专利名称：焦磷酸测序法检测他克莫司个体化用药基因多态性的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测他克莫司个体化用药基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术：
通过基因检测实现免疫抑制剂个体化基因导向治疗，是实现器官移植术后免疫抑制治疗成功的关键因素之一。他克莫司(Tacrolimus, FK605)为ー种新型强效免疫抑制剂，对T细胞具有选择性抑制作用，预防各种器官移植所出现的排斥反应的效果优于环孢菌素。其主要由CYP3A4，CYP3A5等代谢酶代谢，其中CYP3A5呈明显的多态性，其活性会显著影响他克莫司血浆及组织药物浓度，从而影响其疗效和不良反应发生率。CYP3A5*3突变等位基因导致CYP3A5酶活性缺失或下降，中国人群发生率约78%，其中突变型纯合子CYP3A5*3/*3约占全部人群的50%。研究表明，野生型或杂合型(*1/*3)CYP3A5可迅速代谢他克莫司，造成血药浓度下降，因而他克莫司所需的剂量在CYP3A5*1/*1和*1/*3人群中均显著高于CYP3A5*3/*3人群。研究也发现突变型纯合子CYP3A5*3/*3患者出现肾毒性等不良反应的风险是野生型(*1/*1)或杂合型(*1/*3)CYP3A5杂合子患者的2. 7倍。多药耐药基因MDRl (ABCBl)编码的转运体P_gp糖蛋白是药物跨膜转运泵，可以将药物由细胞内向细胞外泵出。因此当MDRl发生基因突变时，影响P-gp的表达和活性，进而可能改变细胞内和体内的血药浓度，影响药物的疗效和不良反应发生率。研究发现MDRl基因3435位C到T的突变，导致转运体活性下降，他克莫司及其代谢物从肾脏中排除减慢，发生肾毒性等不良反应的风险增加。而MDRl基因3435位的突变对他克莫司血药浓度的影响并不明显。综上所述，CYP3A5*3和MDRl基因多态性是影响他克莫司需求剂量差异性的主要因素，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测CYP3A5*3和MDRl基因多态性的试剂盒将为他克莫司的临床个体化治疗起到积极的推动作用。焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是ー种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
发明内容
CYP3A5*3 (rs776746)和 MDRl C3435T (rsl045642)基因多态性是影响他克莫司剂量个体差异的最主要因素。本发明提供一种检测影响临床他克莫司个体化用药治疗的用药基因CYP2D6 (SEQ ID NO. I)和SULTIAl (SEQ ID NO. 2)多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测他克莫司个体化用药相关基因SNP。 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为一种焦磷酸测序法检测他克莫司个体化用药基因多态性的试剂盒，包括如下引物
(1)扩增引物
CYP3A5*3 (rs776746)上游引物5Λ-ACG TAT GTA CCA CCC AGC TT -3, (SEQ IDNO. 3)；
MDRl C3435T (rsl045642)上游引物5、GCT GAG AAC ATT GCC TAT GGA -3^ (SEQID NO. 4)；
CYP3A5*3 (rs776746)下游引物5、GCC AGA CTT TGA TCA TTA TGT TA-3, (SEQ IDNO. 5)；
MDRl C3435T (rsl045642)下游引物5Λ - CAT GCT CCC AGG CTG TTT AT -3, (SEQ IDNO. 6)； 其中，下游引物的5,进行生物素标记；
(2)测序引物
CYP3A5*3 (rs776746)测序引物5r - AGA GCT CTT TTG TCT TTC A -3, (SEQ ID NO. 7)；MDRl C3435T (rsl045642)测序引物5、GGT GTC ACA GGA AGA GAT -3^ (SEQ IDNO. 8)；
试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。一种应用上述试剂盒检测他克莫司用药基因多态性的方法，包括如下步骤
(O DNA提取；
(2)聚合酶链反应
配制 50 μ I PCR 扩增体系，包含10 X PCR buffer 10. 0μ I, dNTP 3. O μ 1，上游引物I. O μ 1，下游引物I. O μ 1，rTaql.Oy 1，水30. Ομ 1，模板4. Ομ I ;按照下面的循环參数设置扩增仪95 oC 5min预变性;然后依次在95°C 30S, 52°C 30S, 67°C 30S,进行40个循环；再在72°C保持5min，最终保持在4 °e，得扩增产物；
(3)焦磷酸测序单链样本纯化；
(4)焦磷酸测序及结果分析。本发明的试剂盒对CYP3A5*3 (rs776746)目标序列和 MDRl C3435T (rsl045642)目标序列进行分析和检测；其中，CYP3A5*3 (rs776746)目标序列包括野生型TTGAAAGA(SEQ ID NO. 9)和突变型 CTGAAAGA (SEQ ID NO. 10)，扩增出的片段长度为 248bp ;MDR1C3435T (rsl045642)目标序列包括野生型 ATCGTG (SEQ ID NO. 11)和突变型 ATTGTG (SEQID NO. 12)，扩增出的片段长为145bp。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于对他克莫司个体化用药基因进行快速检测，可广泛应用于临床上他克莫司个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
图I为本发明CYP3A5*3 TT焦磷酸测序结果；
图2为本发明CYP3A5*3 CC焦磷酸测序结果；图3为本发明MDRl C3435T CC焦磷酸测序结果；
图4为本发明MDRl C3435T CT焦磷酸测序结果；
图5为本发明MDRl C3435T TT焦磷酸测序結果。
具体实施例方式下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。实施例I :
CYP3A5*3 (rs776746)上游引物5Λ-ACG TAT GTA CCA CCC AGC TT -3, (SEQ IDNO. 3)； MDRl C3435T (rsl045642)上游引物5Λ- GCT GAG AAC ATT GCC TAT GGA -3XSEQID NO. 4)；
CYP3A5*3 (rs776746)下游引物:5,-GCC AGA CTT TGA TCA TTA TGT TA-3乂SEQ ID
NO. 5)；
MDRl C3435T (rsl045642)下游引物5、CAT GCT CCC AGG CTG TTT AT -3^ (SEQID NO. 6)；
CYP3A5*3 (rs776746)测序引物:5,- AGA GCT CTT TTG TCT TTC A -3, (SEQ ID NO. 7)；MDRl C3435T (rsl045642)测序引物5、GGT GTC ACA GGA AGA GAT -3^ (SEQ IDNO. 8)；
I. DNA提取
I. I实验前试剂材料准备与检查工作如下
(I)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer I和2中已添加こ醇，并在瓶上相应标识处打勾V ； (2)异丙醇(如无，可用无水こ醇替代)和75%こ醇；(3)高压灭菌有效期内的I. 5mL Eppendorf管和各类移液枪头。I. 2从4°C冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；
I. 3在I. 5mL Eppendorf管对应标本卩隹一性标识做好标记；
I. 4 分别移取 900uL Cell Lysis Solution 加至灭菌的 I. 5mL Eppendorf 管；
I. 5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；
I. 6盖上Eppendorf管盖，室温孵育IOmin ；
I. 713, OOOrpm室温离心20秒；
I. 8取出Eppendorf管,观察白色沉淀；
I. 9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管ロ弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；
I. 10盖上Eppendorf管,用手指弹击EP管底部,使白色沉淀重悬；
1.11移取30011しNuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；
I.12 打开 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，盖上管管,振荡器上剧烈振荡20秒；13，OOOrpm室温离心3min ；
I.13移取上清转移到新的已灭菌I. 5mL Eppendorf管；
I.14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；
I. 15 13, OOOrpm 室温离心 Imin ；
I. 16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管ロ弃去上清；
I. 17移取300uL 75%こ醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；
I. 18 13, OOOrpm 室温离心 Imin ；
I. 19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管ロ弃去上清；
I. 20在实验台上放置新滤纸,倒扣Eppendorf管，吸干液体,将Eppendorf管开盖侧放风干；
I.21目测沉淀大小，加入50 IOOul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度測定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入こ醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；
1.24保存核酸标本至4°C冰箱；
2.聚合酶链反应
2.I在试剂准备区配制50 μ I PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表
权利要求
1.一种焦磷酸测序法检测他克莫司个体化用药基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物 (1)扩增引物 上游引物:5,-ACG TAT GTA CCA CCC AGC TT-3,； 5、GCT GAG AAC ATT GCC TAT GGA -3 ^ ； 下游引物:5,-GCC AGA CTT TGA TCA TTA TGT TA-3,； 5,- CAT GCT CCC AGG CTG TTT AT -3,; 其中，下游引物的5'进行生物素标记； (2)测序引物5r~AGA GCT CTT TTG TCT TTC A -3,； 5r~ GGT GTC ACA GGA AGA GAT -3^。
2.一种应用权利要求I所述的试剂盒检测他克莫司个体化用药基因多态性的方法，包括如下步骤 (1)DNA 提取； (2)聚合酶链反应 配制 50 ill PCR 扩增体系，包含10 X PCR buffer 10. Ou I, dNTP 3. Oyl，上游引物l.Oul,下游引物 l.Oul, rTaql. OiU，水 30. OiU，模板 4. OiU ;循环程序为95 oC 5min预变性；依次在95°C 30S,52°C 30S,67°C 30S，进行40个循环;72°C保持5min，最终保持在4 °e，得扩增产物； (3)焦磷酸测序单链样本纯化； (4)焦磷酸测序及结果分析。
全文摘要
本发明公开了一种焦磷酸测序法检测他克莫司个体化用药基因的多态性试剂盒及方法。具体是指CYP3A5*3(rs776746)和MDR1(rs1045642)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQIDNO.3—8所示的引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量CYP3A5*3(rs776746)和MDR1(rs1045642)的检测，从而达到对他克莫司用药实现安全合理有效的个体化给药。
文档编号C12Q1/68GK102703585SQ201210135368
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者周宏灏 申请人:周宏灏