专利名称：莱茵衣藻三酰甘油合成限制基因CrPEPC1及其编码蛋白与应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种能显著抑制藻类中性脂合成的基因及其编码蛋白与应用，特别涉 及一种能显著抑制莱茵衣藻中性脂含量的油脂代谢基因及其编码蛋白与应用。
背景技术：
进入21世纪，经济飞速发展，人类对石油等化石燃料的消耗日益増加，并且使用化石燃料带来了严重环境污染问题，世界各国都在寻找安全的可再生能源。生物能源可以间接或者直接利用植物或微生物的光合作用，将太阳能固定为化学能，是可再生能源的首选。生物柴油和燃料こ醇是目前可以作为汽油添加剂进入市场的生物能源，其中生物柴油的成分更接近汽油，并且来源广泛，成本低，是最有可能解决石油危机的可再生能源之一。生物柴油的制备主要是通过三酰甘油(TAG)与甲醇(こ醇)通过酯交换エ艺制成。近年来生物柴油的产量在不断増加，2008年全球生物柴油总量达到1110万吨，预计到2016年生物柴油总产量达到12100万吨，但是生物柴油的价格至今仍是居高不下。原料成本占据了生物柴油总生产成本的60-70%。目前生物柴油的原料有餐饮废弃油、动植物油脂和微藻。利用微藻生产生物柴油具有无可比拟的优势，已成为制备生物柴油的主要途径。利用微藻来生产生物柴油有很多エ艺步骤，其中优良藻种的选育是关键。最理想的生物柴油生产藻株要求生长迅速、含油量高且脂肪酸组成适宜制备生物柴油。目前的研究工作主要集中在藻种的分离，藻种含油量的測定，藻种脂肪酸成分的分析以及藻种的大规模培养上。与高等植物相比，微藻的TAG生物合成和积累的分子机制研究还很薄弱，关于TAG代谢网络中相关基因功能研究报告更为稀少。莱茵衣藻是模式单细胞生物，基因组测序已经完成，在缺氮条件下油脂可以积累达到胞质的60%，是研究TAG代谢基因的理想藻株。PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)是ー种细胞质酶，广泛存在于光合生物中，可以催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和HC03-生成草酰こ酸(OAA)和无机磷酸的不可逆反应。在C4植物中PEPC主要起固定C02作用；而在C3植物和非光合作用组织中，PEPC主要起到回补损失的碳骨架作用。莱茵衣藻中存在两种PEPC酶PEPCl和PEPC2。前期研究表明PEPC2对微藻的中性脂合成具有负调控作用。日本学者Sugimoto等也发现大豆籽粒中PEPC活性与蛋白质含量密切相关。我国科学家陈锦清等受此启发而提出“底物竞争”假说大豆籽粒中的油脂和蛋白质之间存在着底物竞争，其共同底物为糖酵解的产物ー丙酮酸，PEPC催化和HC03-生成草酰こ酸(OAA)进入蛋白质合成途径，而こ酰辅酶A羧化酶(ACCase)则催化丙酮酸生成こ酰辅酶A进入脂肪酸合成途径，二者的相对活性决定了底物的流向，进而决定蛋白质和脂肪在大 杆粒中的比例。
发明内容
本发明的目的是提供ー种能抑制微藻中三酰甘油含量的基因及其编码蛋白与应用。尤其是来自莱茵衣藻的基因。
本发明所提供的能提高藻类三酰甘油含量的基因名称为CrPEPCl(uhlamydomonas reinhardti I Phosphoenolpyruvate carboxylase isoiorm I), 该基因在JGI莱茵衣藻基因数据库的名称为estExt_GenewiseW_l.C_280036，位于16号染色体3，641，705-3，648，177区域，含12个外显子。蛋白ID 80312，编码ー个名为PEPCl (Phosphoenolpyruvate carboxylase isoform I)的蛋白，是根据 JGI 莱茵衣藻基因数据库上公布的CrPEPCl基因为模板设计特异性引物，扩增cDNA获得全长序列，根据该碱基序列分析而推测编码CrPEPCl蛋白的序列。对其研究发现该基因可以显著降低莱茵衣藻中中性脂含量和生物量。本发明所述CrPEPCl基因，来源于莱茵衣藻，是下列核苷酸序列之I)序列表中 SEQ ID NO 1DNA 序列；2)编码序列表中SEQ ID NO 2蛋白质序列的多核苷酸； 3)与序列表中SEQ ID NO 1限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。能降低微藻中性脂含量的基因CrPEPCl的编码蛋白CrPEPCl，是具有序列表中SEQID NO :2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO :2的氨基酸残基序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO :2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO :2衍生的蛋白质。序列表中序列2氨基酸残基是由484个氨基酸残基组成的蛋白质。含有本发明基因的表达载体、细胞系及至少有15个核苷酸与由SEQ ID N0:1所示核苷酸序列或其互补链组成的DNA互补的DNA均属本发明的保护范围。该CrPEPCl基因应用于显著改变莱茵衣藻的中性脂含量和生物量及应用于新型高油脂含量藻株的培育。采用任何一种引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明的CrPEPCl基因转入藻类导致中性脂含量減少，在微藻中将此基因敲除(或沉默)后中性脂含量升高。如通过电转化法转化莱茵衣藻，得到纯合的CrPEPCl转化子(即为CrPEPCl过量表达的单拷贝纯合莱茵衣藻)。为了便于对转基因细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加エ，如加入了植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。用于转化的生物可以是细菌细胞，动物细胞和植物。一旦获得ー种转化植物，其中已将本发明的DNA导入了基因组，就可能通过无性或有性繁殖获得后代，或者从该植株及其后代通过克隆获得繁殖材料来生产植物。用本发明DNA转化的植物细胞，包含这些细胞的植物体，该植物后代和克隆后代，以及所有从该植物获得的繁殖材料都属于本发明中。本发明的基因可以用于制备该基因的重组蛋白。重组蛋白常如下制备将编码本发明蛋白的DNA插入适当的表达载体，将该载体导入适当的细胞，培养转化的细胞，为使这些细胞表达所述重组蛋白和纯化所表达的蛋白。重组蛋白可表达为与便于纯化的其他蛋白融合的蛋白，如与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合的蛋白。对宿主细胞没有限制，只要该细胞适于表达所述重组蛋白。所得重组蛋白可用于制备与该蛋白结合的抗体。例如用本发明的纯化重组蛋白或一部分免疫动物(如免)，一段时间后采血，从而制备多克隆抗体。得到的抗体可用于检测或纯化本发明的蛋白和能与本发明蛋白互作的蛋白。相应的本发明包括能结合本发明蛋白的抗体。
图I为CrPEPCl的RT-PCR扩增结果M :DL2000DNA分子量标准；3 =CrPEPCl扩增结果;图2为CrPEPCl过量表达转化子生物量的变化情况；图3为CrPEPCl过量表达转化子中性脂含量的变化情况；图4为pAMBIA1302空载体组、pCAMBIA1302_CrPEPCl转化组第六天时尼罗红染色后荧光观察图； 图5为pAMBIA1302空载体组、pCAMBIA1302_CrPEPCl转化组RNA表达分析图；图6为pAMBIA1302空载体组、pCAMBI A1302_CrPEPCl转化组酶活性分析图；图7为干涉藻株的生物量含量变化图；图8为干涉藻株的油脂含量变化图；图9为Maa7/XIR空载体转化子和CrPEPCl干涉藻株尼罗红染色后荧光观察图；图10为Maa7/XIR空载体转化子和CrPEPCl干涉藻株酶活性分析图；图11为CrPEPCl基因在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位；图12为CrPEPCl基因在莱茵衣藻CC425中的亚细胞定位；
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。Marker均购自大连宝生物公司。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例ICrPEPCl的克隆I)莱茵衣藻总RNA的提取莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)藻株 CC425,培养于 24°C光照培养箱，100 μ mo I IrT2SecT1白光,全光照条件下,待生长至对数生长期,取藻液50mL, 10000r/min离Imin收集藻体，液氮速冻后碾磨成粉末，按照Trizol的方法提取总RNA ；2)引物设计根据DOE JGI Chlamydomonas database上公布的CrPEPCl基因为模板,设计如下特异性引物，进行PCR扩增CrPEPCl全长扩增引物引物序列(5’ 一 3’ )正向引物GATGGACGCGGTGACCAC反向引物CCGCCGCCACCGCCGCCG3) cDNA 的合成按照宝生物工程(大连)有限公司提供的Takara的试剂盒,使RNA反转录成cDNA。4)制备 PCR Master 混合物试剂每管加入量(AL )cDNA第一链I10 X PCR缓冲液5dNTP Mix (IOmM)I正向引物I反向引物IPCR 级水40.5LA Taq 酶O. 55)进行PCR扩增940C 5min ；35 个循环94で lmin, 55°C lmin,72°C Imin ；72°C IOmin0取8 μ L进行I %琼脂糖凝胶电泳分析结果如图I，-20 V保存。6) PCR产物的纯化和胶回收按照上海华舜生物工程有限公司的小量胶回收试剂盒回收DNA片断，PCR产物连接到pGEM-T Vector (promega公司)，转化大肠杆菌DH5 α，挑选阳性克隆测序。7) CrPEPCl基因生物信息学分析来源于莱茵衣藻的CrPEPCl推测的蛋白质含有484个氨基酸，经ExPASy数据库中蛋白质软件(http://expasy. org/tools/)分析其分子量为51. 8kD,等电点为5· 81。 实施例2过量表达CrPEPCl基因的转化子获得I)植物双元表达载体的构建设计带有Bgl II和Spe I酶切位点的引物(正向5’ -TAGTAGATCTGATGGACGCGGTGACCAC-3’；反向5’ -AAATACTAGTCCGCCGCCACCGCCG CCG-3’)，PCR 扩增 CrPEPCl 基因全长。Bfl II和Spe I双酶切修饰后的CrPEPCl产物和pCAMBIA1302的BglII和Spe I双酶切载体大片段进行连接。连接产物转化大肠杆菌DH5 a，PCR鉴定阳性克隆，提取质粒进行双酶切鉴定。提取正确的重组表达质粒pCAMBIA1302-CrPEPCl，用于转化。2)过量表达CrPEPCl莱茵衣藻转化子的获得(电转化法)莱茵衣藻(藻株CC425，购自中国科学院水生生物研究所)，培养于24°C光照培养箱，lOOymol m^sec-1白光，全光照条件下，待生长至藻细胞数为2 X IO7个/mL ;2000rpm离心5min，收集藻细胞；无菌去离子水洗涤沉淀并重复3次，用含60mM蔗糖的TAP液体培养基(2. 42g/L Tris-base+lml/L 冰醋酸+119mg/L K2HP04+61mg/LKH2P04+0. 4g/L NH4C 1+0. lg/LMgSO4 7H20+50mg/LCaCl2 2H20+lml/LTrace)重悬沉淀 JKMlOmin ;取藻液加入重组质粒， 混匀后转移至电击杯中，室温静置5min ; I. 5kV，10 μ F，200 Ω，6msec条件下电击，室温静置IOmin,加入5mL TAP液体培养基，22°C, IOOrpm,昏暗光线复苏8h ；2000rpm,离心5min,收集藻细胞，调节藻细胞数目到I X IO6个/mL ;转移藻液至含I. 5mM L-色氨酸、5 μ g/mLL-paromomycin的TAP固体选择培养基上,缓慢倾斜旋转，使藻液分布均勻；关闭光源，吹干，24°C光照培养箱，lOOymol m^sec-1白光，全光照条件下培养至形成单个藻落。实时荧光定量PCR确定CrPEPCl基因的过量表达RNA提取參照实例一，实时荧光定量 PCR 參照 TaKaRa 公司的 SYBR Premix Ex Taq试剂操作说明进行。结果见图5。3)对照莱茵衣藻的获得用pCMBIA1302代替pCMBIA1302-CrPEPCl，用电转化法转化莱茵衣藻(藻株CC425，购自中国科学院水生研究所)，方法同步骤2，得到转空载体的藻株。实施例3CrPEPCl过量表达藻株的生理表型观察 转pCMBIA1302空载体组、CrPEPCl过量表达组、原始藻株CC425，各选100个藻株，培养于24°C光照培养箱，100 μ mol n^sec—1白光，全光照条件下，待生长至对数生长期，2000rpm,离心5min，双蒸水重悬，按10 %接种量接种到不含抗生素的HSM-N液体培养基(2g/LNaAc 3H20+1. 44g/L K2HP04+0. 72g/L KH2P04+0 . 54 6 7g/L NaCl+20mg/LMgS047H20+10mg/LCaCl2 2H20+lml/L Trace-N)，连续震荡培养6天。每24h测量以下生理值。I)生物量统计按照Harris于1989年描述的方法使用血球计数板计数，并计算出生物量。结果显示过量表达CrPEPCl基因的藻株比非转基因藻株CrCC425和转空载体藻株生物量有所增カロ。在第6天时增加最多，相对于转空载体藻株生物量増加了 70.99% (图2)。2)中性脂含量测定使用酸水解法測定中性脂含量藻液低温冷冻干燥成藻粉，各取0. Ig藻粉，加入无菌蒸懼水，混勻后加入IOml盐酸，80°C水浴25min,加入IOml 95%こ醇,混勻。冷却后加入IOmlこ醚,加盖振摇lmin,之后开盖放出气体。4000rpm离心3min,取上清液移至恒重的锥形瓶中，重复洗涤离心管中的残渣，然后将上清液转移至原先的锥形瓶中。将锥形瓶置于水浴上蒸干，再转移至100°C烘箱中干燥2h，取出冷却后称重(图3)。另取藻液，经终浓度为10 μ g/mL尼罗红染色IOmin后，使用突光显微镜在激发光为480nm,发散光为560nm-600nm下进行观察及拍照，也可见过量表达CrPEPCl基因中性脂含量明显下降(图4)。实施例4干涉表达CrPEPCl基因的转化子的获得I)植物干渉表达载体的构建设计特异性引物(正向5’-GTGACTGTGCAGGGCGAGAT-3’ ；反向5’-TGCTGAGTCCAGGCGAAGAT-3’)扩增CrPEPCl基因486bp片段用于干涉研究。正义片段分别在正向和反向引物引入Hindi 11和XbaI位点，扩增的PCR产物和RNAi中间载体T2251载体分别经Hindlll/Xbal双酶切后，连接，转化，鉴定，测序确定正确的阳性克隆。反义片段在正向和反向引物中分别引入BamHI与Sal I位点，经过BamHI和Sal I双酶切后，与同样经BamHI/Sall双酶切修饰已连接正义片段的T2251载体连接，转化，鉴定获得CrPEPCl反向重复序列插入的中间载体T2251-CrPEPCl。EcoRI酶切Maa7/XIR载体并去磷酸化与同样经EcoRI酶切的T2251-CrPEPCl载体连接，转化，鉴定得到用于RNA干涉的最终载体Maa7/XIR-CrPEPClo2)干涉表达CrPEPCl莱茵衣藻的获得采用电转化法转化莱茵衣藻(藻株CC425，购自中国科学院水生研究所)，具体步骤參见实例2中步骤2。3)对照莱茵衣藻的获得用Maa7/XIR代替Maa7/XIR_CrPEPCl用电转化法转化莱茵衣藻(藻株CC425，购自中国科学院水生研究所)，方法同步骤2，得到转空载体的藻株。实施例5CrPEP Cl干涉表达藻株的生理表型观察CrPEPCl干涉表达组，待长出单个藻落后，接种到含I. 5mM L-色氨酸、5μΜ 5_FI的TAP固体选择培养基上，转Maa7/XIR空载体组直接接种到含I. 5mM L-色氨酸、5 μ g/mL paromomycin的TAP固体选择培养基上，培养于24°C光照培养箱，100 μ mol m 2sec 1白光，全光照条件下，待第三次长出单个藻落，挑取阳性转化子，接种到HSM液体培养基(2g/LNaAc 3H20+1. 44g/L K2HP04+0. 72g/L KH2P04+0. 5g/L NH4Cl+20mg/LMgS04 7H20+10mg/LCaCl2 2H20+lml/L Trace)中，连续震荡培养9天。每24h测量以下生理值。生物量和中性脂含量的測定參照实例3。结果CrPEPCl干涉表达的藻株生物量略有下降但是改变不是很明显(图7);中性脂含量呈升高趋势，在第6天时升高最多，升高了37. 52% (图8) ,CrPEPCl干渉表达组的中性脂含量上升也可以通过尼罗红染色后照相明显可见(图9)。其mRNA表达水平參照实例ニ，CrPEPCl基因的RNA表达明显被抑制。实例6CrPEPCl重组蛋白的获得DCrPEPCl蛋白表达载体的构建设计CrPEPCl 全长扩增引物(正向5’ -AATCGGATCCATGGCCTCTTA CTTCCCC-3，)和(反向5’ -ATAAGTCGACTCATTGCACGATGGCCAGCGG-3’ )，分别引入 BamHI 和 SalI 酶切位点，进行PCR扩增。PCR产物和pGEX-6P-l载体均经BamHI和SalI双酶切后，回收，连接，转化大肠杆菌BL21。鉴定，挑取正确的阳性克隆。2) GST-CrPEPCl融合重组蛋白的诱导转化质粒pGEX-6P-l-CrPEPCl的BL21菌，在37 °C摇床培养至对数生长期，加入终浓度ImM的IPTG，220rpm，37°C诱导4小时，离心菌体，进行SDS-PAGE电泳，诱导的GST-CrPEPCl融合重组蛋白大小为84kD，CrPEPCl蛋白与预期的52kD —致。实例7CrPEPCl基因的亚细胞定位取pCAMBIA1302-CrPEPCl过量表达的藻株和pCAMBIA1302空载体转化组及空白CC425藻株在荧光显微镜下观察，发现CrPEPCl在细胞质中表达强烈(图12)，将pCAMBIA1302-CrPEPCl质粒采用基因枪轰击洋葱表皮细胞后观察也发现CrPEPCl基因定位于细胞质(图11)。实例8转基因藻细胞PEPCl酶活测定取对数生长期的转基因藻株IOml转入50ml离心管,3000rpm离心5min,取上清收集细胞，并以PH 7. 9的磷酸缓冲溶液洗涤2次。将藻细胞置于冰上，加入3ml PBS进行超声波破碎，破碎持续10s，每次间隔5s，共进行四次，破碎完毕后，4°C离心5min，收集上清液定容至6ml，在大量透析液(即提取缓冲液)中4°C透析过夜，即得PEPC酶液。酶活性測定參考Hirai的方法，略有改动1ml反应体系(40mmoI/LTris-HCL缓冲液(pH8. 5)、2mmol/LMgC12、10mmol/L KHC03、2mmol/LPEP、0. 5mmol/L GSH、0. 15mmol/LNADH、过量苹果酸脱氢酶和适量酶液)，加入反应底物后立即用普析紫外分光光度计测定吸光值，15s为单位扫描3分钟，记录吸光度变化，重复3次；以每分钟吸光度变化O. 01为一个酶单位，酶活性以单位/藻粉/分钟表示。过量表达的pCAMBIA-PEPCl藻株与转空载体组相比，酶活明显增高，增高了145. 52% -193. 79% (图6);干涉表达的Maa7_PEPCl藻株与转空载体组相比酶活下降了34. 29% -53. 18% (图 10)。 以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
权利要求
1.一种莱茵衣藻三酰甘油合成限制基因CrPEPCl，其特征在于该基因是来源于莱茵衣藻，是下列核苷酸序列之一 1)序列表中SEQID NO : IDNA序列； 2)编码序列表中SEQID NO 2蛋白质序列的多核苷酸； 3)与序列表中SEQID NO :1限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
2.—种权利要求I所述的基因的编码蛋白，其特征在于是具有序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸残基序列的蛋白质，蛋白ID为80312，由484个氨基酸残基组成的蛋白质。
3.—种权利要求2所述的编码蛋白的衍生蛋白质，其特征是将SEQ ID NO :2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO :2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO :2衍生的蛋白质。
4.根据权利要求I所述的莱茵衣藻三酰甘油合成限制基因CrPEPCl，其特征在于该CrPEPCl基因应用于显著改变莱茵衣藻的中性脂含量和生物量及应用于新型高油脂含量藻株的培育。
全文摘要
本发明公开了一种莱茵衣藻三酰甘油合成限制基因CrPEPC1及其编码蛋白与应用，该基因是来源于莱茵衣藻，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO1DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。该基因的编码蛋白是具有序列表中SEQ ID NO2所示的氨基酸残基序列的蛋白质，蛋白ID为80312，由484个氨基酸残基组成的蛋白质。该CrPEPC1基因可应用于显著改变莱茵衣藻的中性脂含量和生物量，还可以应用于新型高油脂含量藻株的培育。并且本发明对于微藻的油脂代谢机理研究具有重要意义。
文档编号C12N1/13GK102660566SQ20121014323
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者罗秋兰, 蔡佳佳, 费小雯, 邓晓东 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所