专利名称：一种检测肺炎支原体的lamp试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及一种检测肺炎支原体的环介导等温扩增技术(LAMP)试剂盒。
背景技术：
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)是引起人类呼吸道感染的重要病原菌，约10% 40%的社区获得性肺炎(CAP)是由Mp感染引起的。婴幼儿由于免疫功能相对低下，更容易引起重症Mp感染，甚至引起肺炎支原体脑炎等严重感染。近几年国内报道的Mp感染引起的肺炎发病率比重不断升高，给社会造成的疾病负担日趋明显。鉴于肺炎支原体分离培养困难，目前其检测方法主要依靠血清学检测和核酸检测。由于血清学技术主要针对抗体进行检测，有明显的滞后性，且受个体免疫差异影响大，所以检测灵敏度和特异度较差。随着分子生物学的发展，目前已有多种PCR方法用于肺炎支原体的检测，包括普通PCR，巢式PCR，荧光PCR等，这些虽在灵敏度方面有所改进，但由于核酸检测需要较严格的检测环境，需要精密仪器的配套使用，检测费用较高，同样也无法满足基层和现场检测的需求。环介导等温核酸扩增技术(loop-mediatedisotherm amplification,LAMP)是由Notomi于2000年开发的一种新型的恒温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)和两对特殊的引物,特异地识别祀序列上的6个独立区域,在等温条件下(65°C左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Hong TC等人(2004)根据LAMP的原理设计了实时定量LAMP方法，以快速检测SARS-CoV，结果LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人(2007)建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的LAMP检测体系。LAMP还可以检测细菌、真菌等病原微生物，其灵敏度和特异性都有很好的体验。但目前尚未见基于颜色判定的LAMP方法在肺炎支原体检测中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测肺炎支原体的特异性LAMP引物组。本发明另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、可视化的、操作简单的LAMP检测试剂盒。本发明提供了一种用于检测肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的祀序列，其具有SEQ ID NO. 5所示的序列或其特异性片段。本发明提供了用于扩增SEQ ID NO. 5所示靶序列的特异性引物组合。本发明提供了一种用于检测肺炎支原体的特异性LAMP引物组合，包括以下4条引物F3 :5，-TCTTACCACTGTTAACGGCC-3，；
B3 :5， -CCGCTTTGGTCAACACATCA-3，；FIP :5’ -ACGGCAACACGTAATCAGGTCATCCAGTCAAGGTCCCCAA-3’ ；BIP :5’ -AGGACTTGCCATTGGAATCCCAGATAGCGCAAACCCAG CC-3，。本发明提供了上述引物组在制备肺炎支原体的检测试剂盒或检测试剂中的应用。本发明提供了一种含有上述4条引物的检测试剂。本发明提供了一种含有上述4条引物的肺炎支原体的LAMP检测试剂盒。本发明的试剂盒还包含变色指示剂羟基萘酚蓝(HNB)。本发明还提供了上述试剂盒在检测肺炎支原体中的应用。上述试剂盒在检测肺炎支原体中的应用中，25 ii L LAMP检测体系的具体配置为IOmM dNTP 混合溶液 2. 5 ill，3mM 羟基萘酚蓝 I yl，4M 甜菜碱 I yl，8U/ Bst 酶 I ，IOXBst buffer2. 5u I, IOu M F3 引物 0. 5 y 1，10 y M B3 引物 0. 5 y 1，100 y M FIP 引物
0.4u l,100uM BIP 引物 0. 4iil，150mM 硫酸镁 liil，去核酸水 13. 2 yl，模板 I yl。进一步地，检测反应条件为63°C恒温lh，85°C 3min，然后终止反应。本发明试剂盒还包含阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为去核酸水，所述阳性对照为肺炎支原体基因组DNA。每次检测标本时必须设立NEG对照(阴性对照)和POS对照(阳性对照)，两种对照对于结果判读起决定性作用有效扩增NEG(_)和P0S(+)无效扩增NEG(+)和POS (+)提示体系污染无效扩增NEG(-)和POS (-)提示体系错误或者试剂失效。只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。结果判定方法为反应结束后，肉眼直接观测反应管，深蓝色体系为阴性结果(图I右)，天蓝色体系为阳性结果(图I左)。本发明的肺炎支原体LAMP检测试剂盒对20种呼吸道常见菌株进行检测用于评价该试剂盒的特异性，同时对肺炎支原体进行检测下限的确定。结果显示，利用该方法检测59株肺炎支原体均阳性，其余20种非肺炎支原体和人类染色体均扩增阴性，说明该方法的灵敏度、特异性良好，达100%。在对纯菌检测中，本发明LAMP试剂盒的最低检测限为100个拷贝，说明本发明的检测试剂盒具有很高的灵敏度。本发明提供的试剂盒使用颜色变化代替浊度变化判定结果，易于观察；使用的变色指示剂为羟基萘酚蓝(HNB)价格便宜，比使用荧光指示剂的LAMP反应更加经济实惠；且变色指示剂HNB性质稳定，在反应前添加，避免了荧光指示剂在检测后打开反应管添加，增加了污染的可能性。本发明LAMP检测试剂盒检测肺炎支原体整个试验只需要Ih左右即可，相对于常规PCR反应要2 4h才能完成检测，大大缩短了检测时间，本发明试剂盒可快速、灵敏地检测出肺炎支原体，其操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于疾病监测、现场应急以及临床标本的检测，易于大范围推广应用。
图I为体系检测结果判定；体系检测结果判定。反应结束后肉眼根据体系颜色直接判定实验结果，天蓝色(左图)为阳性，深蓝色(右图)为阴性。图2为体系检测限评价，以肺炎支原体标准菌株ATCC15531模板系列浓度梯度I拷贝/ U I-IO5拷贝/ U I为模板，每个浓度梯度取I U I检测，其中0-2为深蓝色,3-7为天蓝色。0 :阴性对照；1 :1拷贝；2 :10拷贝；3 : IO2拷贝；4 : IO3拷贝；5 : IO4拷贝；6 : IO5拷贝；7 :阳性对照。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例I引物的设计本发明首先在国内分离到60株肺炎支原体临床株，并将这60株肺炎支原体的Pl基因全长进行扩增测序。通过对60株国内肺炎支原体pi基因和NCBI数据库已报道的pi基因序列比对，选取pi基因中最为保守的区域使用Primer Explorer V3软件设计特异性引物。该保守区域的特异性靶序列如SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列。设计4条引物，包括两条内引物(FIP和BIP)和两条外引物(F3和B3)，其核酸序列如下F3 :5， -TCTTACCACTGTTAACGGCC-3，；B3 :5， -CCGCTTTGGTCAACACATCA-3，；FIP :5，-ACGGCAACACGTAATCAGGTCATCCAGTCAAGGTCCCCAA-3，；BIP :5，-AGGACTTGCCATTGGAATCCCAGATAGCGCAAACCCAGCC-3，。 实施例2肺炎支原体LAMP检测方法的建立通过设置不同浓度的MgS04(150mM) 0 U 1,0. 5 U I, I U I, I. 5 U I, 2 U I ;不同浓度的甜菜碱(4M) 0u l,lu l,2u l,4u l,8u l,16u I ;以及实施例I得到的4个引物浓度，FIP/BIP 引物(IOOuM) 0. 2u 1,0. 4u 1,0. 8u I, I. 6u I ；F3/B3 引物(IOuM) 0. 5u I,l.Ou l,1.5u l,2.0u I0其它条件选择实验过程的优选试验条件。分别在不同的温度(61°〇至65°0反应lh，85°C 3min，终止反应，由于在65°C反应Ih的条件下扩增最快，优选在此条件下进行反应。在63°C反应lh，85°C 3min，对不同浓度的MgSO4、Betaine和内外引物浓度比例的反应体系进行优化反应，最终通过对含有IO3拷贝的肺炎支原体标准菌株ATCC15531模板扩增效果作为反应的最终浓度，结果为，FIP/BIP引物终浓度为I. 6uM，F3/B3引物终浓度为
0.2u MjMgSO4终浓度为6mM，甜菜碱终浓度为0. 16M时体系扩增效果最好，体系优化可参见表I,表2。表ILAMP扩增体系硫酸镁与甜菜碱试剂浓度优化
硫酸镁 MgSO4 (150mM)
0[jl 0.5[j,l I^il 1.5(^1 2\A 0[j,l - - - - - 甜菜减 I^il__-__±__+__±__-_
权利要求
1.一种用于检测肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的祀序列,其具有SEQ ID NO. 5所示的序列或其特异性片段。
2.用于扩增权利要求I所述靶序列的特异性引物组合。
3.如权利要求2所述的特异性LAMP引物组合，包括以下4条引物F3 :5’ -TCTTACCACTGTTAACGGCC-3’ ；B3 :5’ -CCGCTTTGGTCAACACATCA-3’ ；FIP :5’ -ACGGCAACACGTAATCAGGTCATCCAGTCAAGGTCCCCAA-3’ ；BIP :5’ -AGGACTTGCCATTGGAATCCCAGATAGCGCAAACCCAGCC-3’。
4.权利要求3所述的引物组在制备肺炎支原体的检测试剂盒或检测试剂中的应用。
5.一种含有权利要求3所述引物组的检测试剂。
6.一种含有权利要求3所述引物组的肺炎支原体的LAMP检测试剂盒。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包含变色指示剂羟基萘酚蓝。
8.权利要求6或7所述的试剂盒在检测肺炎支原体中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，25ii L LAMP检测体系的具体配置为IOmMdNTP 混合溶液 2. 5iil，3mM 羟基萘酚蓝 liil，4M 甜菜碱 liil，8U/iil Bst 酶 I yl，IOXBstbuffer2. 5u I, IOu M F3 引物 0. 5 y 1，10 y M B3 引物 0. 5 y 1，100 y M FIP 引物 0.4 yl，100 ii M BIP 引物 0. 4 iil，150mM 硫酸镁 Iu I,去核酸水 13. 2u I,模板 Iul0
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，检测反应条件为63°C恒温lh，85°C3min,然后终止反应。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测肺炎支原体的LAMP试剂盒，所述试剂盒包含有4条LAMP引物，与LAMP反应液一起构成检测体系，本发明的4条LAMP引物的核苷酸序列如SEQID No.1-4所示。本发明的试剂盒可快速、灵敏地检测肺炎支原体，最低检测限为100个拷贝。本发明试剂盒使用方法简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于疾病监测、现场应急以及临床标本的检测，易于大范围推广应用。
文档编号C12R1/35GK102618655SQ201210112439
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月16日 优先权日2012年4月16日
发明者何利华, 孟凡亮, 张建中, 肖迪, 赵飞, 陶晓霞, 顾一心 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所