专利名称：一种gh18家属几丁质酶基因的克隆方法
技术领域：
本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种GH18家属几丁质酶基因的克隆方法。
背景技术：
纤维素、几丁质是自然界含量最为丰富的多糖，蕴含着巨大的生物可利用资源，它们均由吡喃葡萄糖经￠-1,4糖苷键连接而成，不同点在于2号碳上所连接的基团。其中几丁质是由D-乙酰氨基葡萄糖残基构成，在自然界中，真菌、昆虫等体内含量极为丰富。科学界十分关注几丁质、壳聚糖及其水解物，因为它们具有许多重要和有开发潜力的生物学功能，比如杀菌、抗癌等，有些功能已经被实际应用于农业、食品和医药产业。
几丁质酶(EC 3. 2. I. 14)是自然界存在的一类能够催化水解几丁质P _1，4糖苷键的酶类，其存在细菌到真菌，甚至病毒乃至植物中。根据其氨基酸序列分析，几丁质酶可分为18号和19号二个家属，不同家属的酶对底物的特异性、作用方式是不同的。相对于物化方法水解几丁质，酶法水解具有节能、环保、高效、安全、低成本等无可比拟的优势，能够为几丁质原料的食品、制药等行业提供优质产品。该课题的关键在于几丁质酶基因的克隆方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种从产几丁质酶的菌株中快捷克隆几丁质酶基因的方法。本发明所述的方法包括如下步骤(I)将已知的GH18家属几丁质酶基因进行序列比对，找出核心保守序列；(2)设计能扩增几丁质酶基因片段的简并引物；(3)以产生几丁质酶菌株的基因组为模板，利用简并引物通过半嵌套PCR法扩增细菌几丁质酶部分基因片段；(4)利用获得的部分基因序列，设计嵌套引物,通过sitefinding PCR法或反向PCR法步移获取全长几丁质酶基因。几丁质酶可分为18号和19号两个家属，通过氨基酸序列分析可找出GH18家属的核心保守序列。比对已知的GH18家属的几丁质酶基因，找出其保守序列SIGGWT，FDGIDID和NIMTYD,设计半嵌套简并引物。也可利用软件Block Maker (http://bioinformatics,weizmann. ac. il/blocks/blockmkr/www/make_blocks. html)进行比对和寻找保守区域，然后利用软件 C0DEH0P(http://bioinformatics, weizmann. ac. il/blocks/codehop. html)寻找可能的简并引物。依据引物的基本原则和要求简并度尽可能小、Tm值尽可能高、上下游引物之距离尽可能大、上下游引物的Tm值尽可能相近等，选择适宜的简并引物。根据上述原则，发明人设计了三条简并引物GH18FP I :5，-AGYATHGGNGGNTGGCA-3，；
GH18FP2 :5， -TTYGAYGGNATHGAYATHGA-3’ ；GH18RP :5’ -TCRTANGTCATDATRTT-3’ ；利用只含几丁质作为唯一碳源的特殊选择性培养基可获取产生几丁质酶的菌株，并抽提其基因组DNA。以细菌基因组DNA为模板进行PCR。对扩增得到的部分基因片段(250-280bp)进行测序，然后根据获得的各种几丁质酶基因片段的序列设计各自特定的嵌套引物FP1、FP2和RPU RP2。其中，FP1、FP2和RP1、RP2是根据所述步骤(3)扩增得到的特异几丁质酶基因片段(250-280bp)序列设计的，每种几丁质酶基因其引物FP1、FP2、RPl和RP2可根据特异几丁质酶基因片段序列做相应调整。以各细菌的基因组DNA为模板，进行单一酶切与自身环化，然后利用FPl与RPl弓I 物进行反向PCR，再以所得扩增获得的产物作为模板，利用弓I物FP2和RP2进行嵌套PCR。或者利用 SFPl(5’-CACGACACGCTACTCAACAC-3’)与 FPl (或 RPl)引物进行 Sitefinding PCR,再以所得扩增获得的PCR产物作为模板，利用引物SFP2 (5’-ACTCAACACACCACCTCGCACAGC-3’)与FP2(或RP2)进行嵌套PCR。对获得的几丁质酶基因片段上下游序列进行移步扩增，并对所获得的基因片段进行测序、基因拼接。根据测序、拼接的结果，和现有几丁质酶基因进行比对，根据同源性等的分析，可以获得新型的GH18家属几丁质酶基因。根据测序结果并和现有几丁质酶基因进行比对，发现本发明获得了一种新型的几丁质酶基因chi9，其DNA序列和氨基酸分别如Seq ID No. 2和Seq ID No. 3所示，与已公布几丁质酶序列(BAK53879)同源性为60.5%。在不影响几丁质酶蛋白活性前提下，可对SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有几丁质酶活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。因而，优选的，可根据公知常识和逻辑推理，通过对几丁质酶蛋白生物学活性结构域外的氨基酸位点进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸从而获得基本保留几丁质酶生物学活性的蛋白突变体，优选的为对几丁质酶氨基酸位点进行点突变从而获得基本保留几丁质酶生物学活性的蛋白突变体。此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响几丁质酶基因表达的条件下，可对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还保护对SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留几丁质酶蛋白生物学活性的DNA分子。利用基因克隆技术，可将克隆到的几丁质酶基因接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组几丁质酶。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E. coli等，合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)和哺乳动物细胞等，优选采用原核表达系统E. coli。一个优选的例子是将本发明克隆到的几丁质酶基因采用设计插入的NdeI和XhoI重组位点连接到大肠杆菌表达载体pET28a上，并转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，用
0.lmmol/L IPTG进行诱导表达。通过镍柱亲和层析获得几丁质酶，经分析具有较高的酶活性。本发明提供了一种从细菌等生物中克隆GH18家属几丁质酶基因，并进行了表达的方法。本发明的方法有效可靠，建立了一套行之有效的新型几丁质基因克隆方法，为最终实现工业化生产几丁质酶打下基础。
图I为克隆、表达几丁质酶基因的流程图。图2为工程菌pET28a_chi9/BL21诱导表达后，含Chi9目的蛋白样品的SDS-PAGE分析
具体实施例方式实施例I产几丁质酶细菌的获得利用以几丁质为唯一碳源的培养基(0.5% colloidal chitin,0. 07 % K2HPO4,0. 03% KH2PO4,0. 05% MgSO4,0. 03% peptone, 0. 03% yeast extract和 1.5% agar,pH 7. 2)培养筛选得到能表达产生几丁质酶的细菌。例如Serratia sp. JU Staphyloccus sp. J2、Rheinheimera sp. J4、Stenotrophomonas sp. J5>Lysobacter sp. J6>Pseudomonas sp.J8>Comamonas sp. J9、Paenibacillus sp. A5-1、Bacillus sp. SH3 等,这些菌株与已知菌株的相似度为99%以上。实施例2几丁质酶基因chi9的克隆提取实施例I的细菌Comamonas sp. J9基因组DNA，反向PCR(I-PCR)法获得几丁
质酶基因。首先通过糖苷水解酶第18家属几丁质酶的高度保守序列设计半嵌套兼并引物GH18FP I :5，-AGYATHGGNGGNTGGCA-3，；GH18FP2 :5’ -TTYGAYGGNATHGAYATHGA-3 ；GH18RP :5’ -TCRTANGTCATDATRTT-3’ )；以筛选获得的产几丁质酶细菌的基因组DNA为模板进行半嵌套PCR，程序为94°C预变性5min，94°C变性30s，56 °C退火lmin，72°C恒温lmin，30次循环，最后72°C延伸lOmin。对获得的260bp片段进行测序(Seq ID No. I)，并利用碱基序列推测氨基酸序列，进行Blast比对，确定获得的几丁质酶片段的新颖性，然后根据获得的基因片段序列进一步设计嵌套引物9FP1 :5，-TGGACTGGGTCAACATCAT-3，9FP2 :5’ -AAYATHATGACNTAYGA-39RP1 :5，-GCGGCGGTCAGATAGAAT-3，9RP2 :5’ -CGACCACATTGTTGCCTAT-3’然后以HindIII酶切消化基因组DNA，并进行自身连接，以形成环形的DNA为模板，利用巢式引物进行反向PCR (I-PCR)，程序为94 °C预变性5min，94 °C变性30s，56 °C退火lmin，72°C恒温3min，30次循环，最后72°C延伸lOmin。获得几丁质酶片段的上下游序列3.5kb片段，最终获得新的几丁质酶基因chi9(Seq ID No. 2)与蛋白质Chi9(Seq ID No. 3)全序列。实施例3几丁质酶基因chiAl的克隆提取实施例I的细菌Paenibacillus sp. A5-1基因组DNA，利用简并引物GH18FP1、GH18FP2和GH18RP进行半嵌套PCR(方法同实施例2)。获得280bp片段(Seq ID No. 4)，然后根据获得的基因设计引物。A5FP1 :5，-GGACAGAAGGACGGCAAGCA-3，A5FP2 :5’ -TGCCA ACTCCACTTTCGTAGC-3’A5RP1 :5’ -CGTTTGCAGCAGCAGGATGT-3’A5RP2 :5’ -CGATGGCGTTCGGATACTC-3’利用SFPl与FPl (或RPl)引物进行Sitefinding PCR，再以所得扩增获得的产物作为模板，利用引物SFP2与FP2(或RP2)进行嵌套PCR，对获得的几丁质酶基因片段测序，进一步设计引物 A5RP3 (5，-GTTGCCCGCAGCGTCTTTCG-3，)和 A5RP4 (5，-CCGTATAAGAGGTCGTGGTG-3’)，对获得的几丁质酶基因片段上游序列进行移步扩增，并对所获得的基因片段进行测序、基因拼接，获得几丁质酶基因chiAl(Seq ID No. 5)与蛋白质ChiA-I (Seq ID No. 6)全序列。与已公布几丁质酶序列(EGL13634)同源性为95. 5%。实施例4几丁质酶Chi9表达载体的构建根据实施例中基因注释得到的几丁质酶全长编码序列(SEQ ID NO. 2)，设计能扩增出完整编码阅读框的引物 J9SP (5’ -CGACATATGAAAGAGATGAAATACC-3’ )和 J9AP (5 ’ -ATTCTCGAGCTTCACTTCAGCGATTGC-3’)，构建表达载体。Comamonas sp. J9 基因组 DNA 为模板，扩增几丁质酶全长基因。在保证阅读框正确的前提下重组至表达载体pET28a中，再将重组载体转化至大肠杆菌DH5 a感受态细胞中，以卡那霉素抗性标记法筛选阳性的重组菌pET28a-chi9/DH5 a。挑取单菌落于5ml含30 y g/ml卡那霉素的LB培养基中振摇培养37°C过夜，提取重组质粒后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，以卡那霉素抗性标记法筛选阳性的重组高效表达菌pET28a-chi9/BL21。实施例5 :重组几丁质酶的表达和纯化挑取单菌落的工程菌pET28a-chi9/BL21于5ml含30 y g/ml卡那霉素的LB培养基中振摇培养37°C过夜，按I : 100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含30 ii g/ml卡那霉素)中培养约3小时，至0D_达0. 5后，加入IPTG至终浓度0. lmmol/L,于25°C继续分别培养5小时。取Iml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液，悬浮细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，12000rpm离心lmin，上清加入10% SDS-PAGE胶中电泳，染色后观察到预期分子量66. IkDa的蛋白大量表达(图2)。按上述方法诱导表达所需蛋白的工程菌后，将细菌离心沉淀，按每IOOml菌加A 8ml PBS Buffer，超声破碎后，15000rpm离心30分钟后取上清，加入2ml Ni-NTA树脂(Invitrogen)，30°C振摇结合30分钟，静置沉淀，弃上清，沉淀用IOml Wash Buffer洗漆2次后，上2ml层析柱,然后用Elution Buffer洗脱目的蛋白，以Iml为单位分管收集,合并酶活最高的几管。洗脱的上清添加50%的甘油后保存于_80°C，并进行几丁质酶活分析。
权利要求
1.一种从产几丁质酶的菌株中克隆几丁质酶基因的方法，包括如下步骤 (1)将已知的GH18家属几丁质酶基因进行序列比对，找出核心保守序列； (2)设计能扩增几丁质酶基因片段的简并引物； (3)以产生几丁质酶菌株的基因组为模板，利用简并引物通过半嵌套PCR法扩增细菌几丁质酶部分基因片段； (4)利用获得的部分基因序列，设计嵌套引物，通过sitefindingPCR法或反向PCR法步移获取全长几丁质酶基因。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述方法步骤(I)中核心保守序列为SIGGWT, FDGIDID 和 NMTYD。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述方法步骤(2)中简并引物为 GH18FP I :5’ -AGYATHGGNGGNTGGCA-3’ ；GH18FP2 :5’ -TTYGAYGGNATHGAYATHGA-3’ ；GH18RP :5’ -TCRTANGTCATDATRTT-3’。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述方法步骤(4)中的嵌套引物FP1、FP2和RP1、RP2是根据所述步骤(3)扩增得到的特异几丁质酶基因片段(250-280bp)序列设计的，每种几丁质酶基因其引物FP1、FP2、RP1和RP2可根据特异几丁质酶基因片段序列做相应调整。
5.一种几丁质酶蛋白，是具有如下(I)或(2)特征的蛋白质 (1)、其氨基酸序列与SeqID NO. 3所示序列一致； (2)JfSeq ID NO. 3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有几丁质酶活性的由(I)衍生的蛋白质。
6.编码权利要求5所述几丁质酶蛋白的DNA分子，其核苷酸序列如SEQID NO. 2所示；或为对SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留几丁质酶蛋白生物学活性的DNA分子。
7.携带有权利要求6所述DNA分子的载体。
8.一种宿主系统，其由权利要求7所述的载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。
9.根据权利要求8所述的宿主系统，其为细菌、酵母或哺乳动物细胞。
10.根据权利要求9所述的宿主系统，其为大肠杆菌E.coli。
全文摘要
本发明公开了一种糖苷水解酶第18家属(GH18家属)——几丁质酶基因克隆的方法。发明利用单一碳源的特殊培养基筛选得到产几丁质酶的细菌，采用独特有效的半嵌套简并引物进行细菌GH18家属几丁质酶基因片段的扩增，然后利用sitefinding PCR方法或反向PCR方法获得全长的几丁质酶基因。然后构建几丁质酶基因的表达质粒，在大肠杆菌中进行基因的诱导表达。本发明的方法有效可靠，建立了一套行之有效的新型GH18家属几丁质基因克隆方法，为最终构建几丁质酶工程菌株，实现工业化生产几丁质酶奠定基础。
文档编号C12N15/63GK102653768SQ20121009750
公开日2012年9月5日 申请日期2012年4月1日 优先权日2012年4月1日
发明者吴敏, 张文武, 朱旭芬 申请人:浙江大学