专利名称：一种利用亚麻刺盘孢霉羟化去氢表雄酮的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及ー种高效利用亚麻刺盘孢霉iColletotrichum lini) ST-I羟化去氢表雄酮(DHEA)为7a-羟基-去氢表雄酮(7 a -0H-DHEA)和 7，15 a -羟基-去氢表雄酮(7，15 a -0H-DHEA)的方法。
背景技术：
7a-羟基-去氢表雄酮(7 a -0H-DHEA)和7，15 a -羟基-去氢表雄酮(7，15 a -0H-DHEA)是生物体内重要的活性物质，对代谢具有重要的调节作 用。目前，有研究表明7 a -OH-DHEA可阻止体外神经元的缺氧细胞死亡，而且具有抗氧化作用和抗肿瘤作用。7，15 a -轻基-去氢表雄酮(7，15 a-0H-DHEA),是一种重要的甾体药物中间体,可用于合成多种留体激素类药物，如合成“第四代” ロ服避孕药的主成分屈罗酮。由于上述两种羟基甾体化合物都具有重要药理作用和药用价值，其市场前景相当可观，成为当前留体药物领域研究的一大热点。自 1952 年,Upjohn 公司的 Murray 和 Peterson 应用 Rhizopus nigricans 成功把
11a-OH引入孕甾酮的C11，解决了可的松生产的大难题，从此微生物甾体转化技术引起了人们的高度重视。近年来，国内外研究者开始利用生物转化法在DHEA的C7位导入羟基，但关于DHEA双羟化的研究相对较少。留体微生物转化过程中，底物的水溶性低、生物相容性差是限制转化速率的关键因素，直接成为微生物转化留体化合物エ业生产中的瓶颈。针对这ー现状，许多研究者开始改善底物的投料方式，如超声波细化、有机溶剂助溶及双水相催化等，但由于有机溶剂通常对微生物具有一定的毒性，会对酶活性造成一定程度的抑制作用，故对转化率的提高幅度不大。因此，采用一种高效的底物投料方式具有非常重要的意义，而目前关于甲基-P-环糊精(M-P -⑶)用于亚麻刺盘孢霉Iini )轻化DHEA的研究未见报道，其显著提高底物的水溶性和转化率更是エ业生产的一大优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效利用亚麻刺盘孢霉iColletotrichum lini)ST-I羟化去氢表雄酮的方法，通过添加适量的甲基-P -环糊精(M- P -⑶)，达到高底物投料浓度、高底物高转化率、高产物得率的要求。该菌种于2012年4月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 6051,分类命名为亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini)。应用上述方法转化DHEA生产7 a -OH-DHEA和7，15 a -OH-DHEA的方法，其步骤如下
(I)制备DHEA/M- P -CD的包合物称取摩尔比为I: I的DHEA、M- ^ -CD溶于适量水中，30°C下搅拌24 h后通过0. 45 um的膜，滤液冷冻干燥即得DHEA/M- ^ -⑶的包合物。(2)采用保藏号为 CGMCC No. 4903 的亚麻刺盘孢霉(CbBetotricAtt lini ) ST-I为生产菌种，25-40°C，120-220 r/min条件下活化培养得到种子液，然后将种子液稀释涂布至Ij PDA平板上。
(3)制备Clini ST-I菌株的细胞液体培养物挑取步骤(I)的PDA固体培养基上的亚麻刺盘孢霉(CbBetotricAlini)ST-1菌株一环,接种于已灭菌的装有20-50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，培养温度为25-40°C，置摇床上以120-220 r/min的转速培养12-16 h至对数生长中期，即得到C. lini ST-I菌株的细胞液体培养物。
(4)发酵培养将步骤(2)中制备好的细胞液体培养物以8-10%(v/v)的接种量接入发酵培养基，装液量为250 mL锥形瓶中装20-50 mL发酵培养基，培养温度为25_40°C，在120-220 r/min的转速下培养20-24 h，得发酵液。(5)生物转化称取适量步骤(I)中所述的DHEA/M-0 -⑶的包合物，投入步骤(3)中的菌体发酵液，使其终浓度为18-20 g/L，在转化温度28°C，200-220 r/min的转速下转化48-60 h，即得转化液。(6)产物检测将步骤(4)的转化液在8000-12000 r/min下离心5_10 min，上清 用等体积こ酸こ酯抽提3次，菌体用适量氯仿抽提3次，合并抽提液后于旋转蒸发仪中旋至有晶体出现，こ腈复溶晶体并通过0. 22 um的有机膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析 DHEA、7 a -OH-DHEA 和 7，15 a -OH-DHEA 的含量。其中步骤(2)中所述的PDA培养基的成分及配比为土豆200-500 g/L ;葡萄糖20-50 g/L;酵母粉2-10 g/L;琼脂粉10-20 g/L ;pH自然，在121°C高压蒸汽下灭菌20min ;步骤(2)所述种子培养基的成分及配比为花生饼粉5-15 g/L，葡萄糖20-50 g/L ；KC1 0. 1-1 g/L ;酵母粉 10-30g/L ；K2HPO4 0. 1-1. 0 g/L ；MgS047H20 0. 01-0. I g/L ；FeS047 H2O
0.01-0. I g/L g/L;灭菌前调培养基的pH至6.5-7.5，在121で高压蒸汽下灭菌20!^11;
步骤(4)所述发酵培养基的成分及配比为葡萄糖10-100 g/L ;酵母粉5-50g/L ;蛋白胨 5-50 g/L ；NaCl 0. 2-2 g/L ；K2HP04 0. 1-1. 0 g/L ；KH2PO4O. 1-1. 0 g/L ；MgS04 0 . 01-0. I g/L ；FeS047 H2O 0. 01-0. 10 g/L ；pH 6. 5-7. 5，121 °C高压蒸汽下灭菌 20 min。本发明所述的利用亚麻刺盘孢霉(CbBetotricA仰？ lini)ST_1轻化去氢表雄酮的方法，是首次提出先将底物DHEA和适量的M- ^ -⑶进行预包合处理后再投料的转化方式，最终达到高底物投料浓度、高底物转化率、高产物得率的目的，此方法对微生物转化留体类化合物具有重要的意义。
图I DHEA/M- ^ -⑶包合物相平衡曲线。图2为本发明的亚麻刺盘孢霉(CbBetotricAwffiST-I在发酵培养基中转化DHEA/M- ^ -CD包合物的过程研究。
具体实施例方式实施例I冻干法制备包合物DHEA/M- ^ -⑶。
(I)相平衡曲线确定包合比。
称取适量的M-P-CD，250 mL三角瓶中装30mL去离子水配置成浓度为10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM的浓度梯度，分别加入过量的底物DHEA后置于20_40°C，120-200r/min的摇床上振荡24 h至包合平衡。包合液1000 r离心3 min除去未包合的底物,上清经适当倍数稀释后用0.22 Pm的水膜过滤除杂，再利用高效液相色谱法检测底物浓度。以M- ^ -⑶浓度为横坐标，DHEA浓度为纵坐标绘制相平衡曲线，确定DHEA与M- P -⑶的包合比。(2)冻干法制备DHEA/M-^ -⑶的包合物。
称取摩尔比为1:1的DHEA、M-P-⑶溶于适量水中，20-40°C下搅拌24 h至包合过程平衡后用0. 45 um的水膜过滤除杂，滤液冷冻干燥后即得DHEA/M- ^ -⑶的包合物。
实施例2利用亚麻刺盘孢霉lini) ST-I羟化DHEA/M-0 -CD的包合物。
(I)制备亚麻刺盘孢霉lini) ST-I菌株的细胞液体培养物 挑取固体PDA培养基上的亚麻刺盘孢霉{Colletotrichum lini) ST-I菌株一环,接种在装有30 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，在30°C下，置于摇床上以200 r/min的转速培养20-24 h至对数期，即制得亚麻刺盘孢霉菌株的细胞液体培养物。(3)发酵培养基的成分及配比为葡萄糖20-50 g/L ;酵母粉10_30g/L ;蛋白胨5-20 g/L ;玉米浆 3-10 g/L ；NaCl 0. 2-2 g/L ；K2HPO4 0. 1-1. 0 g/L ；MgS04 0. 1-1 g/L ；FeS047 H2O 0. 01-0. 10 g/L ；pH 6. 5-7. 5，121 °C高压蒸汽下灭菌 20 min。(4)摇瓶发酵将上述亚麻刺盘孢霉(CbBetotricAwffi lini) ST-I菌株的细胞液体培养物以8-10% (w/w)的接种量接种在装有已灭菌的装有30 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，在20-40°C条件下，置于摇床上以120-200 r/min的转速培养，发酵20-24 h，菌体进入对数生长期。(5)生物转化精确称取适量DHEA/M-P-⑶包合物，投入步骤(3)中的菌体发酵液，使DHEA终浓度为20 g/L，在转化温度28°C，200-220 r/min的转速下转化48-60 h。
权利要求
1.一种新型利用亚麻刺盘孢霉Iini ) ST-I轻化去氢表雄酮(DHEA)的方法，其特征为250 mL三角瓶装20-40 mL的发酵培养基，接种量为8-10% (w/w)，培养温度25-40°C，摇床转速180-220 r/min,培养20-24 h后投入适量DHEA/甲基-β -环糊精(Μ- β -⑶)的包合物，继续转化48-60 h。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所用发酵培养基组成如下葡萄糖10-100g/L ;酵母粉 5-50g/L ;蛋白胨 5-50 g/L ；NaCl O. 2-2 g/L ；K2HPO4 O. 1-1. O g/L ；KH2PO40.1-1. 0 g/L ；MgSO4 0. 01-0. I g/L ;FeS04.7 H2O 0. 01-0. 10 g/L ；pH 6. 5-7. 5，121 °C高压蒸汽下灭菌20 mirio
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述DHEA/甲基-β-环糊精(Μ- β -⑶)的包合物的制备方法如下DHEA与Μ-β-⑶以摩尔比I: I溶于适量水中，30°C下搅拌24 h后通过O. 45 μ m的膜,滤液冷冻干燥。
全文摘要
本发明涉及一种利用亚麻刺盘孢霉(Colletotrichumlini)ST-1羟化去氢表雄酮(DHEA)的方法，其特征在于，转化过程中采用了先将DHEA与等摩尔比的甲基-β-环糊精预包合后再投料的方式，从而显著提高DHEA的水溶性和转化效率。在底物投料量为10g/L的条件下，转化率高达95%，产物7α-OH-去氢表雄酮和7,15α-OH-去氢表雄酮的总得率为80.94%。
文档编号C12R1/645GK102703558SQ20121016740
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月28日 优先权日2012年5月28日
发明者史劲松, 吴燕, 朱晓宏, 李会, 李恒, 许正宏 申请人:江南大学