专利名称：一种动物病毒的纯化工艺的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种动物病毒的纯化工艺。
背景技术：
近年来，动物病毒性传染病(如禽流感、口蹄疫和PRRS等)相继爆发并流行，引起动物大规模的死亡，造成了巨大的经济损失。疫苗接种是现阶段我国防控动物疫病的最有效技术手段，在畜牧业的发展中发挥着越来越重要的作用，极大地促进了动物养殖业的繁荣发展。
目前，动物用疫苗可分为常规疫苗和基因工程疫苗两大类。根据制备工艺和组成成分的不同，常规疫苗可分为灭活疫苗、弱毒活疫苗、单苗、多价(联)疫苗等。随着分子生物学、分子免疫学、分子遗传学的研究取得进展与基因工程技术的应用，又出现了基因工程疫苗，主要包括亚单位疫苗、合成肽苗、抗独特型抗体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗以及核酸疫苗等。但目前生产实践中大量应用的疫苗仍以常规疫苗为主。动物疫苗同人类的疫苗一样,是保证动物健康的必不可少的措施。但是由于动物疫苗的成本偏低，所以其疫苗生产技术和工艺的发展相对滞后。现有动物疫苗的问题之一就是病毒抗原纯度不高，导致疫苗的副反应大、免疫效果不够确实。原因在于疫苗的生产工艺相对落后，缺乏足够的纯化步骤，不能提供高效、高纯的病毒抗原。
发明内容
本发明的目的是提供一种动物病毒的纯化工艺。本发明提供了一种动物病毒的纯化方法，是将动物病毒液依次进行离心、超滤、和分子筛层析，得到纯化的病毒液。所述方法可包括如下步骤(I)将动物病毒液离心收集上清液；(2)将步骤(I)得到的上清液进行超滤浓缩，得到病毒浓缩液；(3)将步骤(2)得到的病毒浓缩液进行分子筛层析，得到纯化的病毒液。所述动物病毒液的制备方法具体如下将动物病毒接种动物细胞并培养，得到病毒液。所述动物病毒可为水貂肠炎病毒，具体可为MEVB毒株。所述动物细胞可为F81细胞。所述接种的剂量可为MOI = 0.05-0. 15，所述培养的条件可为37°C、96-120小时。所述接种的剂量具体可为MOI = O. 1，所述培养的时间具体可为96小时。所述步骤(I)中，所述离心的条件可为4°C、8000-12000g、15_20分钟。所述步骤(I)中，所述离心的条件具体可为4°C、10000g、18分钟。所述步骤(2)中，所述超滤浓缩的方法可为将30-50体积份所述上清液用截留分子量为30kD的超滤膜包浓缩至I体积份。所述步骤(2)中，所述超滤的方法具体可为将50体积份所述上清液用截留分子量为30kD的超滤膜包浓缩至I体积份。所述步骤(3)中，所述分子筛层析的参数可如下层析柱型号为IndexColumn 100/950 ；填充介质为Sepharose4 Fast Flow ；
洗脱液为ρΗ7·4-7. 8、0· 04mol/L 的 PBS 缓冲液；收集第一个洗脱峰，即为纯化的病毒液。所述步骤(3)中，所述洗脱液具体可为pH7. 6,0. 04mol/L的PBS缓冲液。所述分子筛层析中，可采用8%柱体积的上样量。所述分子筛层析中，所述洗脱液的流速可为200ml/min。以上任一所述方法制备得到的纯化的病毒液均属于本发明的保护范围。所述纯化的病毒液可用于制备动物疫苗。本发明以水貂肠炎病毒(MEV)为研究对象，针对我国动物疫苗产业关键生产技术薄弱环节，结合重大动物疫病及人畜共患病防疫的迫切需求，将离心技术、超滤浓缩分离技术和分子筛技术有机地结合在一起，建立了病毒抗原规模化浓缩纯化工艺和适合规模化抗原浓缩纯化的生产线，最终为研制安全高效的疫苗产品打下良好基础。本发明很好地解决了疫苗生产过程中的共性关键技术和生产工艺技术的难点问题，突破了影响动物疫苗生产过程中的关键技术环节的瓶颈，建立了疫苗工业化生产关键技术及相关技术研究及产业化平台。本发明将带动动物疫苗产业技术进步和产品更新换代，提高动物疫苗生产技术水平和产品质量，提升我国动物疫苗的核心竞争力，切实提高动物福利，并最终为人类的健康提供保障。
图I为病毒浓缩液进行分子筛层析的图谱。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。MOI (感染复数)病毒的pfu与细胞数量的比值。水貂肠炎病毒(MEV)MEVB毒株公众可从中国农业大学获得；参考文献闻喜军，柴秀丽，吴威等.水貂肠炎细小病毒灭活疫苗抗体消长规律的研究.经济动物学报.2007，11(4) :199-201.。F81细胞(猫肾细胞)公众可从中国农业大学获得；参考文献水貂病毒性肠炎诊断方法研究进展。王建科，程世鹏，闻喜军。特产研究。2009(1) :63-65。水貂购自大连名威貂业有限公司。实施例I、制备水貂肠炎病毒MEVB毒株的病毒浓缩液I、将水貂肠炎病毒MEVB毒株接种F81细胞(Μ0Ι = O. I)，37°C培养96h。2、将步骤I得到的培养液(初始病毒液)4°C、IOOOOg离心18min，收集上清液。3、将50体积份步骤2得到的上清液用截留分子量为30kD的超滤膜包浓缩至I体积份，得到病毒浓缩液。4、将步骤4得到的病毒浓缩液进行分子筛层析。层析柱型号为IndexColumn 100/950 ;填充介质为Sepharose 4 Fast Flow。每次上样量为8%柱体积；洗脱液为PBS缓冲液(O. 04mol/L, ρΗ7· 6)。洗脱液流速为200ml/min。
用紫外分光光度计在280nm波长下监测，层析图谱见图I。收集第一个洗脱峰(保留时间为30_42min)对应的过柱后溶液，即为纯化后的病毒液。实施例2、纯化效果验证一、HA 效价采用血凝法测定实施例I制备的初始病毒液(或实施例I制备的纯化后的病毒液)中的MEV效价,血球凝集试验(HA)步骤如下I、在96孔微量反应板(共12列)上进行，从左至右每孔加50 μ L生理盐水。2、第I列每孔加50 μ L待测病毒液,混合均匀后，吸50 μ L至第2列孔,依次倍比稀释至第11列孔，吸弃50 μ L03、第I至12列孔每孔加入O. 5%猪红细胞悬液50 μ L，于微量振荡器上振荡混匀，4°C作用30min，待对照孔(第12列)红细胞全部沉淀即可进行结果观察。4、结果判定如红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100%凝集(++++)，不凝集者(-)即红细胞沉于孔底呈点状。以100%凝集的病毒最大稀释度为病毒浓缩液中MEV的HA效价(又称HA滴度)，初始病毒液的效价为I : 128，纯化后的病毒液的效价为I 1024。二、杂蛋白去除率实施例I的步骤2中，得到了 500ml初始病毒液(总蛋白含量为31. 69mg/ml)，步骤4中得到了 1120ml纯化后的病毒液(总蛋白含量为O. 35mg/ml)，杂蛋白去除率为97. 52%。步骤一和步骤二的结果表明，将初始病毒液依次进行离心、浓缩和分子筛层析后，杂蛋白去除率可达97. 52%，HA滴度显著提高。因此本方法可用于病毒抗原的规模化纯化。
权利要求
1.一种动物病毒的纯化方法，是将动物病毒液依次进行离心、超滤和分子筛层析，得到纯化的病毒液。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤 (1)将动物病毒液离心收集上清液； (2)将步骤(I)得到的上清液进行超滤浓缩，得到病毒浓缩液； (3)将步骤(2)得到的病毒浓缩液进行分子筛层析，得到纯化的病毒液。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述动物病毒液的制备方法如下将动物病毒接种动物细胞并培养，得到病毒液。
4.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述动物病毒为水貂肠炎病毒，具体为MEVB毒株。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述动物病毒为水貂肠炎病毒，具体为MEVB毒株。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述动物细胞为F81细胞，所述接种的剂量为MOI = 0. 05-0. 15，所述培养的条件为37°C、96-120小时。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述接种的剂量为MOI= 0. 1，所述培养的时间为37°C、96小时。
8.如权利要求I至7中任一所述的方法，其特征在于 所述步骤(I)中，所述离心的条件为4°C、8000-12000g、15-20分钟； 所述步骤(2)中，所述超滤浓缩的方法为将30-50体积份所述上清液用截留分子量为30kD的超滤膜包浓缩至I体积份； 所述步骤(3)中，所述分子筛层析的参数如下 层析柱型号为Index Column 100/950 ； 填充介质为Sepharose 4 Fast Flow ； 洗脱液为pH7. 4-7. 8,0. 04mol/L的PBS缓冲液； 收集第一个洗脱峰，即为纯化的病毒液。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于 所述步骤⑴中，所述离心的条件为4°C、10000g、18分钟； 所述步骤(2)中，所述超滤的方法为将50体积份所述上清液用截留分子量为30kD的超滤膜包浓缩至I体积份； 所述步骤(3)中，所述洗脱液为pH7. 6,0. 04mol/L的PBS缓冲液。
10.权利要求I至9中任一所述方法制备得到的纯化的病毒液。
全文摘要
本发明公开了一种动物病毒的纯化工艺。本发明提供了一种动物病毒的纯化方法，是将动物病毒液依次进行离心、超滤和分子筛层析，得到纯化的病毒液。本发明针对我国动物疫苗产业关键生产技术薄弱环节，结合重大动物疫病及人畜共患病防疫的迫切需求，将离心技术、超滤浓缩分离技术和分子筛技术有机地结合在一起，建立了病毒抗原规模化浓缩纯化工艺和适合规模化抗原浓缩纯化的生产线，最终研制出了安全高效的疫苗产品。本发明将带动动物疫苗产业技术进步和产品更新换代，提高动物疫苗生产技术水平和产品质量，提升我国动物疫苗的核心竞争力，切实提高动物福利，并最终为人类的健康提供保障。
文档编号C12R1/93GK102628032SQ20121009069
公开日2012年8月8日 申请日期2012年3月30日 优先权日2012年3月30日
发明者刘维全, 王吉贵 申请人:中国农业大学