专利名称：用于鉴定坛紫菜耐高温型品系的分子标记及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种坛紫菜，尤其是涉及一种用于鉴定坛紫菜耐高温型品系的分子标记及其构建方法。
背景技术：
坛紫菜(Porphyra haitanensis)是我国特有的暖温带性品种，是福建、浙江和广 东沿海人工养殖的重要经济红藻，其产量约占全国紫菜总产量的80%。坛紫菜的自然生长期在每年的9月至次年的3月，生长的适宜温度为15 26°C。近年来，全球气候变暖，白露节气过后的持续高温和福建、浙江海域9月下旬至10月的持续高温回暖天气严重影响了坛紫菜壳孢子的采苗和幼苗的附着生长，水温过高致使坛紫菜幼苗烂苗或成菜烂菜、减产，造成了不可弥补的损失，严重威胁着坛紫菜养殖业的持续发展。因此，在生产上开展坛紫菜的遗传育种研究，选育出具有明显耐高温性状的优良品系对于保证我国坛紫菜产业的稳定发展已显得十分迫切和重要。最近几年，国内的紫菜工作者已经选育出多个坛紫菜耐高温性品系，并在生产上推广应用，得到了广大养殖户的一致好评。但由于所选育的坛紫菜耐高温型品系在形态上与其它坛紫菜品系没有明显区别，可用于鉴别的形态性状非常有限，在生产上经常造成种质混淆，不利于坛紫菜良种的推广和知识产权的保护。分子标记技术的出现给这一问题的解决带来了契机，它直接在DNA水平上标记检测基因组的遗传变异，不受发育时期和环境因素的影响，已经广泛应用于高等植物的种质鉴定中。SCAR标记是一种以常规PCR扩增为基础的分子标记技术，具有结果稳定、重复性好、操作简便、可以快速检测大量个体、检测费用低等优点，被认为是种质鉴定的最佳分子标记技术。但由于该标记技术需要预先知道目的片段的两端序列，并根据标记两端序列设计特异引物，因此现在一般采用对AFLP标记和随机扩增多态性DNA (随机扩增多态性DNA标记的英文记为random amplifed polymorphic DNA,简称RAPD)标记进行克隆、测序后转换得到SCAR标记的方法来开发。目前，SCAR标记已经在水稻、玉米等重要陆生经济作物中得到了广泛的应用。陈昌生等(陈昌生，纪德华，谢潮添，徐燕，梁艳，郑永健，史修周，王凤霞，赵玲敏·坛紫菜耐高温品系选育及经济性状的初步研究.海洋学报，2008，30 (5):100-106)报道了坛紫菜耐高温品系选育及经济性状的初步研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、准确的用于鉴定坛紫菜耐高温型品系的分子标记及其构建方法。本发明的另一目的在于提供SCAR标记用于耐高温型品系的鉴定方法。所述用于鉴定坛紫菜耐高温型品系的分子标记为标记Z-26-600和标记Z-26-360。
所述标记Z-26-600的特征引物序列为正向引物5，-TTTTTCAGGAATAGTAAACACC-3，；反向引物5’ -TAGATTACCTTAAAGTTCGGAT-3 ’。扩增的片段长度为530bp，PCR扩增时退火温度为53. 5°C。所述标记Z-26-360的特征引物序列为
正向引物5’ -TAGAGCAATCGTTATCCATAAGTG-3，；反向引物5，-TGTTTTTTCTATTTTCAAAGCCTA-3，。扩增的片段长度为242bp，PCR扩增时退火温度为54. 5°C。所述用于鉴定坛紫菜耐高温型品系的分子标记的构建方法包括以下步骤I)坛紫菜材料的收集收集叶状体的新鲜坛紫菜，用无菌海水处理后，备用；2)总DNA提取将收集的叶状体的新鲜坛紫菜在液氮中研磨成粉末，采用CTAB法提取总DNA,其中，所述CTAB为Cetyltrimethylammonium Bromide的简称，CTAB的中文名称为溴化十二烷基三甲基铵；3)RAPD扫描分析采用RAPD引物对步骤2)中获得的各材料总DNA进行标记扫描分析，RAro 扩增的反应体系为10 X PCR buffer 2. 0μ L,2. 5mM dNTP I. OyL, 10 μ M RAPD引物 I. 0μ L，25mM MgCl2L 0 μ L, 5U/μ L Taq DNA聚合酶0· 3 μ L，5ng/μ L模板DNA 2. O μ L,最后加无菌ddH20至反应体系总体积为20 μ L ; 4)RAPD扩增产物的电泳检测取7 μ LRAPD扩增产物，加3 μ L溴酚蓝后于I. 2%的琼脂糖凝胶中电泳I. 5h后，在紫外灯下观察电泳结果，结果在引物S249的RAH)扩增结果中找到一条大小为600bp的特异性条带(只有耐高温型品系中有，其它品系没有的条带)，命名为Z-26-600 ;在引物S250的RATO扩增结果中同样找到一条大小为360bp的特异性条带，命名为Z-26-360 ；
5)特异性条带的切胶回收、测序将步骤4)中获得的两条特异性条带Z-26-600和Z-26-360切胶回收后进行测序，分别获得他们的核苷酸序列如下Z-26-600 I CCACATCGGT TAATGTTTCC TTCGGTTTAA TGGTATCATT ACTTACCGAG TCTACTTCTT61 TTTCAGGAAT AGTAAACACC TCGTTAGGTG AGATCTCAAT CACATCAACT TCAGTTTCAG121 TAGGTGTAAT GGTCTTATTA ACAGGAGGTA ATTCTTGTGA AAAACAAAAA ATGTTAATAA181 ACAATGTCAA AATTGTTATT AAAAGAATAT GTCTCTTTGT GCTATACAAC CGCTTAAATT241 CTATTTTTGT AATACTTTGG TCTAGTTTTT GACGGTTCAA ACATACATAA TATTTTTTGG301 GGAGATTTAA TTTTTGCAAA AATTTAAATG ATAAAATTGC GTTAAATAAT ATTACAATAT361 GAAAGCTAAA GTTTTAGTTT TATTAGGATT TCTTTTCATC ACATTTTTAT TGATGTCTTT421 TCAAAAAGAA GAGCGCAGCA ATAAGTTTGT GGTGGTTTTA GATGCTGGTC ATGGTGGAAA481 AGATCCTGGA AATCTTGGTA ATAATTTTAA AGAAAAAGAC ATTGCACTTA AAATAGTATT541 AGCAGTAGGT AAGGAGTTAG AGAAAAATCC GAACTTTAAG GTAATCTATA CTAGAAAAAC601 CGATGTGGZ-26-600 I ACCTCGGCAC TAAAAATATT TAATATCTCT CGTGCTACCT ACGAGAATTA TAGAGCAATC61 GTTATCCATA AGTGCGAACA ATCGTATTTT AAATGGTGTA CCAAACGATT TCCCAATCAG
121 CTCCTCTCTT CTGAGGTTGA AATCATTAAA CAGTACTTAA GTAATGAATG TTATCGTTTT181 TGGTCTAAGT CTTCAATATT TCTTATGGCT GTTAGAGATG GTAAACTAGC TTGCTCCTTA241 TCTACCTTTT ATAATTATGC TCGATTACTA GGCTTTGAAA ATAGAAAAAA CAAGCGAAAA301 TCTGATAATT ACAATGCATT AAAAACATCT AAACCCAATC AAATATGGTG TGCCGAGGT ；6) SCAR标记引物设计根据步骤5)中获得的两个标记的核苷酸序列，用Primer5. 0软件设计SCAR标记的引物序列为标记Z-26-600的特征引物序列为正向引物5’-TTTTTCAGGAATAGTAAACACC-3 ；
反向引物5’-TAGATTACCTTAAAGITCGGAT-3’ ；标记Z-26-360的特征引物序列为正向引物5’-TAGAGCAATCGTTATCCATAAGTG-3’ ；反向引物5’-TGTTTTTTCTATTTTCAAAGCCTA-3 ；7)SCAR标记的验证分别应用所设计的两对SCAR标记引物对对步骤2)中获得的各材料总DNA进行PCR扩增。在步骤3)中，所述RAH)扩增的反应程序为95°C预变性5min ;95°C变性30s，37°C复性50s，72°C延伸lmin,以上3步，即95°C预变性5min ;95°C变性30s，37°C复性50s，72°C延伸lmin重复40个循环；72°C延伸IOmin0在步骤4)中，所述引物S249的序列为5’ -CCACATCGGT-3’ ；所述引物S250 的序列为5’ -ACCTCGGCAC-3’。在步骤7)中，所述PCR扩增的反应体系可为10XPCR buffer 2. 0 U L, 2. 5mMdNTP I. 0uL,10uM SCAR 正反向引物各 0. 5 y L，5U/y L Taq DNA 聚合酶 0. 3 y L，5ng/y L总DNA 2. Ou L,最后加无菌ddH20至反应体系总体积为20 y L ;所述PCR扩增的反应程序可为95°C预变性 5min ;95°C变性 30s, 53. 5°C (Z-26-600)或 54. 5°C (Z-26-360)复性 50s,72°C延伸 lmin,以上 3 步，即 95°C预变性 5min ;95°C变性 30s, 53. 5°C(Z-26_600)或 54. 5°C(Z-26-360)复性50s，72°C延伸lmin重复30个循环；72°C延伸IOmin ;所述SCAR标记可用于耐高温型品系的鉴定；所述SCAR标记用于耐高温型品系的鉴定方法如下I)坛紫菜材料的收集取新鲜健康的叶状体材料，用无菌海水处理后，备用；2)总DNA提取将收集的叶状体材料在液氮中研磨成粉末，采用CTAB法提取总DNA ；3) PCR扩增分别以表I中的标记Z-26-600和标记Z-26-360所对用的引物序列分别对步骤2)中提取的总DNA进行PCR扩增反应，PCR扩增反应体系为10XPCR buffer
2.0 u L, 2. 5mMdNTP l.OuL, IOuM SCAR 正反向引物各 0. 5 y L，5U/ y LTaqDNA 聚合酶
0.3uL, 5ng/ u L总DNA2. 0 u L,最后加无菌ddH20至反应体系总体积为20 u L。PCR扩增反应程序为95°C预变性 5min ;95°C变性 30s, 53. 5°C (Z-26-600)或 54. 5°C (Z-26-360)复性 50s，72。。延伸 lmin,以上 3 步，即 95°C预变性 5min ;95°C变性 30s, 53. 5°C (Z-26-600)或 54. 5°C (Z-26-360)复性 50s，72。。延伸 lmin 重复 30 个循环；72°C延伸 IOmin ；4)PCR扩增产物的电泳检测取7 ii LPCR扩增产物，加3 ii L溴酚蓝后于I. 2%的琼脂糖凝胶中电泳I. 5h后拍照记录；5)结果判断若在步骤4)中能分别检测到一条长度为530bp和242bp的特异性片段，则该叶状体材料属于耐高温型品系，否则就不属于。本发明应用RAPD分子标记技术对紫菜材料进行遗传分析，获得紫菜耐高温型品系的特异性扩增片段；所述特异性片段经大量扩增后回收、克隆、测序得到紫菜耐高温型品系特异性扩增片段S249-600和S250-360的碱基序列；再根据这两个序列两端的碱基序列合成特异引物对，经PCR反应程序，将所述特异性扩增片段转换成了 SCAR标记。本发明的SCAR标记可以作为坛紫菜耐高温型品系的种质鉴定和知识产权保护的分子标记。其紫菜种质检测结果稳定，操作快捷，重复性、稳定性高，检测费用低，省时省力。同样适合于把其它 类型的标记(如AFLP，RFLP, SRAP)转换为SCAR标记。本发明具有如下优点I)本发明采用DNA分子标记技术来鉴定坛紫菜的耐高温型品系，结果更为准确、
可靠；2)本发明提供的特异SCAR标记具有检测结果稳定，操作快捷，重复性、稳定性高，检测费用低等特点；3)利用本发明所提供的高温型坛紫菜的鉴定方法可以容易开发成试剂盒，直接用于坛紫菜高温型材料的鉴定；4)本发明提供的SCAR标记构建方法同样适合于把其它类型的标记(如AFLP，RFLP, SRAP)转换为SCAR标记。在本发明中也可方便地应用于坛紫菜耐高温品系的鉴定。
图I为Z-26-600标记PCR扩增产物的电泳检测结果。M为DL2000marker ;1 4为坛紫菜耐高温型品系；5 12为坛紫菜非耐高温型品系。图2为Z-26-360标记PCR扩增产物的电泳检测结果。M为DL2000marker ;1 4为坛紫菜耐高温型品系；5 12为坛紫菜非耐高温型品系。
具体实施例方式以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。所述用于鉴定坛紫菜耐高温型品系的分子标记的构建方法如下I)坛紫菜材料的收集收集坛紫菜耐高温型和非耐高温型品系的新鲜健康叶状体材料，用无菌海水处理后，备用；2)总DNA提取将收集的叶状体材料在液氮中研磨成粉末，采用CTAB法提取总DNA ；3)RAPD扫描分析采用RAPD引物对步骤2)中获得的各材料总DNA进行标记扫描分析，RAro 扩增的反应体系为10 XPCR buffer 2. Ou L,2. 5mM dNTP l.OuL, IOuM RAPD引物 I. Oii L，25mM MgCl2L 0 u L, 5U/u L Taq DNA聚合酶0. 3 y L，5ng/y L模板DNA 2. 0 u L,最后加无菌ddH20至反应体系总体积为20 ii L ；RAPD扩增的反应程序为95°C预变性5min ；95°C变性30s，37。。复性50s，72。。延伸lmin,以上3步重复40个循环；72°C延伸IOmin ；4) RAPD扩增产物的电泳检测取7 ii L RAPD扩增产物，加3 ii L溴酚蓝后于I. 2%的琼脂糖凝胶中电泳I. 5h后，在紫外灯下观察电泳结果，结果在引物S249的RAPD扩增结果中找到一条大小为600bp的特异性条带(只有耐高温型品系中有，其它品系没有的条带)，命名为Z-26-600 ;在引物S250的RAPD扩增结果中同样找到一条大小为360bp的特异性条带，命名为Z-26-360 ；所述引物S249的序列为5， -CCACATCGGT-3，；所述引物S250的序列为5， -ACCTCGGCAC-3，；5)特异性条带的切胶回收、测序将步骤4)中获得的两条特异性条带Z-26-600和 Z-26-360切胶回收后进行测序，分别获得他们的核苷酸序列如下Z-26-600 I CCACATCGGT TAATGTTTCC TTCGGTTTAA TGGTATCATT ACTTACCGAG TCTACTTCTT61 TTTCAGGAAT AGTAAACACC TCGTTAGGTG AGATCTCAAT CACATCAACT TCAGTTTCAG121 TAGGTGTAAT GGTCTTATTA ACAGGAGGTA ATTCTTGTGA AAAACAAAAA ATGTTAATAA181 ACAATGTCAA AATTGTTATT AAAAGAATAT GTCTCTTTGT GCTATACAAC CGCTTAAATT241 CTATTTTTGT AATACTTTGG TCTAGTTTTT GACGGTTCAA ACATACATAA TATTTTTTGG301 GGAGATTTAA TTTTTGCAAA AATTTAAATG ATAAAATTGC GTTAAATAAT ATTACAATAT361 GAAAGCTAAA GTTTTAGTTT TATTAGGATT TCTTTTCATC ACATTTTTAT TGATGTCTTT421 TCAAAAAGAA GAGCGCAGCA ATAAGTTTGT GGTGGTTTTA GATGCTGGTC ATGGTGGAAA481 AGATCCTGGA AATCTTGGTA ATAATTTTAA AGAAAAAGAC ATTGCACTTA AAATAGTATT541 AGCAGTAGGT AAGGAGTTAG AGAAAAATCC GAACTTTAAG GTAATCTATA CTAGAAAAAC601 CGATGTGGZ-26-600 I ACCTCGGCAC TAAAAATATT TAATATCTCT CGTGCTACCT ACGAGAATTA TAGAGCAATC61 GTTATCCATA AGTGCGAACA ATCGTATTTT AAATGGTGTA CCAAACGATT TCCCAATCAG121 CTCCTCTCTT CTGAGGTTGA AATCATTAAA CAGTACTTAA GTAATGAATG TTATCGTTTT181 TGGTCTAAGT CTTCAATATT TCTTATGGCT GTTAGAGATG GTAAACTAGC TTGCTCCTTA241 TCTACCTTTT ATAATTATGC TCGATTACTA GGCTTTGAAA ATAGAAAAAA CAAGCGAAAA301 TCTGATAATT ACAATGCATT AAAAACATCT AAACCCAATC AAATATGGTG TGCCGAGGT ；6) SCAR标记引物设计根据步骤5)中获得的两个标记的核苷酸序列，用Primer5. 0软件设计SCAR标记的引物序列为标记Z-26-600的特征引物序列为正向引物5’ -TTTTTCAGGAATAGTAAACACC-3，；反向引物5’ -TAGATTACCTTAAAGTTCGGAT-3，；标记Z-26-360的特征引物序列为正向引物5，-TAGAGCAATCGTTATCCATAAGTG-3，；反向引物5’ -TGTTTTTTCTATTTTCAAAGCCTA-3 ’ ；7) SCAR标记的验证分别应用所设计的两对SCAR标记引物对对步骤2)中获得的各材料总DNA进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为10 X PCR buffer 2. 0 u L, 2. 5mM dNTP1.01^，1011!^〇六1 正反向引物各0.5111，5。/111 Taq DNA 聚合酶 0. 3 y L，5ng/y L 总 DNA2.0UL,最后加无菌ddH20至反应体系总体积为20 ii L ；PCR扩增反应程序为95°C预变性5min ;95°C变性 30s, 53. 5°C (Z-26-600)或 54. 5°C (Z-26-360)复性 50s，72。。延伸 lmin,以上 3 步，即 95°C预变性 5min ;95°C变性 30s, 53. 5°C (Z-26-600)或 54. 5°C (Z-26-360)复性50s，72°C延伸lmin重复30个循环；72°C延伸IOmin ;扩增结果经电泳检测后，如图I和图2所示，由图I和2可 以看出，两个SCAR标记分别在耐高温型品系中检测到一条长度为530bp和242bp的特异性片段，而在非耐高温型品系中没有检测到片段。由此说明SCAR标记构建成功，可用于耐高温型品系的鉴定。以下给出鉴定的具体步骤I)坛紫菜材料的收集取新鲜健康的叶状体材料，用无菌海水处理后，备用。2)总DNA提取将收集的叶状体材料在液氮中研磨成粉末，采用CTAB法提取总DNA。3 ) PCR扩增分别以标记Z-26-600和标记Z-26-360所对用的引物序列分别对步骤2)中提取的总DNA进行PCR扩增反应，PCR扩增反应体系为10XPCR buffer
2.0 u L, 2. 5mM dNTP I. 0 u L, 10 u M SCAR 正反向引物各 0. 5 y L，5U/ y LTaqDNA 聚合酶
0.3uL, 5ng/ u L总DNA2. 0 u L,最后加无菌ddH20至反应体系总体积为20 u L。PCR扩增反应程序为95°C预变性 5min ;95°C变性 30s, 53. 5°C (Z-26-600)或 54. 5°C (Z-26-360)复性 50s，72。。延伸 lmin,以上 3 步，即 95°C预变性 5min ;95°C变性 30s, 53. 5°C (Z-26-600)或 54. 5°C (Z-26-360)复性 50s，72。。延伸 lmin 重复 30 个循环；72°C延伸 IOmin04)PCR扩增产物的电泳检测取7 ii LPCR扩增产物，加3 y L溴酚蓝后于I. 2%的琼脂糖凝胶中电泳I. 5h后拍照记录。5)结果判断若在步骤4)中能分别检测到一条长度为530bp和242bp的特异性片段，则该叶状体材料属于耐高温型品系，否则就不属于。
权利要求
1.用于鉴定坛紫菜耐高温型品系的分子标记，其特征在于为标记Z-26-600和标记Z-26-360。
2.如权利要求I所述的用于鉴定坛紫菜耐高温型品系的分子标记，其特征在于所述标记Z-26-600的特征引物序列为 正向引物5’ -TTTTTCAGGAATAGTAAACACC-3 ； 反向引物5’ -TAGATTACCTTAAAGITCGGAT-3’ ； 扩增的片段长度为530bp，PCR扩增时退火温度为53. 5°C。
3.如权利要求I所述的用于鉴定坛紫菜耐高温型品系的分子标记，其特征在于所述标记Z-26-360的特征引物序列为 正向引物5’ -TAGAGCAATCGTTATCCATAAGTG-3’ ； 反向引物5’ -TGTnTTTCTAnTTCAAAGCCTA-3’。
扩增的片段长度为242bp，PCR扩增时退火温度为54. 50C。
4.用于鉴定坛紫菜耐高温型品系的分子标记的构建方法，其特征在于包括以下步骤 1)坛紫菜材料的收集收集叶状体的新鲜坛紫菜，用无菌海水处理后，备用； 2)总DNA提取将收集的叶状体的新鲜坛紫菜在液氮中研磨成粉末，采用CTAB法提取总 DNA ； 3)RAPD扫描分析采用RAPD引物对步骤2)中获得的各材料总DNA进行标记扫描分析，RAPD 扩增的反应体系为10 XPCR buffer 2. Ou L,2. 5mM dNTP l.OuL, IOuM RAH)引物 I. 0 ii L, 25mM MgCl2L 0 u L, 5U/ u L Taq DNA 聚合酶 0. 3 y L，5ng/ u L 模板 DNA 2. 0 u L,最后加无菌ddH20至反应体系总体积为20 ii L ; 4)RAPD扩增产物的电泳检测取7ii LRAPD扩增产物，加3 y L溴酚蓝后于I. 2%的琼脂糖凝胶中电泳I. 5h后，在紫外灯下观察电泳结果，结果在引物S249的RAH)扩增结果中找到一条大小为600bp的特异性条带，命名为Z-26-600 ;在引物S250的RAPD扩增结果中同样找到一条大小为360bp的特异性条带，命名为Z-26-360 ； 5)特异性条带的切胶回收、测序将步骤4)中获得的两条特异性条带Z-26-600和Z-26-360切胶回收后进行测序，分别获得他们的核苷酸序列如下Z-26-600 I CCACATCGGT TAATGTTTCC TTCGGTTTAA TGGTATCATT ACTTACCGAG TCTACTTCTT.61 TTTCAGGAAT AGTAAACACCT CGTTAGGTG AGATCTCAAT CACATCAACT TCAGTTTCAG.121 TAGGTGTAAT GGTCTTATTA ACAGGAGGTA ATTCTTGTGA AAAACAAAAA ATGTTAATAA.181 ACAATGTCAA AATTGTTATT AAAAGAATAT GTCTCTTTGT GCTATACAAC CGCTTAAATT.241 CTATTTTTGT AATACTTTGG TCTAGTTTTT GACGGTTCAA ACATACATAA TATTTTTTGG . 301 GGAGATTTAA TTTTTGCAAA AATTTAAATG ATAAAATTGC GTTAAATAAT ATTACAATAT . 361 GAAAGCTAAA GTTTTAGTTT TATTAGGATT TCTTTTCATC ACATTTTTAT TGATGTCTTT . 421 TCAAAAAGAA GAGCGCAGCA ATAAGTTTGT GGTGGTTTTA GATGCTGGTC ATGGTGGAAA . 481 AGATCCTGGA AATCTTGGTA ATAATTTTAA AGAAAAAGAC ATTGCACTTA AAATAGTATT . 541 AGCAGTAGGT AAGGAGTTAG AGAAAAATCC GAACTTTAAG GTAATCTATA CTAGAAAAAC . 601 CGATGTGGZ-26-600 I ACCTCGGCAC TAAAAATATT TAATATCTCT CGTGCTACCT ACGAGAATTA TAGAGCAATC·61 GTTATCCATA AGTGCGAACA ATCGTATTTT AAATGGTGTA CCAAACGATT TCCCAATCAG·121 CTCCTCTCTT CTGAGGTTGA AATCATTAAA CAGTACTTAA GTAATGAATG TTATCGTTTT·181 TGGTCTAAGT CTTCAATATT TCTTATGGCT GTTAGAGATG GTAAACTAGC TTGCTCCTTA·241 TCTACCTTTT ATAATTATGC TCGATTACTA GGCTTTGAAA ATAGAAAAAA CAAGCGAAAA·301 TCTGATAATT ACAATGCATT AAAAACATCT AAACCCAATC AAATATGGTG TGCCGAGGT ； 6)SCAR标记引物设计根据步骤5)中获得的两个标记的核苷酸序列，用Primer 5. 0软件设计SCAR标记的引物序列为 标记Z-26-600的特征引物序列为 正向引物5’ -TTTTTCAGGAATAGTAAACACC-3 ； 反向引物5’ -TAGATTACCTTAAAGITCGGAT-3’ ； 标记Z-26-360的特征引物序列为 正向引物5’ -TAGAGCAATCGTTATCCATAAGTG-3’ ； 反向引物5’ -TGTTTTTTCTATTTTCAAAGCCTA-3 ； 7)SCAR标记的验证分别应用所设计的两对SCAR标记引物对对步骤2)中获得的各材料总DNA进行PCR扩增。
5.如权利要求4所述的用于鉴定坛紫菜耐高温型品系的分子标记的构建方法，其特征在于在步骤3)中，所述RAPD扩增的反应程序为95°C预变性5min ;95°C变性30s，37°C复性·50s，72。。延伸lmin,以上3步，即95°C预变性5min ;95°C变性30s，37。。复性50s，72。。延伸Imin重复40个循环；72°C延伸lOmin。
6.如权利要求4所述的用于鉴定坛紫菜耐高温型品系的分子标记的构建方法，其特征在于在步骤4)中，所述引物S249的序列为5’ -CCACATCGGT-3’ ； 所述引物S250的序列为5’ -ACCTCGGCAC-3’。
7.如权利要求4所述的用于鉴定坛紫菜耐高温型品系的分子标记的构建方法，其特征在于在步骤7)中，所述PCR扩增的反应体系为10XPCR buffer 2. O u L, 2. 5mM dNTP·1.01^，1011!^〇六1 正反向引物各0.5111，5。/111 Taq DNA 聚合酶 0. 3 y L，5ng/y L 总 DNA·2.O u L,最后加无菌ddH20至反应体系总体积为20 u L。
8.如权利要求4所述的用于鉴定坛紫菜耐高温型品系的分子标记的构建方法，其特征在于在步骤7)中，对于Z-26-600，所述PCR扩增的反应程序为95°C预变性5min ;95°C变性·30s, 53. 5°C复性 50s，72°C延伸 lmin ;以上 3 步，即 95°C预变性 5min ;95°C变性 30s，53. 5°C复性50s，72。。延伸lmin重复30个循环；72°C延伸IOmin ； 对于Z-26-360，所述PCR扩增的反应程序为95°C预变性5min ;95°C变性30s，54. 5°C复性50s，72。。延伸lmin ;以上3步，即95°C预变性5min ;95°C变性30s, 54. 5°C复性50s，·72°C延伸lmin重复30个循环；72°C延伸IOmin0
9.SCAR标记用于耐闻温型品系的鉴定。
10.如权利要求9所述鉴定，其特征在于其鉴定方法包括以下步骤 1)坛紫菜材料的收集取新鲜健康的叶状体材料，用无菌海水处理后，备用； 2)总DNA提取将收集的叶状体材料在液氮中研磨成粉末，采用CTAB法提取总DNA； 3)PCR扩增分别以表I中的标记Z-26-600和标记Z-26-360所对用的引物序列分别对步骤2)中提取的总DNA进行PCR扩增反应； PCR 扩增反应体系为10 X PCR buffer 2. 0 u L, 2. 5mM dNTP l.OuL, IOuM SCAR 正反向引物各0.51^，5~1^ Taq DNA聚合酶0. 3 y L，5ng/y L总DNA 2. Oy L，最后加无菌ddH20至反应体系总体积为20 ii L ; PCR扩增反应程序为 对于 Z-26-600，95°C预变性 5min ;95°C变性 30s，53. 5°C复性 50s，72°C延伸 lmin,以上3步，即95°C预变性5min ;95°C变性30s, 53. 5°C复性50s，72。。延伸lmin重复30个循环；72°C延伸 IOmin ；对于 Z-26-360，95°C预变性 5min ;95°C变性 30s，54. 5°C复性 50s，72°C延伸 lmin,以上3步，即95°C预变性5min ;95°C变性30s, 54. 5°C复性50s，72。。延伸lmin重复30个循环；72°C延伸 IOmin ； 4)PCR扩增产物的电泳检测取7ii LPCR扩增产物，加3 ii L溴酚蓝后于I. 2%的琼脂糖凝胶中电泳I. 5h后拍照记录； 5)结果判断若在步骤4)中能分别检测到一条长度为530bp和242bp的特异性片段，则该叶状体材料属于耐高温型品系，否则就不属于。
全文摘要
用于鉴定坛紫菜耐高温型品系的分子标记及其构建方法，涉及一种坛紫菜。用于鉴定坛紫菜耐高温型品系的分子标记为Z-26-600和Z-26-360。构建方法坛紫菜材料的收集；总DNA提取；RAPD扫描分析；RAPD扩增产物的电泳检测；特异性条带的切胶回收、测序；SCAR标记引物设计；SCAR标记的验证。所述SCAR标记用于耐高温型品系的鉴定方法坛紫菜材料的收集；总DNA提取；PCR扩增；PCR扩增产物的电泳检测；结果判断。
文档编号C12Q1/68GK102660646SQ20121014554
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月11日 优先权日2012年5月11日
发明者徐燕, 王婷, 纪德华, 谢潮添, 陈昌生 申请人:集美大学