专利名称：一种食甲醇芽孢杆菌及其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵领域，具体地涉及一种食甲醇芽孢杆菌及其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法。
背景技术：
香兰素(Vanillin)，又名香草醛、香兰醛等，是香荚兰豆中的主要成分，化学名为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，相对分子量为152. 15。香兰素外观为白色至微黄色针状结晶或粉末，呈香荚兰豆特有的香气，微甜，在潮湿的空气中缓慢氧化为香兰酸。
香兰素是世界上产量最大、用途最广的香料之一，被誉为“香料之王”，广泛应用于巧克力、冰淇淋、糖果等食品以及香烟、饮料和高档化妆品中。它不仅可以用作增香剂和定香剂，还在食品中用作防腐剂、保鲜剂和抗氧化剂。香兰素的世界年消费量约I. 2万吨，而天然香兰素的产量仅为1800吨，因此远不能满足需求。目前常用的香兰素生产方法有植物原料提取法和化学合成法。香兰素在香荚兰豆中含量约为15_20g/kg。香荚兰种植受地域和气候环境的限制产量极少，且在种植过程中需要对花朵进行人工授粉、劳动强度大，难以进行大规模栽种，远远不能满足市场的需求。目前市场上绝大多数的香兰素产品是通过化学合成的，常用合成底物包括丁香酚、木质素、乙醛酸和愈创木酚等。国内常用的是采用愈创木酚和乌洛托品反应的亚硝化工艺，该方法路长，分离过程复杂，收率低，环境污染严重，原料消耗高，国外早已被淘汰。国外主要采用愈创木酚和乙醛酸缩合工艺，该工艺设备简单，产物纯度高，原料来源广泛，但是存在严重的缺陷，比如环境污染严重，产品香气单一，易掺杂质，合成香兰素的安全性也受到质疑。香兰素的生物合成方法主要有微生物发酵、酶工程、细胞工程等，与化学合成相t匕，生物法合成香兰素具有反应条件温和，副产物少，提取步骤简单，生产清洁，环境污染低，产品安全可靠等优点。但是综合考虑技术可行性、经济性、安全性等因素，微生物发酵法被认为是目前最实际的天然香兰素制取方法。许多天然物质如阿魏酸、1，2_二苯乙烯酚、丁香酚、木质素、异丁香酚等都可以作为生物转化生产香兰素的前体物质。关于用多种微生物发酵法将阿魏酸转化为香兰素已有报道。如1996年Rabenhorst 报道 Streptomyces setonii ATCC39116 和 1998 年 A. Muheim 报道的Amycolatopsis sp. HR167,香兰素浓度分别达到12g/L和11. 5g/L,且培养基成分较为复杂,生产成本较高,副产物较多包括香兰酸、香兰醇和愈创木酚等,给产品分离提取带来了相当的困难。
发明内容
本发明提供了一种食甲醇芽孢杆菌，该菌株名为Bacillus methylotrophicusVJ4-1，于2012年I月16日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M2012004，其生物学特征是是革兰氏阳性菌，能在10% NaCl中生长，有精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶活性，能产酸、使牛奶液化；能以N-乙酰葡萄糖胺、甘露醇、葡萄糖、水杨素、D-蜜二糖、D-核糖、肌醇、蔗糖、麦芽糖、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、DL-乳酸盐、L-丙氨酸糖原、L-脯氨酸组氨酸、柠檬酸盐为碳源的培养基上生长，其16S rRNA序列与Bacillusmethylotrophicus的16S rRNA序列比对相似性达到100*%。本发明利用食甲醇芽孢杆菌在是生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法，其方法涉及的步骤如下(I)斜面培养将食甲醇芽抱杆菌 Bacillus methylotrophicus VJ4-1CCTCC M2012004接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25 35°C、pH5 9条件下，静置培养24 72小时后,置于冰箱中；(2)制备种子培养液用步骤(I)所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25 35°C条件下，100 150rpm振荡培养24h 72h，连续转接I 4次，制得种子培养液； (3)发酵使用步骤(2)所得的种子培养基，按体积百分比2 20%的接种量接入发酵培养基，在30 40°C条件下，100 200rpm振荡培养24 72h ；(4)转化使用步骤(3)所得的发酵液，加入5 13. 3g/L的阿魏酸，在30 40°C条件下，100 200rpm避光振荡培养6 12天后停止。进一步，所述斜面培养基马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L ;种子液培养基组成为麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。再进一步，所述发酵培养基的组成为碳源谷壳5 20g/L，氮源豆柏I 3g/L，氯化钠0. 5 I. 5g/L，七水硫酸亚铁0. 01 0. 05g/L,磷酸氢二钾0. 5 I. 0g/L、七水硫酸镁0.5 1.0g/L，调节 pH 至 6 10。再进一步，所述碳源为淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麦芽糖、麦芽浸粉、麸皮和谷壳任选其一，所述碳源优选谷壳。(I)不同碳源发酵生产天然香兰素的产量以高氏一号培养基为基础培养基，固定氮源和无机盐，分别以淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麦芽糖、麦芽浸粉、麸皮和谷壳作为碳源，浓度均为20g/L。由图I可知，不同碳源与麸皮比较发酵生产香兰素的产量，由高到低依次是谷壳、麸皮、鹿糖、淀粉、麦芽浸粉、麦芽糖、葡萄糖和果糖。缓效碳源比速效碳源更易于香兰素的产生，缓效碳源中的谷壳由于其中含有生长因子而比单一碳源更易于香兰素的产生。再进一步，所述氮源为酵母粉、黄豆饼粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、动物蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵和豆柏任选其一，所述氮源优选谷壳。(2)不同氮源发酵生产天然香兰素的产量以高氏一号培养基为基础培养基，碳源和无机盐不变，分别以酵母粉、黄豆饼粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、动物蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵和豆柏作为氮源，浓度均为lg/L。由图2可知，不同氮源对香兰素产量的影响有高到低依次是豆柏、黄豆饼粉、牛肉膏、蛋白胨(Arg)、酵母粉、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵。由图2可看出无机氮源不利于香兰素的产生，有机氮源更利于香兰素的产生。以豆柏作为氮源比其他氮源产生的香兰素更多。再进一步，所述pH优选为10。(3)不同发酵培养基初始pH值下天然香兰素产量使用优化后的培养基碳、氮、无机盐组成，配制成pH值为3. 0至11. 0九种培养基，筛选出产香兰素浓度最高的发酵培养基pH值。由图3可以看出，pH值3. 0,4. 0,11. 0时，由于强酸性和强碱性影响，香兰素产量较低；在碱性条件下，PH值在8. 0至10. 0之间都具有相对较高的产量，说明该菌在碱性条件下更适合阿魏酸转化为香兰素。其中在PH值为10. 0
时香兰素的产量最高。 再进一步，所述发酵温度优选为40°C。(4)不同发酵温度下天然香兰素的产量使用优化后的培养基，pH调至10. 0，选择温度为30°C至40°C之间进行优化。由图4可以看出，当温度在30°C至40°C之间时，香兰素的产量逐渐升高，当发酵温度为40°C时香兰素的产量最高，此温度下适宜菌体酶活与菌种生长。再进一步，发酵转速优选为lOOrpm。(5)不同发酵培养转速下生产天然香兰素的产量以优化后的最佳培养基组成、初始pH值、发酵温度、接种量、底物添加量和底物添加时间为基础，选择发酵转速为lOOrpm、150rpm、200rpm三种转速进行比较。根据图5可以看出，当转速在IOOrpm至200rpm之间时，随着转速的增加，香兰素的产量和转化率降低。所以当发酵转速为IOOrpm时,香兰素的产量最高。再进一步，发酵过程优选为光照条件。(6)发酵过程光照/避光生产天然香兰素的产量通过对比在光照和避光条件下香兰素的浓度来确定光照对菌种转化阿魏酸生成香兰素的影响。根据图6可以看出，在光照条件下香兰素的产量较高。不同发酵培养条件下生产天然香兰素的产量(I)接种量、底物添加量和底物添加时间对香兰素产量的影响以优化得到的培养基为基础，pH调至10. 0，培养温度为40°C。用正交试验来优化接种量、底物添加量和底物添加时间，选取L9(34)正交表，其因素和水平设计见表3，试验结果见表4。由表4的结果及方差分析可见，三个因素对香兰素产量的影响顺序为阿魏酸加入量 > 阿魏酸加入时间> 接种量，即阿魏酸加入量的对香兰素产量影响最大，接种量对香兰素产量影响最小。根据表I的结果可知最佳组合为A1B3C3 :接种量5mL，底物添加量20mL，底物添加时间24h。表I.正交设计因素和水平表
水平接种量(％)阿魏酸加入时间阿魏酸加入量 _(h)_(g/L)_I10722.7
220 48 5
_3_2_24__表2.正交设计实验表和结果分析
权利要求
1.一种食甲醇芽孢杆菌，该菌株名为Bacillus methylotrophicus VJ4-1,保藏编号CCTCC NO :M2012004，食甲醇芽孢杆菌 Bacillus methylotrophicus CCTCC NO M 2012004的生物学特征是是革兰氏阳性菌，能在10% NaCl中生长，有精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶活性，能产酸、使牛奶液化；能以N-乙酰葡萄糖胺、甘露醇、葡萄糖、水杨素、D-蜜二糖、D-核糖、肌醇、蔗糖、麦芽糖、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、DL-乳酸盐、L-丙氨酸糖原、L-脯氨酸组氨酸、朽1檬酸盐为碳源的培养基上生长，其16S成應序列与1^0；[11118 methylotrophicus的16S rRNA序列比对相似性达到100%。
2.一种食甲醇芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法，其方法涉及的步骤如下 (1)斜面培养将食甲醇芽孢杆菌Bacillusmethylotrophicus CCTCC M2012004接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25 35°C、pH5 9条件下，静置培养24 72h ； (2)制备种子培养液用步骤(I)所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25 35°C条件下，100 150rpm振荡培养24h 72h，连续转接I 4次，制得种子培养液； (3)发酵使用步骤(2)所得的种子培养基，按体积百分比2 20%的接种量接入发酵培养基，在30 40°C条件下，100 200rpm振荡培养24 72h ； (4)转化使用步骤(3)所得的发酵液，加入5 13.3g/L的阿魏酸，在30 40°C条件下，100 200rpm振荡培养6 12天后停止。
3.根据权利要求2所述的一种食甲醇芽孢杆菌在是生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法，其特征在于所述斜面培养基马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L ;种子液培养基组成为麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
4.根据权利要求2所述的一种食甲醇芽孢杆菌在是生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法，其特征在于所述发酵培养基的组成为碳源5 20g/L，氮源I 3g/L，无机盐0. 5 I. 5g/L，七水硫酸亚铁0. 01 0. 05g/L,磷酸氢二钾0. 5 I. 0g/L、七水硫酸镁0.5 I. 0g/L，调节 pH 至 6 10。
5.根据权利要求4所述的发酵培养基，其特征在于所述碳源为淀粉、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麦芽糖、麦芽浸粉、麸皮和谷壳任选其一。
6.根据权利要求5所述的碳源，其特征在于所述碳源为谷壳。
7.根据权利要求4所述的发酵培养基，其特征在于所述氮源为酵母粉、黄豆饼粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、动物蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵和豆柏任选其一。
8.根据权利要求7所述的氮源，其特征在于所述氮源为谷壳。
9.根据权利要求4所述的发酵培养基，其特征在于所述pH为10，发酵温度为40°C，发酵转速为IOOrpm，发酵过程为光照条件。
全文摘要
本发明公开了一种食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1，该菌株名为Bacillus methylotrophicus VJ4-1，于2012年1月16日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号CCTCC NOM 2012004，利用该菌株生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法。本发明的优点产量较高，方法工艺过程简单，反应条件温和，环境污染小，产物浓度较高，提取步骤简单，生产清洁，产品环境友好，安全可靠。主要原料来源广泛，成本极为低廉，具有天然性和工业化生产前景。
文档编号C12N1/20GK102747008SQ20121011390
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月23日 优先权日2012年7月23日
发明者喻林, 宋旭艳, 李丹, 王洁, 罗诚浩, 陈勇, 魏敏 申请人:湖北中烟工业有限责任公司