专利名称：一种重组胸腺肽α1的制备方法
技术领域：
本发明涉及医药生物工程技术领域，具体涉及一种重组多肽的制备方法。
背景技术：
胸腺肽α I是Goldstein等1977年首次在胸腺组织中发现的由28个氨基酸组成的多肽，天然胸腺肽α I的氨基酸序列为NH2-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-GIu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH。胸腺肽α I具有免疫调节功能，是一种广谱免疫调节剂，临床上用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎及肿瘤等疾病。此外，还可以用作疫苗辅助制剂。目前，胸腺肽αI的生产方法有化学合成法和基因工程法。化学合成法的成本高，使用有机溶剂多，易造成环境污染。基因工程法是通过构建能表达胸腺肽α I的工程菌株(如大肠杆菌、酵母菌等)，在发酵阶段进行诱导表达，再经过纯化工序而制得胸腺肽α I。中国专利(专利号ZL200410077749. 2)公开了一种通过基因工程技术制备胸腺肽α I的方法，该方法在PTRX质粒的基础上构建表达菌株，发酵中采用IPTG诱导工程菌表达，再采用亲和层析、离子交换层析纯化融合蛋白，肠激酶切释放出胸腺肽α 1，再通过亲和层析和HPLC纯化出胸腺肽α I。但该方法存在成本高、无法大规模生产等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、成本低、收率高且适用于大规模生产的重组胸腺肽α I的制备方法。本发明利用基因重组技术制备重组胸腺肽α 1，包括人工合成融合蛋白基因并将所述融合蛋白基因重组到载体质粒pet_22b中构建表达载体，将该表达载体转化到宿主大肠杆菌中构建工程菌，将所述工程菌进行发酵并诱导融合蛋白表达，对表达产物进行纯化制备后得到融合蛋白目标产物。本发明的具体技术方案为一种重组胸腺肽α I的制备方法，包括以下步骤I)人工合成胸腺肽α I的融合蛋白基因全序列，如SEQ ID NO. I所示；2)将合成的基因酶切后，重组到质粒pet_22b上构建表达载体，并将表达载体转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中构建工程菌；3)将工程菌发酵培养，以乳糖作为诱导剂诱导融合蛋白表达；4)将步骤3)的表达产物进行纯化，制备重组胸腺肽α I。其中，步骤3)所述的发酵培养包括3a)将步骤2)构建的工程菌于培养基中培养获得活化的种子菌； 3b)将活化的种子菌进行高密度发酵培养，培养过程中加入补碳液和补氮液步骤
4)所述的纯化包括以下步骤
4a)收集经发酵培养的工程菌，用超高压均质机破碎，得细胞破碎液；4b)用中空纤维滤膜过滤细胞破碎液，得滤液I ;4c)滤液I经亲和层析后，再经超滤除去咪唑，得滤液II ；4d)用肠激酶水解滤液II后，用亲和层析和HPLC纯化出胸腺肽α I。进一步地，上述滤液II在15 20°C条件下，用肠激酶水解16hr。在所述条件可以减少肠激酶对胸腺肽α I的非特异性切割，有效提高胸腺肽α I的产量。本发明的制备方法适用于大规模的工业化生产，不但显著提高了重组胸腺肽α I的产率，而且还具有制备工艺简单、生产成本低等有益效果。
图I是实施例5所得胸腺肽的纯度和浓度的HPLC分析图。图2是实施例6所得胸腺肽的纯度和浓度的HPLC分析图。图3是实施例8中肠激酶水解融合蛋白的SDS-PAGE分析图；其中，泳道I为胸腺肽α I对照品、泳道2-6的水解温度分别为25°C、20°C、18°C、15。。、12。。。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明重组胸腺肽α I的制备方法进行详细描述。表汰载体的构建实施例II、试剂和材料载体质粒pet_22b购自美国MERK公司，大肠杆菌BL21 (DE3)购自天根生化科技(北京)公司，融合蛋白基因的合成及质粒的测序委托生工生物工程(上海)有限公司合成，T4DNA连接酶、DNA限制性内切酶Nde I和Not I购自生工生物工程(上海)有限公司，胶回收试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。2、方法(I)融合蛋白基因人工合成如SEQ ID NO. I所示的融合蛋白基因全序列；在序列中含NdeI和NotI酶切位点(分别为CATATG和GCGGCCGC)和肠激酶识别序列(CATCATCATCATCATCAT)。(2)重组质粒的构建将合成的上述基因用Nde I和NotI双酶切后，回收DNA片段，然后与经Nde I和NotI双酶切的pet_22b质粒连接,构建出融合蛋白表达质粒。(3)将上述融合表达质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，以氨苄青霉素为选择标记，筛选出转化子并进行酶切鉴定。(4)将重组质粒测序，以确定表达载体构建的正确性。(5)上述含表达载体的BL21 (DE3)菌株作为重组胸腺肽α I的工程菌。发酵工艺研究实施例2发酵工艺II、培养基
—级种子用LB培养基(g/L):蛋白胨IOg,酵母粉5g, NaCl 10g。二级种子用2YT培养基(g/L):蛋白胨16g，酵母粉10g，NaCl 5g。发酵罐发酵培养基(g/L):蛋白胨12g，酵母粉 12g，NaC15g，KH2P044g，K2HP045g，MgSO4 · 7H20 lg，葡萄糖 2g。补碳液(400ml):葡萄糖40g, MgSO4 · 7H20 3g,。补氮液(g/L):蛋白胨37g,酵母粉37g。2、种子菌活化
取在_70°C、20%甘油中保藏的工程菌划平板，37°C培养约16hr，挑单克隆接种于含200ml LB培养基(含氨苄青霉素100 μ g/ml)的锥形瓶中，37°C，250rpm培养10小时左右。然后按2YT培养基量的I %转种一次，在相同条件下培养14. 5小时，即成为活化种子菌。3、发酵培养IOL发酵罐中加入8L发酵用培养基，按I : 25的比例加入活化种子菌，另加入少量消泡剂，于37°C，pH7.0的条件下发酵。发酵过程中控制溶解氧浓度在30% 60%，起始转速为300rpm，溶解氧浓度不足时，最大转速可达800rpm。pH使用自动流加2N的HCl或4N的NaOH调节至7. O。发酵过程中取样测定0D600和菌体密度，当加入种子菌2hr时后开始加入补碳液，IOL发酵罐补充400ml,诱导前30min左右完成；当加入种子菌后3hr开始加入补氮液，IOL发酵罐补充2000ml，诱导完毕前Ihr左右完成。当加入种子菌后5hr加入IPTG诱导表达，诱导的终浓度为O. 6mM,诱导Ihr后将IPTG浓度补充至ImM，IPTG终浓度为ImM，37°C诱导后4hr结束，诱导前和诱导后每小时取样，SDS-PAGE分析融合蛋白表达率。发酵结束后于4°C , 5000rpm离心IOmin收集菌体,得到湿菌体300g 320g。实施例3发酵工艺2I、培养基一级种子用LB培养基(g/L):蛋白胨IOg,酵母粉5g, NaCl 10g。二级种子用2YT培养基(g/L):蛋白胨16g,酵母粉10g, NaCl 5g。发酵罐发酵培养基(7000ml):蛋白胨80g，酵母粉100g, NaCl 60g, KH2P0445g,K2HP0450g, MgSO4 · 7H20 12g，葡萄糖 70g。补碳液(800ml):葡萄糖250g, MgSO4 · 7H20 IOg,甘油 120g。补氮液(2000ml):蛋白胨130g，酵母粉130g，硫酸铵130g。2、种子菌活化取在_70°C、20%甘油中保藏的工程菌划平板，37°C培养约16hr，挑单克隆接种于含200ml LB培养基(含氨苄青霉素100 μ g/ml)的锥形瓶中，37°C，250rpm培养10小时左右。然后按2YT培养基量的I %转种一次，在相同条件下培养14. 5小时，即成为活化种子菌。3、高密度发酵培养IOL发酵罐中加入7L发酵用培养基，按I : 25的比例加入活化种子菌，另加入适量消泡剂，于37°C，pH7.0的条件下发酵。发酵过程中控制溶解氧浓度在30% 60%，起始转速为300rpm，溶解氧浓度不足时，最大转速可达800rpm。pH使用自动流加2N的HCl或氨水调节至7. O。发酵过程中取样测定0D600和菌体密度，当加入种子菌3hr时后开始加入补碳液，IOL发酵罐补充800ml,诱导前30min左右完成；当加入种子菌后4hr开始加入补氮液，IOL发酵罐补充2000ml,诱导完毕前Ihr左右完成。当加入种子菌后6hr —次性加入乳糖进行诱导，乳糖终浓度为10mM，37°C诱导后4hr结束，诱导前和诱导后每小时取样，SDS-PAGE分析融合蛋白表达率。发酵结束后于4°C，5000rpm离心IOmin收集菌体，得到湿菌体 1180g 1380g。发酵工艺I和发酵工艺2的比较上述2种发酵工艺的主要区别在于第一，诱导剂不同。工艺2使用乳糖作为诱导剂，成本大大低于工艺I使用的IPTG，且乳糖是动植物和微生物体内常见成分，对细胞无毒，适合于药物制备，而IPTG对细胞有 一定毒性。第二，培养基的成分不同，与工艺I相比，工艺2中的补碳液增加了甘油，在补氮液中增加了硫酸铵，通过工艺2培养基配方的调整，发酵液中细菌密度提高5倍以上，且不会对目标蛋白的表达产生负面影响。第三，pH调节剂不同，工艺I中使用盐酸和氢氧化钠作为pH调节剂，工艺2中使用盐酸和氨水作为PH调节剂，氨水即可调节pH，又可提供细菌生长所需的氮元素，细菌生长更好。按上述工艺I (实施例2)和工艺2 (实施例3)分别进行三次发酵，发酵罐体积10L，所产生的湿菌重量及目标蛋白的表达率结果比较，如表I所示。表I :两者发酵工艺试验结果比较
发酵X艺发酵次数湿菌重量(g)表达率(％)
第一次发酵31628.6
实施例2的第二次发酵30030.2
发酵工艺I 第三次发酵32027.5平均31228.76
第一次发酵126027.9
实施例3的第二次发酵118029.4
发酵工艺2第三次发酵138029.8
平均127329.03
I从上表可以看出，在相同发酵液体积的情况下，利用发酵工艺2所得的湿菌重量远远大于发酵工艺I所得的湿菌重量。由于在这两种工艺中，目标蛋白重组胸腺肽αI的表达率基本相似，目标蛋白表达后是存在于细菌细胞内。所以发酵工艺2所得的目标蛋白表达量远远大于发酵工艺I。此外，发酵工艺2使用乳糖作为诱导剂来诱导目标蛋白表达，其与发酵工艺I中使用的诱导剂IPTG的诱导能力相似，但乳糖成本大大低于IPTG，且乳糖是动植物和微生物体内常见成分，对细胞无毒，适合于药物制备，而IPTG对细胞有一定毒性。纯化工艺研究
实施例4胸腺肽αI的纯化工艺II、菌体处理将发酵后收集的菌体，用10倍重量的50mM Tris-HCl (pH8. O), O. 5MNaCl，重新悬浮菌体后，采用Branson450型超声波细胞粉碎机破碎细菌，探头型号为1/2”，以70%的功率在冰浴下超声15 25min，(超声8sec，间歇4sec)。4°C、IOOOOrpm离心30收集上清液，用于精纯。2、精纯纯化中所用层析介质 chelating sepharose FF, Q-Sepharose FastFlow, sephadex G-25, sephadex G-IO 为美国 GE 公司产品，反相 C18 柱和 prep LC300 型液相系统为美国waters公司产品。
第一步，Ni2+-chelatingsepharose 亲和层析将离心上清液过 Ni2+_chelatingsepharose FF亲和层析柱，弃去穿透液，然后再以50mM Tris-HCl (pH 7. O), O. 5Μ NaCl,20mM咪唑溶液洗脱，继之以Tris-HCl (pH 7.0)，O. 5M NaCl，150mM咪唑溶液洗脱，收集融合蛋白峰流出液。第二步，Q-Sepharose Fast Flow离子交换将第一步收集的融合蛋白溶液,通过 S印hadex G-25 柱更换成 20mM Tris-HCl (pH 8. 0)，20mM NaCl 缓冲液后上 Q-S印haroseFast Flow柱，用50mM Tris-HCl (pH 8. 0), 150mM NaCl进行洗脱，收集洗脱峰用于酶切。第三步，肠激酶水解融合蛋白在第二步收集的融合蛋白峰液中，紫外法测定超滤处理后蛋白溶液浓度，加入肠激酶，于15°C水解16小时,按每μ I肠激酶切割4mg融合蛋白的比例酶切。第四步Ni2+_chelatingsepharose 亲和层析先用 50mM Tris-HCl (pH 8. 0),0. 5Μ NaCl,缓冲液平衡亲和层析柱,将融合蛋白水解液上柱，收集穿透液,通过sephadexG-10柱将其中的缓冲液置换成超纯水。第五步制备型HPLC (C18)纯化流动相A (乙腈)，流动相B (0. OlM KH2PO4,)，按流动相5 %流动相A到30 %流动相A进行梯度洗脱，洗脱时间为30分钟，收集胸腺肽α I峰，进行分析型反相HPLC(C18柱)分析其纯度，测定其含量。实施例5胸腺肽αI的纯化工艺2I、菌体处理将发酵后收集的菌体，用10倍重量的50mM Tris-HCl (pH 8. 0)，0. 5MNaCl,20mM咪唑溶液重新悬浮菌体，用低温超高压连续流细胞破碎机(广州聚能JN-100C)破碎2次,利用中空纤维滤膜过滤(美国PALL公司，孔径0. I μ m 0. 65 μ m),并洗滤3 5倍体积。2、精纯纯化中所用层析介质chelating sepharose FF, sephadex G-10为美国GE公司产品，反相C18柱和prep LC300型液相系统为美国raters公司产品，超滤系统和超滤膜为美国mi I Iipore公司产品。第一步，Ni2+-chelatingsepharose 亲和层析先用 50mM Tris-HCl (pH 8.0)，0. 5M NaCl，20mM咪唑，缓冲液平衡亲和层析柱，将过滤后收集的澄清液体上柱，弃去穿透液，然后再以50mM Tris-HCKpH 7. 0),0. 5M NaCl，20mM咪唑，缓冲液平衡层析柱，继之以Tris-HCKpH 7. 0),0. 5M NaCl，150mM咪唑，缓冲液洗脱，收集融合蛋白峰流出液。第二步，肠激酶水解融合蛋白将第一步收集的融合蛋白峰流出液，先以截留分子量为5KD或10KD的超滤膜超滤除去咪唑并将其中的缓冲液置换为20m mo I/L Tris-HCl,pH8. 0, 20mM NaCl缓冲液，超滤后体积约为超滤如的90%左右,紫外法测定超滤处理后蛋白溶液浓度，加入肠激酶，于15°C水解16小时。按每I μ I肠激酶切割4mg融合蛋白的比例酶切。第三步Ni2+_chelatingsepharose 亲和层析先用 50mM Tris-HCl (pH 8. O),O. 5Μ NaCl,缓冲液平衡亲和层析柱,将融合蛋白水解液上柱，收集穿透液,通过sephadexG-IO柱将其中的缓冲液置换成超纯水。第四步制备型HPLC(Cl8)纯化:流动相A(乙腈)，流动相B(0. OlM KH2PO4,)，按流动相5 %流动相A到30 %流动相A进行梯度洗脱，洗脱时间为30分钟，收集胸腺肽α I峰，进行分析型反相HPLC(C18柱)分析其纯度，测定其含量。纯化工艺I和纯化工艺2的比较第一，在纯化工艺I中，采用超声波细胞粉碎机破碎细菌，由于目前市场上超声波破碎机功率有限，该方法只适宜于试验研究，无法规模化生产。而工艺2采用超高压均质机破碎细菌，可以实现大规模生产。 第二，在纯化工艺I中，细胞破碎液采用IOOOOrpm离心30min中的方法进行固液分离，很难实现大规模生产，而且离心效果不佳。而工艺2采用中空纤维过滤的方法进行分离，试验证明，工艺2的方法所得液体更澄清，不会污染下一工序的层析介质，同时，通过放大膜面积，很容易实现规模化生产。第三,与纯化工艺I中采用sephadex G-25的方法不同，工艺2采用超滤的方法除去咪唑，可以节省时间，省去层析介质成本，因为sephadex G_25为进口介质,使用次数有限，价格昂贵，层析过程耗时很长。而采用超滤方法后，除去咪唑后的溶液同样可顺利用于下一步的酶切工序，不影响酶切效果，而所用工时缩短一半以上。第四，在纯化融合蛋白的步骤中，与工艺2不同，工艺I不采用离子交换的方法，而是除去咪唑后直接酶切，试验证明，减少离子交换步骤，可以提高产量20 %以上，而且最终产品的纯度和质量丝毫不受影响。所以工艺2减少了工序，明显提高了产率。纯化工艺I (实施例4)的分析结果如图I所示，纯化工艺2 (实施例5)的分析结果如图2所示。通过和标准品的HPLC分析图对照，计算出实施例4和实施例5方法制备的胸腺肽α I的含量，再计算出每克菌体所得到的胸腺肽α I毫克数，结果如表2所示。表2 :胸腺肽α I的质量
样品纯度每克菌体所得胸腺肽a I毫克数~
实施例 498.4%1.98mg
实施例 599. I %2. 50mg实施例6肠激酶最适水解温度的筛选肠激酶是专一性很高的蛋白水解酶，其切割位点为DDDDK(天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸)后面的肽键，但有时也出现非特异性切割的现象。一般使用融合表达时，特意在融合蛋白序列中，设计了该位点，以便利用肠激酶将目标多肽释放出来。若减少肠激酶对胸腺肽α I的非特异性切割，可有效提高胸腺肽α I的产量。本发明对肠激酶的水解温度和时间进行了筛选，融合蛋白溶液浓度为4mg/ml，缓冲液为20mM Tris-HCl (pH 8. 0), 20mM NaCl，于融合蛋白溶液中加入肠激酶溶液，按每微升(μ D肠激酶切割4mg融合蛋白的比例加入混匀，分成两份，分别置25°C，20°C，18°C，15°C，12°C的条件下进行水解，水解时间16hr，水解结束后，取样进行SDS-PAGE分析，确定水解最适合温度。结果如图3所示。从图3中可以看出，而25°C、20°C、18°C水解后，融合蛋白已被完全水解，但同时出现了较强的胸腺肽α I的非特异性水解，电泳图中出现了较深的一条 小分子带，而目的多肽胸腺肽α I的电泳带变浅，说明造成了胸腺肽α I的损失，减少了胸腺肽α I的产量。而15°C水解条件下，非特异性水解较少，而目的多肽胸腺肽α I的带最深，说明该条件下目的多肽胸腺肽α I产率最高，故选用15°C作为水解温度。
权利要求
1.一种重组胸腺肽α I的制备方法，包括以下步骤 1)人工合成胸腺肽αI的融合蛋白基因全序列，所述基因序列如SEQ ID NO. I所示； 2)将合成的基因酶切后，重组到质粒pet_22b上构建表达载体，并将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中构建工程菌； 3)将工程菌发酵培养，以乳糖作为诱导剂诱导融合蛋白表达； 4)将步骤3)获得的表达产物按下述步骤进行纯化，制备重组胸腺肽αI ； 4a)收集经发酵培养的工程菌，悬浮菌体，用超高压均质机破碎，得细胞破碎液； 4b)用中空纤维滤膜过滤细胞破碎液，得滤液I ; 4c)滤液I经亲和层析后，再经超滤，得滤液II ； 4d)用肠激酶水解滤液II后，用亲和层析和HPLC纯化出胸腺肽α I。
2.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述纯化包括以下步骤 4a)收集经发酵培养的工程菌，用10倍重量的50mM Tris-HCl (pH 8. O)，O. 5MNaCl，20mM咪唑溶液重新悬浮菌体，然后用超高压均质机破碎，得细胞破碎液； 4b)用孔径O. I μ m O. 65 μ m的中空纤维滤膜过滤细胞破碎液的上清液，并洗滤3 5倍体积得滤液I ; 4c)用50mM Tris-HCl (pH 8. 0),0. 5M NaCl，20mM咪唑的缓冲液平衡亲和层析柱，将滤液I上柱，弃去穿透液，然后再以50mM Tris-HCl (pH 7. 0),0. 5M NaCl，20mM咪唑的缓冲液平衡层析柱，以Tris-HCl (pH 7. 0),0. 5M NaCl，150mM咪唑的缓冲液洗脱，收集融合蛋白峰流出液，以截留分子量为5KD或IOKD的超滤膜超滤除去流出液中的咪唑，并将其中的缓冲液置换为 20mmol/LTris-HCl，pH8. 0,20mM NaCl 的缓冲液，得滤液 II ； 4d)测定滤液II的蛋白质浓度，以I μ I肠激酶切割4mg融合蛋白的比例加入肠激酶，于15°C水解16小时，用50mM Tris-HCl (pH 8. 0),0. 5M NaCl的缓冲液平衡亲和层析柱，将融合蛋白水解液上柱，收集穿透液，并将其中的缓冲液置换成超纯水，然后用HPLC纯化出胸腺肽α I。
3.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述发酵包括以下步骤 3a)将步骤2)构建的工程菌于培养基中培养获得活化的种子菌； 3b)将活化的种子菌进行高密度发酵培养，培养过程中加入补碳液和补氮液，以盐酸-氨水调节PH，加入乳糖诱导剂培养获得含表达的胸腺肽α I的菌体；其中补碳液含葡萄糖、MgSO4 · 7Η20和甘油，补氮液含蛋白胨，酵母粉和硫酸铵。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3b)包括 i)向发酵罐中加入发酵培养基，每升发酵培养基组成为蛋白胨11.43g，酵母粉14.3g，NaCl 8. 57g，ΚΗ2Ρ046· 43g，Κ2ΗΡ047· 14g，MgSO4 · 7H20 I. 71g，葡萄糖 10g，按体积比I 25向发酵培养基中加入活化种子菌，另加入消泡剂，于37°C，pH7. O的条件下发酵； ii)控制发酵过程的溶解氧浓度为30% 60%，转速为300-800rpm，自动流加2N的HCl或氨水将发酵液的pH调节至7. O ； iii)加入种子菌后3hr时至诱导前30min,连续向发酵罐加入补碳液,每升补碳液组成为葡萄糖 312. 5g，MgSO4 · 7H20 12. 5g，甘油 150g ； iv)加入种子菌后4hr至诱导完毕前lhr,连续向发酵罐加入补氮液,每升补氮液组成为蛋白胨65g,酵母粉65g,硫酸铵65g ;v)加入种子菌后6hr—次性加入乳糖进行诱导,使乳糖终浓度为IOmM,诱导4hr后收集菌体。
全文摘要
本发明利用基因重组技术制备重组胸腺肽α1，包括人工合成融合蛋白基因并将所述融合蛋白基因重组到载体质粒pet-22b中构建表达载体，将该表达载体转化到宿主大肠杆菌中构建工程菌，将所述工程菌进行发酵并诱导融合蛋白表达，对表达产物进行纯化制备后得到融合蛋白目标产物。
文档编号C12N15/70GK102660568SQ20121008628
公开日2012年9月12日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者丁佳萱, 朱瑞东, 柴向东, 罗豪晖, 蒋为民, 赵秦, 韩杰, 高琰 申请人:深圳市海王英特龙生物技术股份有限公司