专利名称：一种检测人寿命的试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及SNP领域，特别涉及与人类寿命相关的SNP。
背景技术：
SNP,单核苷酸多态性，是指染色体DNA序列的某个位点上的单个碱基(A，T，C或者G)发生的变异，是继限制性片段长度多态性(RFLP)和微卫星多态性这两种遗传标记之后出现了第三代遗传标记。SNP分布广泛、数目多且相对稳定地存在人类染色体上，与许多生物性状的改变直接相关。现有的许多调查显示，人类基因组中存在与人寿命相关的SNP。在动物试验模型中，很多单基因的变异都能够导致动物模型寿命的改变；然而自然界中人类和动物的寿命则表现出非常复杂的特性。近年来，有关长寿基因的研究是生命科学领域的热点之一，候选基因筛查和全基因组扫描分析都被用于长寿基因及位点的鉴定。目前公认的与长寿相关的位点区域有三个AP0E、F0X03A和AKT1，这三个位点在多个独立人群试验中均得到了证实。全基因组扫描分析也鉴定了一些与长寿相关的位点区域4q25、3p24-22、9q31-34、12q24等，但这些位点在多个独立人群中没有得到验证。由于基因存在一定程度上的遗传异质性，国外报道的与人寿命有关的SNP不一定存在于中国人的基因组中。因此，对我国的长寿人群进行深入研究，以发现中国人的长寿基因，对于提升国民身体素质、改善国民生活质量具有重大意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了检测人类寿命长短的方法。本发明提供了一种检测人寿命的试剂盒，它包括任选的用于检测T0MM40基因rs2075650变异和/或HLA-DPB2基因rs4713607变异的相关试剂。所述的试剂盒，包括检测T0MM40基因rs2075650G — A变异和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A变异的试剂；所述的试剂盒还包括任选的用于扩增包含T0MM40基因rs207565和/或HLA-DPB2基因rs4713607的基因片段的试剂。上述检测T0MM40 基因 rs2075650G — A 变异和 / 或 HLA-DPB2 基因 rs4713607G — A变异的试剂为Snapshot试剂。上述检测T0MM40 基因 rs2075650G — A 变异和 / 或 HLA-DPB2 基因 rs4713607G — A变异的试剂为测序用试剂、限制性片段长度多态方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。本发明还提供T0MM40基因rs2075650变异和/或HLA-DPB2基因rs4713607变异在制备用于检测人寿命的试剂中的用途。所述的试剂包括检测T0MM40基因rs2075650G — A变异和/或HLA-DPB2基 因rs4713607G — A变异的试剂；所述的试剂还包括任选的用于扩增包含T0MM40基因rs207565和/或HLA-DPB2基因rs4713607的基因片段的试剂。
上述检测T0MM40 基因 rs2075650G — A 变异和 / 或 HLA-DPB2 基因 rs4713607G — A变异的试剂为Snapshot试剂。上述检测T0MM40 基因 rs2075650G — A 变异和 / 或 HLA-DPB2 基因 rs4713607G — A变异的试剂为测序用试剂、限制性片段长度多态方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。本发明的测定方法测定来源于人的基因组DNA，样品没有限制，如体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等，通过提取和纯化这些样品均可制备基因组DNA。本发明首次阐明了 T0MM40基因rs2075650位点和HLA-DPB2基因rs4713607位点多态性与长寿的相关性。使用本发明提供的试剂盒，可以预测待检人群寿命长短的倾向，对控制人类衰老的进程有重要作用。待检人群的T0MM40基因rs2075650位点若为A等位基因，他们长寿的可能性增加2. 12，HLA-DPB2基因rs4713607位点若为A等位基因，他们长寿的可能性增加I. 30倍。染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点，SNP在人群中只有两种等位型，故亦称为双等位标记，其检测是一种或“全/无”的检测方式。SNP的检测方法多种多样，可分为测序法、杂交法、溶解法、电泳法、化学法、酶学法、物理法以及它们的组合方法，这些方法均是检测核苷酸变异的常规实验手段。这些方法中，测序法可以确定SNP位点的碱基类型，其他方法均仅能判断SNP的有无。本发明公开了 T0MM40基因rs2075650位点变异和HLA-DPB2基因rs4713607位点变异的碱基类型，且T0MM40基因和HLA-DPB2基因的序列已知，用现有检测核苷酸变异的方法均可以检测上述两个位点的多态性。
图I是Snapshot检测SNP rs2075650位点的基因分型图谱图2是Snapshot检测SNP rs4713607位点的基因分型图谱
图3是通过PCR扩增含有所检测的SNP位点的DNA片段的反应条件 图4单碱基引物延伸反应的反应条件
具体实施例方式以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。用于下列实施例中表示试剂均为市售品，其英文缩写如下。需要时，用高压锅(120°C，20分钟)灭菌EDTA 乙二胺四乙酸二钠SDS :十_■烧基硫酸纳TE IOmM Tris-HCl (pH7. 5)、ImM EDTA (pH8. 0)dNTP :脱氧核苷三磷酸实施例I样本收集和基因组DNA的提取样本是由四川省医学科学院 四川省人民医院人类疾病基因研究四川省重点实验室收集。共计收集95岁以上长寿样本233例，平均年龄99. 7±6. I岁，其中男性占41. 2%；对照样本669例，平均年龄53. 2±9. 2岁，其中男性占42. 9%。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到了伦理委员会批准。 根据下列方法，用人外周血制备基因组DNA。在抗凝剂EDTA存在下，将收集的5ml人外周血在3000rpm离心分离30分钟除去血清。接着加入0. 2% NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟。此后，在3000rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物。用0.2%的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤。在如此获得的沉淀物中，加入IOmM Tris-HCl (pH8. 0)和IOmM EDTA(4ml)，以悬浮该沉淀物。将10%SDS, 25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16 y I和20 yl，接着上下颠倒悬液轻轻混合。然后，在37°C过夜温育悬液。过夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm离心分离10分钟除去水层。将水层和4ml酹/氯仿溶液混合,接着逆混合并以3000rpm离心分离10分钟，除去水层。最后,用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10，3M NaAC (pH5. 2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀。用70%的乙醇洗涤以获得基因组DNA。最后将所得的基因组DNA溶解于TE中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率，DNA工作液浓度校正至50ng/yl，置_20°C冰箱保存。实施例2 T0MM40基因rs2075650位点和HLA-DPB2基因rs4713607位点多态性的分析T0MM40基因rs2075650和HLA-DPB2基因rs4713607单核苷酸多态性的基因型分析可以用现有的SNP检测手段进行检测，如，测序方法、限制性片段长度多态性分析方法、单链构象多态性分析方法，Snapshot检测方法等。本发明采用Snapshot基因分型技术对rs2075650和rs4713607两个位点的单核苷酸多态性进行检测。实验步骤如下I、PCR :95°C变性5分钟；95°C 30秒、55°C退火30秒、72°C延伸45秒，35个循环；72°C延伸7分钟，4°C保温。2、纯化I =PCR产物各取3 ill (另加3 U I ddH20补足9 U I),加入混合液3 U I (SAP2 iil，I 10Exo I 酶 I ill)。I : IOExol 酶的配制方法I 体积 Exol 酶，I 体积 SAP IOXbuffer,8 体积 ddH20。程序37°C Ih, 75°C 15min。3、Snapshot 反应Snapshot Multiplex I U I, PCR 纯化产物 I U I, Snapshot 引物每个为 0. 2u I, ddH20 补足 I。程序96°C I 分钟，96°C 10 秒，50°C 5 秒，60°C 30 秒，25个循环，4°C保温。4、纯化2 :每个反应加SAP 0. 5-l.OiU，程序:37°C I小时，75°C 15分钟，4°C保温。5、liU上述产物加9iU HD。程序95°C，5分钟，迅速置于冰上，冷却后上机检测。PCR 引物对 A(rs2075650)F:5，-GTGGCAGTGAGATTTGAGCA-3’R:5， -TGGGTAAGGACACCAGGAAG-3，PCR 引物对 B (rs4713607)F:5，-TTCTCAGATGGTTCCCTTGG-3’R:5， -TGAAAGAATGGGGACGAAAG-3，
所得到的扩增序列如下序列I (rs2075650) 282bp GGCAGTGAGATTTGAGCAagcaaaggccctggccctgtctaactaggctgtactgcctctttacaggtggaatcctttgtgagatgttctgctgtgggtctctggagagagctgggggtggtagggaaggaagagatgagagtt
ggtgtggggttgg ；|G/^ gtggagtgtgacagcgtttctcttctccagagctgtttcccattcagatggagggtgt
caagctcacagtcaacaaagggttgagtaaccattttcaggtgagcCTTCCTGGTGTCCTTACCCA
序列2 (rs4713607) 297bp TTCTCAGATGGTTCCCTTGGaaattgcctttctaattctgggggattattttctataggcctacctgatatgcctatttaaaaagctgggctgatcttaca IG/N tgcttgcaaaggtttagtaaaaaagccatgcccttgtgcaaaagaaaatgagtcacttttctcttcaaagtcctgaggttaaaggagttccagtgtttcagagtgcactccagaggggtgcaag ctgaagctggtctgtcacccatctagaaaaagaagtgagaataaaagtatcCTTTCGTCCCCATTCTTTCASnapshot 引物 ICrs2O7565O)5， -GAGAGTTGGTGTGGGGTTGG-3’Snapshot 引物 II (rs4713607)5’ -ACCTGATATGCCTATTTAAAAAGCTGGGCTGATCTTACA-3’图I 图2为Snapshot检测rs2075650和rs4713607的基因型图。实施例3 T0MM40基因rs2075650位点和HLA-DPB2基因rs4713607位点多态性与长寿的相关性统计方法利用SPSS 13. 0软件进行分析,检验Hardy-Weinberg平衡检测,数量变量采用t检验，质量变量采用卡方检验。双侧P <0.05认为统计学的差异显著。结果如下I)入选样本基本临床资料
临床资料对照__长寿人群
人数169" 233
~^龄53.2±9.2 99.7±6.1**注**，P<0.01。2) SNP位点多态性与长寿密切相关rs2075650
/Utr 基因型等位基因频率出 分组---G A -- P 值 OR 值(95%CI)
GG AG AA____G__A___
对照 12 125 532 149 1189 0.111 0.889
--------0.00048 2.12 (1.38-3.26)
长寿 0 丨 26 丨 207 丨 26 丨 440 0.056 0.944 __rs2075650的A等位基因可使长寿的可能性显著增加(0R = 2. 12，95 % Cl =I. 38-3. 26)，即长寿可能性增加2. 12倍。见图I。rs4713607
权利要求
1.一种检测人寿命的试剂盒，其特征在于它包括任选的用于检测T0MM40基因rs2075650变异和/或HLA-DPB2基因rs4713607变异的相关试剂。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于它包括检测T0MM40基因rs2075650G — A变异和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A变异的试剂；还包括任选的用于扩增包含T0MM40基因rs207565和/或HLA-DPB2基因rs4713607的基因片段的试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的检测T0MM40基因rs2075650G — A变异和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A变异的试剂为Snapshot试剂。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的检测T0MM40基因rs2075650G — A变异和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A变异的试剂为测序用试剂。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的检测T0MM40基因rs2075650G — A变异和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A变异的试剂为限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。
6.T0MM40基因rs2075650变异和/或HLA-DPB2基因rs4713607变异在制备用于检测人寿命的试剂中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述的试剂包括检测T0MM40基因rs2075650G — A变异和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A变异的试剂；所述试剂还包括任选的用于扩增包含T0MM40基因rs207565和/或HLA-DPB2基因rs4713607的基因片段的试剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于所述的检测T0MM40基因rs2075650G— A变异和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A变异的试剂为Snapshot试剂。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于所述的检测T0MM40基因rs2075650G— A变异和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A变异的试剂为测序用试剂。
10.根据权利要求7所述的用途，其特征在于所述的检测T0MM40基因rs2075650G—A变异和/或HLA-DPB2基因rs4713607G — A变异的试剂为限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。
全文摘要
一种检测人寿命的试剂盒，本发明涉及SNP领域。本发明提供了一种检测人寿命的试剂盒，它包括任选的用于检测TOMM40基因rs2075650变异和/或HLA-DPB2基因rs4713607变异的相关试剂。本发明还提供了TOMM40基因rs2075650变异和/或HLA-DPB2基因rs4713607变异在制备用于检测人类寿命的试剂中的用途。本发明首次阐明了TOMM40基因rs2075650位点和HLA-DPB2基因rs4713607位点多态性与长寿的相关性。使用本发明提供的试剂盒，可以预测待检人群寿命，对控制人类衰老的进程有重要作用。
文档编号C12Q1/68GK102618650SQ20121009853
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月5日 优先权日2011年4月6日
发明者刘小琦, 杨正林, 石毅, 鲁芳 申请人:四川省医学科学院(四川省人民医院)