域之一。多年来对脑胶质瘤免疫治疗的研究发现动物实验和临床疗效欠佳，其主要原因为靶向募集到脑胶质瘤细胞部位的胶质瘤特异性CTL的细胞数量有限。
[0003]IPlO属于CXC类的趋化因子，不但具有抗肿瘤血管作用，而且可以定向募集T淋巴细胞并促进淋巴细胞活化和增殖，引起肿瘤内淋巴细胞浸润，显示出强大的抗肿瘤潜力。近年来有 研究表明过继肿瘤抗原特异性CTL能够介导有效的抗神经系统肿瘤免疫效应，其中趋化因子IPlO发挥了关键作用(Nishimura F，Dusak JE, Eguchi J, etal.Adoptive Transfer of Type I CTL Mediates Effective Ant1-Central NervousSystem Tumor Response: Critical Roles of IFN-1nducible Protein-10.CancerRes.2006, 66:4478-4487)。经典的树突状细胞(DC)与肿瘤裂解产物混合培养制备CTL在体内由于肿瘤免疫逃逸机制以及肿瘤免疫原性低等原因，其杀伤作用受到较大限制(RiddellSR.Engineering antitumor immunity by T-cell adoptive immunotherapy.HematologyAm Soc Hematol Educ Program.2007，2007:250-256)。因此，借助 IPlO 的趋化作用，CTL 即可从注射部位靶向富集到肿瘤周围特别是浸润的肿瘤细胞周围。
[0004]IPlO靶向募集足够数量胶质瘤特异性CTL到胶质瘤细胞部位的前提是胶质瘤细胞部位(而非IPlO肿瘤注射部位)要有足够浓度的IP10。目前主要通过转基因技术或者直接肿瘤局部多点注射等方法使肿瘤富集IP10，前者存在靶向性问题，后者仅能提高注射部位的浓度，而不能选择性提高肿瘤细胞部位特别是浸润于脑组织的肿瘤细胞部位的IPlO浓度，不适合用于辅助治疗这种具有侵袭性生长特性的胶质瘤。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术不能有效在肿瘤细胞部位富集IPio的问题，提供一种针对脑胶质瘤的新型特异性细胞因子融合蛋白一一IPlO单链抗体(IPlO-scFv)，其不仅可以特异性靶向结合脑胶质瘤细胞，而且可以激活体内的淋巴细胞定向募集到胶质瘤细胞周围，参与歼灭肿瘤细胞，对临床上胶质瘤的治疗和预防其复发起到根本作用。
[0006]本发明第一方面提供了一种新型细胞因子融合蛋白IPlO单链抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤:
[0007]S1、根据基因库合成人源性IPlO胞外端编码基因；
[0008]S2、利用重组噬菌体抗体系统构建抗表皮生长因子受体突变体III的单链抗体，并测定其基因序列；
[0009]S3、对(Gly4Ser) 3柔性接头进行胸腺嘧啶_腺嘌呤序列替换部分鸟嘌呤_胞嘧啶序列的优化合成，并克隆于真核表达载体中；
[0010]S4、将所述IPlO胞外端编码基因和抗表皮生长因子受体突变体III的单链抗体基因依次克隆于所述真核表达载体中，并通过所述优化合成的(Gly4Ser)3柔性接头相连接，获得IPlO单链抗体的编码基 因；
[0011]S5、将所述IPlO单链抗体的编码基因在大肠杆菌中表达，获得IPlO单链抗体。
[0012]在根据本发明第一方面所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv制备方法中，所述步骤S I包括:
[0013]S1-1、根据基因库查找到人源性IPlO的基因序列，通过人工基因合成的方式，合成IPlO的胞外端编码基因；
[0014]S1-2、将步骤Sl-1获得的人源性IPlO胞外端编码基因克隆入T载体。
[0015]在根据本发明第一方面所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv制备方法中，所述步骤S2包括:
[0016]S2-1、取表皮生长因子受体突变体III免疫小鼠脾淋巴细胞，应用RT-PCR方法分别扩增小鼠抗体重链可变区和轻链可变区基因，用重叠延伸连接法将编码(Gly4Ser)3柔性接头的接头序列连接所述重链可变区和轻链可变区基因，并克隆入噬粒载体PCANTAB5E，得到重组噬粒；
[0017]S2-2、以所述重组噬粒转化大肠杆菌TGl细胞，与辅助噬菌体M13K07体内重组，构建噬菌体单链抗体库；
[0018]S2-3、用表皮生长因子受体突变体III抗原在所述噬菌体单链抗体库中筛选出高结合力的阳性重组噬菌体，并对所筛选阳性重组噬菌体的单链抗体基因片段进行克隆和序列测定，获得抗表皮生长因子受体突变体III的单链抗体基因序列。
[0019]在根据本发明第一方面所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv制备方法中，所述步骤S3包括:
[0020]S3-1、合成扣17436103柔性接头的肽段，用胸腺嘧啶-腺嘌呤序列替换部分重复率较高的鸟嘌呤-胞嘧啶序列；
[0021]S3-2、在肽段的3’端加入多聚组氨酸标签序列及限制性内切酶Xhol I和EcoR I位点；
[0022]S3-3、进行PCR反应，参数为:以94° C预变性3-5分钟、94° C变性30-60秒、50-58° C退火I分钟、70-73° C延伸I分钟为一次循环，进行30-34个循环，70-72° C延伸5-10分钟；[0023]S3-4、PCR产物经Xhol I/EcoR I双酶切后，回收并克隆入重组质粒pcDNA3中。
[0024]在根据本发明第一方面所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv制备方法中，所述步骤S4中所述真核表达载体为所述步骤S3-4克隆后的重组质粒pcDNA3。
[0025]在根据本发明第一方面所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv制备方法中，所述步骤S5包括:将所述IPlO单链抗体的编码基因亚克隆于pET28a载体质粒，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，进一步通过体外蛋白复性获得生物学活性的IPlO单链抗体。
[0026]在根据本发明第一方面所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv制备方法中，步骤S2-3所述高结合力的判定依据为:用表皮生长因子受体突变体III的抗原肽包被酶联免疫吸附实验的酶标板，同时加入辣根过氧化物酶标记的抗M13噬菌体抗体37° C孵育后，以表皮生长因子受体突变体III单克隆抗体和磷酸缓冲液作为阳性和阴性对照，加入显色液后，酶标仪测定405nm波长处吸光值，比阴性对照组值高2倍判断为高结合力。
[0027]本发明第二方面提供了一种新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv，该IPlO单链抗体是通过如上所述的IPlO单链抗体的制备方法制得。
[0028]在根据本发明第二方面所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv中，所述IPlO单链抗体具有与表皮生长因子受体突变体III阳性的胶质瘤细胞特异性结合的位点。
[0029]本发明第三方面提供了一种新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv对淋巴细胞趋化作用的体内检测方法，该体内检测方法包括以下步骤:
[0030]Al、将稳定表达表皮生长因子受体突变体III的胶质瘤细胞进行细胞膜红色荧光探针染色，将胶质瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞进行羧基荧光素乙酰乙酸染色；
[0031]A2、将染色的稳定表达`表皮生长因子受体突变体III的U87胶质瘤细胞皮下随机接种裸鼠，7天成瘤后，尾静脉过继染色的胶质瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞，同时在肿瘤中心注射IPlO单链抗体，采用双荧光活体成像法观察肿瘤部位富集胶质瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的数量，同时评估胶质瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞在肿瘤中心聚集的时间。
[0032]实施本发明具有以下有益效果:
[0033]1、本发明通过新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv让胶质瘤细胞靶向获得高浓度IP10，利用IPlO对T细胞的定向趋化和促进淋巴细胞增殖活化作用，实现将过继的CTL细胞靶向富集至肿瘤细胞，并增强它们对肿瘤细胞靶向杀伤活性。该策略将大大提高CTL攻击肿瘤细胞的靶向性和有效性。这种利用抗体融合蛋白IPlO-scFv使CTL获得双重靶向性——CTL自身靶向性和IPlO靶向富集CTL的方法因不依赖肿瘤抗原呈递过程，能够打破限制单纯CTL过继治疗策略的免疫逃逸机制。目前尚未见利用IPlO-scFv富集CTL靶向治疗胶质瘤的报道。
[0034]2、本发明在制备过程中对连接IPlO编码基因和抗EGFRvIII单链抗体基因的(Gly4Ser)3柔性接头进行了优化处理，用TA序列部分替换了该(Gly4Ser) 3中重复率较高的GC序列，从而更好地维持了蛋白质的天然构象和折叠。
[0035]3、本发明提供的新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv靶向富集IPlO的方法可以减少IPlO用量，降低其毒副作用，进而还可以减少胶质瘤特异性CTL过继输入的数量和提高CTL活性。
[0036]4、本发明提供了新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv对淋巴细胞趋化作用的体内检测方法，实现了对该新型细胞因子融合蛋白的实时在体评价。【专利附图】
【附图说明】
[0037]下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中:
[0038]图1所示为本发明新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv的制备方法框图；
[0039]图2所示为本发明新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv的制备流程图；
[0040]图3所示为本发明构建IPlO-scFv的重组质粒pcDNA3的结构示意图；
[0041]图4所示为银染法检测本发明新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv的纯度；
[0042]图5A-?所示为激光共聚焦和流式细胞术检测现有技术的IPlO-scFv结合U87-EGFRvIII 的能力；
[0043]图6A-6D所示为激光共聚焦和流式细胞术检测本发明的IPlO-scFv结合U87-EGFRvIII 的能力；
[0044]图7A-7E所示为本发明新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv体外趋化实验检测结果;
[0045]图8A-8H所示为本发明新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv体内趋化实验检测结
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【具体实施方式】
[0046]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
[0047]通过对脑胶质瘤抗原的深入了解后人们发现:表皮生长因子受体突变体III(EGFRvIII)是高表达于大多数恶性胶质瘤细胞膜上的膜抗原，其高表达具有促进肿瘤细胞增殖、侵袭和浸润等作用，并且与神经元、胶质细胞和血管内皮细胞等无交叉反应，其特异性较高(Sampson JH, Archer GE, Mitchell DA, Heimberger AB, Bigner DD.Tumor-specificimmunotherapy targeting the EGFRvIII mutation in patients with malignantglioma.Semin Immunol.2008，20:267-75)。
[0048]单链抗体(scFv)是一条利用连接肽把重链可变区和轻链可变区连接起来的小分子肽，保持着天然抗体的特异性和大致相似的亲和力，并且可以用基因工程的方法构建与其他效应分子连接的抗肿瘤融合蛋白。
[0049]因此，可以通过噬菌体抗体库技术筛选到特异性较高的抗EGFRvIII单链抗体，进而利用基因工程技术制备抗EGFRvIII的IPlO单链抗体(IPlO-scFv)，该融合蛋白具有IPlO和抗EGFRvIII抗体的双重功能，在肿瘤局部可以通过抗EGFRvIII的作用与EGFRvIII阳性的胶质瘤细胞特异性结合，从而实现在胶质瘤细胞部位靶向富集高浓度IPlO的目的。IPio将过继的CTL细胞富集至肿瘤细胞，并激活它们对靶细胞的杀伤活性，形成许多个以EGFRvIII阳性细胞为中心的CTL歼灭胶质瘤的主战场，从而最终彻底消灭胶质瘤。
[0050]进一步地，现有技术的IPlO-scFv制备方法中，连接IPlO编码基因和抗EGFRvIII单链抗体基因的(G1 y4Ser) 3柔性接头中有重复率较高的GC序列，影响蛋白质的生物构象。如果用TA序列对部分GC序列进行替换，将有望更好地维持蛋白质的天然构象和折叠，提高其生物学活性。
[0051]上述方法利用了 IPlO-scFv对T细胞的定向趋化和活化增殖的作用，因其不依赖肿瘤抗原呈递过程，有助于打破肿瘤局部免疫逃逸，实现过继的CTL双重靶向肿瘤细胞一CTL自身靶向性和IPlO靶向富集CTL，并增强CTL识别和杀伤肿瘤细胞能力，因而大大提高CTL攻击肿瘤细胞的靶向性和有效性。此外通过构建IPlO-scFv还可以减少IPlO用量，降低IPlO的毒副作用，进而降低CTL的用量。这些特点为将来的胶质瘤免疫过继治疗由实验向临床应用迈出一大步，具有重要的理论意义和较大的应用前景。
[0052]图1所示为本发明新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv的制备方法框图，图2所示为本发明新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv的制备流程图。请结合参阅图1和图2，该新型细胞因子融合蛋白IPlO-scFv的制备包括以下步骤:
[0053]S1、根据基因库机器合成人源性IPlO胞外端编码基因；
[0054]S2、利用重组噬菌体抗体系统构建抗EGFRvIII单链抗体，并测定其基因序列；
[0055]S3、对(Gly4Ser) 3柔性接头进行TA序列替换部分GC序列的优化合成，并克隆于真核表达载体中；
[0056]S4、将所述IPlO编码基因和抗EGFRvIII单链抗体基因依次克隆于所述真核表达载体中，并通过所述优化合成的(Gly4Ser)3柔性接头相连接，获得IPlO-scFv的编码基因；
[0057]S5、将所述IPlO-scFv的编码基因在大肠杆菌中表达，获得IPlO-scFv。
[0058]其中，所述步骤SI包括:`[0059]S1-1、根据基因库(Gene Bank ACCESS10N:NM_001565)信息，查找到人源性 IPlO 的基因序列，利用多肽合成仪机器合成人源性IPlO胞外端编码基因；
[0060]S1-2、将步骤Sl-1获得的人源性IPlO胞外端编码基因克隆入T载体。
[0061]所述步骤S2包括:
[0062]S2-1、取EGFRvIII免疫小鼠脾淋巴细胞，应用RT-PCR方法分别扩增小鼠抗体重链可变区和轻链可变区基因，用重叠延伸连接法将编码(Gly4Ser)3柔性接头的接头序列连接所述重链可变区和轻链可变区基因，并克隆入噬粒载体PCANTAB5E，得到重组噬粒；
[0063]S2-2、以所述重组噬粒转化大肠杆菌TGl细胞，与辅助噬菌体M13K07体内重组，构建噬菌体单链抗体库；
[0064]S2-3、用EGFRvIII抗原在所述噬菌体单链抗体库中筛选出高结合力的阳性重组噬菌体，并对所筛选阳性重组噬菌体的单链抗体基因片段进行克隆和序列测定，获得EGFRvIII单链抗体的基因序列。
[0065]所述步骤S3包括:
[0066]S3-1、机器合成(Gly4Ser) 3柔性接头的肽段，用TA序列替换部分重复率较高的GC序列，
[0067]S3-2、在3’端加入多聚组氨酸标签(His-tag)序列及限制性内切酶Xhol I和EcoRI位点；
[0068]S3-3、进行PCR反应，参数为:以94° C预变性3-5分钟、94° C变性30-60秒、50-58° C退火I分钟、70-73° C延伸I分钟为一次循环，进行30-34个循环，70-72° C延伸5-10分钟；
[0069]S3-4、PCR产物经Xhol I/EcoR I双酶切后，回收并克隆入重组质粒pcDNA3中。
[0070]所述步骤S4中，所述真核表达载体为所述步骤S3-4克隆后的重组质粒pcDNA3。
[0071]所述步骤S5包括:将所述IPlO-scFv的编码基因亚克隆于pET28a载体质粒，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，进一步通过体外蛋白复性获得生物学活性的IPlO-scFv。
[0072]其中，步骤Sl-1所述机器合成人源性IPlO胞外端基因编码序列的具体步骤包括:
[0073]1、根据基因库(Gene BankACCESS I ON: NM-OO1565)查找到人源性 IPlO 胞外段基因编石马序列:tgaa tcaaactgccattctgattt gctgccttat ctttctgact ctaagtggcattcaag gagt acctctctctagaactgtac gctgtacctg catcagcatt agtaatcaacctgttaatcc aaggtcttt agaa aaacttg aaattattcc tgcaagccaa ttttgtccacgtgttgagat cattgctacaatgaaaaaga agggtgagaa gagatg tctg aatccagaat cgaaggccatcaagaatttactgaaagcag ttagcaagga aaggtctaaa ag，利用多肽合成仪进行机器合成；
[0074]2、将合成后的IPlO目的基因置于分光光度计上检测纯度和浓度，吸光值A260ZA280在1.8-2.0之间表示纯度较好。
[0075]步骤S1-2为选用pGM-T连接试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，货号VT202-02)将前述步骤1-1中纯化回收的目的基因片段IPlO连接到pGM_T载体上，具体步骤包括:
[0076]1、将载体在冰上融合，短暂离心(5-10s，2000-10000rpm)装有载体的离心管，以免
液体挂在管壁上；
[0077]2、根据凝胶电泳 分光光度计检测片段的分子量大小计算与载体的摩尔比，使载体与片段的摩尔比控制在1: 3-1: 8，加入过多的片段会干扰连接；
[0078]3、按照表I所示配制反应体系和对照体系，并加入离心管中；
[0079]表1:克隆IPlO的反应体系和对照体系
【权利要求】
1.一种新型细胞因子融合蛋白IPlO单链抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤: 51、根据基因库合成人源性IPlO胞外端编码基因； 52、利用重组噬菌体抗体系统构建抗表皮生长因子受体突变体III的单链抗体，并测定其基因序列； 53、对(Gly4Ser)3柔性接头进行胸腺嘧啶-腺嘌呤序列替换部分鸟嘌呤-胞嘧啶序列的优化合成，并克隆于真核表达载体中； 54、将所述IPlO胞外端编码基因和抗表皮生长因子受体突变体III的单链抗体基因依次克隆于所述真核表达载体中，并通过所述优化合成的(Gly4Ser)3柔性接头相连接，获得IPio单链抗体的编码基因； 55、将所述IPlO单链抗体的编码基因在大肠杆菌中表达，获得IPlO单链抗体。
2.根据权利要求1所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤SI包括: S1-1、根据基因库查找到人源性IPlO的基因序列，通过人工基因合成的方式，合成IPlO的胞外端编码基因； 51-2、将步骤Sl-1获得的人源性IPlO胞外端编码基因克隆入T载体。
3.根据权利要求2所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO单链抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S2包括:` 52-1、取表皮生长因子受体突变体III免疫小鼠脾淋巴细胞，应用RT-PCR方法分别扩增小鼠抗体重链可变区和轻链可变区基因，用重叠延伸连接法将编码(Gly4Ser)3柔性接头的接头序列连接所述重链可变区和轻链可变区基因，并克隆入噬粒载体PCANTAB5E，得到重组嗤粒； S2-2、以所述重组噬粒转化大肠杆菌TGl细胞，与辅助噬菌体M13K07体内重组，构建噬菌体单链抗体库； 52-3、用表皮生长因子受体突变体III抗原在所述噬菌体单链抗体库中筛选出高结合力的阳性重组噬菌体，并对所筛选阳性重组噬菌体的单链抗体基因片段进行克隆和序列测定，获得抗表皮生长因子受体突变体III的单链抗体基因序列。
4.根据权利要求3所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO单链抗体制备方法，其特征在于，所述步骤S3包括: 53-1、合成(Gly4Ser)3柔性接头的肽段，用胸腺嘧啶-腺嘌呤序列替换部分重复率较高的鸟嘌呤-胞嘧啶序列； S3-2、在肽段的3’端加入多聚组氨酸标签序列及限制性内切酶Xhol I和EcoR I位占.S3-3、进行PCR反应，参数为:以94° C预变性3-5分钟、94° C变性30-60秒、50-58° C退火I分钟、70-73° C延伸I分钟为一次循环，进行30-34个循环，70-72° C延伸5_10分钟； S3-4、PCR产物经Xhol I/EcoR I双酶切后，回收并克隆入重组质粒pcDNA3中。
5.根据权利要求4所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO单链抗体制备方法，其特征在于，所述步骤S4中所述真核表达载体为所述步骤S3-4克隆后的重组质粒pcDNA3。
6.根据权利要求5所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO单链抗体制备方法，其特征在于，所述步骤S5包括:将所述IPlO单链抗体的编码基因亚克隆于pET28a载体质粒，并在大肠杆菌中表达，进一步通过体外蛋白复性获得生物学活性的IPlO单链抗体。
7.根据权利要求3所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤S2-3所述高结合力的判定依据为:用表皮生长因子受体突变体III的抗原肽包被酶联免疫吸附实验的酶标板，同时加入辣根过氧化物酶标记的抗M13噬菌体抗体37° C孵育后，以表皮生长因子受体突变体III单克隆抗体和磷酸缓冲液作为阳性和阴性对照，加入显色液后，酶标仪测定405nm波长处吸光值，比阴性对照组值高2倍判断为高结合力。
8.一种新型细胞因子融合蛋白IPlO单链抗体，其特征在于，所述IPlO单链抗体是通过权利要求1-7中任意一项所述的IPlO单链抗体的制备方法制得。
9.根据权利要求8所述的新型细胞因子融合蛋白IPlO单链抗体，其特征在于，所述IPlO单链抗体具有与表皮生长因子受体突变体III阳性的胶质瘤细胞特异性结合的位点。
10.一种新型细胞因子融合蛋白IPlO单链抗体对淋巴细胞趋化作用的体内检测方法，其特征在于，所述体内检测方法包括以下步骤: Al、将稳定表 达表皮生长因子受体突变体III的胶质瘤细胞进行细胞膜红色荧光探针染色，将胶质瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞进行羧基荧光素乙酰乙酸染色； A2、将染色的稳定表达表皮生长因子受体突变体III的U87胶质瘤细胞皮下随机接种裸鼠，7天成瘤后，尾静脉过继染色的胶质瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞，同时在肿瘤中心注射IPlO单链抗体，采用双荧光活体成像法观察肿瘤部位富集胶质瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的数量，同时评估胶质瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞在肿瘤中心聚集的时间。
【文档编号】C12N15/70GK103451218SQ201210168346
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年5月28日 优先权日:2012年5月28日
【发明者】卢小玲, 赵永祥, 王旋, 姜晓兵 申请人:卢小玲, 赵永祥