专利名称：土壤溶磷真菌接种剂谷粒孢子粉及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种制备土壤溶磷真菌接种剂谷粒孢子粉的方法，以及采用这种方法制成的谷粒孢子粉。 背景技术：
磷是植物生长所必需的重要营养元素之一。土壤是植物磷营养的主要来源，我国大部分土壤大耕层的全磷含量O. 4-2. 5 %，对植物有效的磷不到全磷的1%，约70%的耕地土壤有效磷含量低于临界值(林葆等，1994)。另一方面，由于土壤固磷的普遍存在，施入土壤的可溶性磷肥大部分很快转化为难溶性磷酸盐，作物很难吸收，有研究表明磷肥的当季作物的吸收利用率一般低于20%(沈善敏，1992)。由于土壤固磷作用，这样造成一个矛盾，一方面土壤速磷低，需要大量的可溶性磷肥投入，另一方面又由于长期大量使用磷肥，土壤出现磷的富集(全磷含量高)，形成巨大的磷库。如何活化这部分磷是当前乃至今后相当长时期农业生产的重要问题。速效磷肥的生产原料主要是磷矿粉。而磷矿粉属固定态磷素，不易被作物吸收。原生磷灰石的分子式可以写成CalO (P04) 6X2，式中X为F-、0H_、C032-时分别称为氟磷灰石、羟磷灰石和碳酸盐磷灰石。工业化生产速效磷肥是加入无机酸，如硫酸，使磷转化为水溶性状态，这种方式生产对环境及生产者具有一定的危害性。随着农业生产的发展，对磷肥的需求量逐年提高，迫切需求采取一些比较经济安全的方法，使固定态的磷释放出来为作物所用。土壤中生存大量的微生物，其中有许多微生物能将难溶性磷酸盐转化为植物可吸收利用的形态，这些微生物称为溶磷菌(phosphate-solubilizing microorganisms,PSMs)。向土壤中接种溶磷菌，能够显著地改善作物的磷素营养，提高作物的产量。溶磷菌的溶磷作用与其代谢产生的低分子量的有机酸有直接的关系，不同的溶磷菌产生的有机酸种类是不同的，溶磷菌产生的有机酸主要有醋酸、乳酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、葡萄糖酸、α-酮基葡萄糖酸、羟基乙酸、水杨酸等。这些有机酸通过鏊合或络合作用与难溶性磷酸盐的Ca、Fe、Al等结合，使磷活化出来。国内外对溶磷菌研究结果表明，溶磷真菌的溶磷效果要远大于溶磷细菌，且效果稳定，所以近年来国外都非常注重对溶磷真菌的研究。如加拿大从土壤中分离出一株青霉菌，命名为拜来青霉(Penicilliumbilaii),用该菌株制成的解磷菌剂已在加拿大商品化生产，注册商品名为Provide 和JumpStart ;东北农业大学的许景刚教授也作了类似的研究，取得了较好的解磷效果。另外国内还有一些单位也相继报道一些溶磷或解磷菌剂，应用于农业生产，这些菌剂都是作为一种拌种剂或土壤处理剂。“保藏菌种一斜面菌种培养活化一摇瓶扩大培养一发酵罐液体发酵一按一定的比例用草炭吸附后包装或按一定的比例稀释后直接包装”，是目前国内微生物肥料生产企业普遍采用的工艺流程。其中微生物肥料的菌种生产主要采用深层液体发酵工艺。然而，尽管深层液体发酵工艺具有生产效率高、发酵条件可以实现制动化控制等优点，但其也存在投资巨大、生产成本高等缺点。此外，由于微生物肥料生产具有周期短，时间集中、生产设备利用率等特点(一般都集中在2-3个月内完成，使得生产设备有9-10个月处于停产状态)，这样由于生产设备的长期停滞，也极大地增加了设备检修、维护成本。高额的投入、较高设备检修、维护成本和低下的生产设备利用率极大地限制了一些中、小型企业在这领域的发展。尽管近几年来国内也相继出现了一些微生物肥料细菌菌种专门生产和供应冻干粉的企业，但到目前为止，在国内有关利用深层液体发酵技术生产真菌分生孢子未见报道。本发明针对微生物肥料菌种生产周期的特点和深层液体发酵工艺的缺点，根据土壤溶磷真菌的生物学特性，发明了一种投资少，无需深层液体发酵设备的土壤溶磷真菌接种剂工厂化生产新方法。
发明内容
要解决的问题本发明的目的为提供一种土壤溶磷真菌接种剂谷粒孢子粉的制备方法；本发明的另一目的是提供一种以平阳正青霉为母本筛选出合适的菌株，从而制成谷粒孢子粉的方法；本发明的另一目的是提供一种不需深层液体发酵、生产周期短的土壤溶磷真菌接种剂谷粒孢子粉的制备方法；本发明的另一目的是提供一种价格低廉、溶磷效果好的土壤溶磷真菌接种剂谷粒孢子粉。技术方案一种土壤溶磷真菌接种剂谷粒孢子粉的制备方法，包括以下步骤a.以平阳正青霉(Eupenicillium euglaucum)为母本，从其子囊孢子中筛选出一株利于作物根际分泌物生长和产酸能力强的无性系菌株(Eupenicillium euglaucumanamorph JB201015)；b.选出的菌株在25°C条件下培养活化1-2天后，用15mL无菌水洗脱孢子，制备孢子悬浊液；c.吸取所述IOmL孢子悬浊液，接种到IOOmL PD培养液的三角瓶中，在26°C条件下，震荡培养3-5天以获得液体菌种；d.将所述液体菌种/熟化谷粒比按5% (m/m :体积)接种到熟化谷粒中，然后将谷粒在25-27°C条件下，培养3-5天后，每隔2天翻动一次，共培养10_15天；e.当每个谷粒分生孢子量不少于300万个时，将谷粒直接粉碎得到孢子粉；当每个谷粒分生孢子不足300万时，需适当延长培养时间，直至每个谷粒分生孢子量不少于300万个，将谷粒直接粉碎得到孢子粉，最长培养时间为15天。f.将获得的孢子量不少于300万个的谷粒菌种与熟化谷粒I : I混合培养5-7天，当所有谷粒分生孢子量不少于300万个时，将谷粒直接粉碎得到孢子粉。 在步骤d中，所述熟化谷粒为籼米、粳米在2450MHZ微波中熟化2分钟制成；或所述熟化谷粒为粒径4-5mm的玉米碴在2450MHZ微波熟化3分钟制成，其中所述熟化谷粒的含水量要控制在18-20%。在步骤c中，所述震荡为120转/分钟的方式。
将谷粒籼米、粳米和/或玉米碴在60°C的水中浸30-45分钟后，在放入2450MHZ的微波中熟化2-3分钟，从而制成熟化谷粒。在所述步骤c中，所获得的液体菌种为3X107cfu/ml的菌丝体。一种根据上述制备方法所制成的孢子粉，所述孢子粉采用以下步骤制备a.以平阳正青霉(Eupenicillium euglaucum)为母本,从其子囊孢子中筛选出一株利于作物根际分泌物生长和产酸能力强的无性系菌株(Eupenicillium euglaucumanamorph JB201015)；b.选出的菌株在25°C条件下培养活化1-2天后，用15mL无菌水洗脱孢子，制备孢子悬浊液；c.吸取所述IOmL孢子悬浊液，接种到IOOmL PD培养液的三角瓶中，在26°C条件下，震荡培养3-5天以获得液体菌种；d.将籼米、粳米在2450MHZ微波中熟化2分钟制成熟化谷粒；或将粒径4_5mm的玉米碴在2450MHZ微波熟化3分钟制成熟化谷粒；其中所述熟化谷粒的含水量要控制在18-20%;再将所述液体菌种/熟化谷粒比按5% (m/m :体积)接种到熟化谷粒中，然后将谷粒在25-27°C条件下，培养3-5天后，每隔2天翻动一次，共培养10_15天；e.当每个谷粒分生孢子量不少于300万个时，将谷粒直接粉碎得到孢子粉；当每个谷粒分生孢子不足300万时，需适当延长培养时间，直至每个谷粒分生孢子量不少于300万个，将谷粒直接粉碎得到孢子粉，最长培养时间为15天；f.将获得的孢子量不少于300万个的谷粒菌种与熟化谷粒I : I混合培养5-7天，当所有谷粒分生孢子量不少于300万个时，将谷粒直接粉碎得到孢子粉。在制备步骤c中，所述震荡为120转/分钟的方式。在制备步骤d中，是将谷粒籼米、粳米和/或玉米碴在60°C的水中浸30-45分钟后，在放入2450MHZ的微波中熟化2_3分钟，从而制成熟化谷粒。在所述步骤c中，所获得的液体菌种为3X107cfu/ml的菌丝体。有益效果具体地说，本发明的优点如下投资少，低碳环保，在无需深层液体发酵设备的条件下，实现土壤溶磷真菌接种剂的工厂化生产。投资、能源消耗、运行成本仅为深层液体发酵工艺的1/3，无粉尘、废水和有毒气体排放。分生孢子含量高，平均每克谷粒分生孢子含量超过15亿，远远高于国家标准(GB20287-2006)规定的有效菌数。
图1为谷粒孢子粉生产的工艺流程图。
具体实施例方式微生物菌种采用平阳正青霉无性系菌株JB201015 (Eupenicillium euglaucumanamorph JB201015)。该菌株以购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)的平阳正青霉(编号
3.4396) (Eupenicillium euglaucum)为母本，从其子囊孢子中筛选出一株利于作物根际分泌物生长和产酸能力强的无性系菌株JB201015 (Eupenicillium euglaucum anamorphJB201015)，该菌株接种到作物根际土壤中后，可显著降根际土壤的pH值，促进作物根际土壤中难溶的磷酸盐CaHPO4 · 2H20和CaHPO4向Ca (H2PO4) 2转化，供作物吸收利用。具体的筛选方法为
取保藏号为CGMCC 3. 4396的平阳正青霉Eupenicillium euglaucum的子囊孢子一接种环，放入无菌水中，利用漩涡混合器震荡(120转/分钟)I分钟，使子囊孢子均匀地分散在无菌水中，制备成子囊孢子悬液；取O. Iml上述的子囊孢子悬液，均匀涂布在水琼脂平板上；将水琼脂平板置于显微镜下挑取单孢子，以多个点的方式接种于第一选择性培养基平板上，在25-27°C中培养10-15天；挑取在选择性培养基平板上具有清晰溶磷圈菌落的分生孢子，接种到第二选择性培养基平板上，同样在在25-27°C中培养10-15天，然后筛选获得一株具有最大溶磷圈的菌落的分生孢子。所述第一选择性培养基是由10g/L的葡萄糖、O. 5g/L的硫酸铵、O. lg/L的硫酸镁、
O.2g/L的氯化钾、O. 5g/L的酵母粉、O. 002g/L的硫酸亚铁、O. 2g/L的氯化钠、5g/L的磷酸氢钙、20g/L琼脂配成，再利用O. lmol/L的盐酸溶液和O. lmol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7. O。所述第二选择性培养基是由10g/L的麦芽糖、O. 5g/L的硫酸铵、O. lg/L的硫酸镁、
O.2g/L的氯化钾、O. 5g/L的酵母粉、O. 002g/L的硫酸亚铁、O. 2g/L的氯化钠、5g/L的磷酸氢钙、20g/L琼脂配成，再利用O. lmol/L的盐酸溶液和O. lmol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为
7.O。技术原理禾本科谷物的种子含有丰富的淀粉、纤维素、半纤维素、蛋白质、氨基酸及维生素和矿物质如磷、铁、镁等，其中禾本科谷物的种子的淀粉易水解成麦芽糖。从其营养成分组成来看，禾本科谷物的种子可以为绝大多数化能异养型微生物的生长、发育、繁殖提供碳源、氮源和矿物质等营养物质，是一种良好的天然培养基，并被广泛地应用于酿造业及食用菌栽培等领域的种子生产。技术路线依据平阳正青霉无性系菌株JB201015 (Eupenicillium euglaucum anamorphJB201015)对不同禾本科谷物的种子的利用能力，筛选出适合培养平阳正青霉无性系菌株JB201015 (Eupenicillium euglaucum anamorph JB201015)生长、发育的谷物种类。通过对平阳正青霉无性系菌株 JB201015 (Eupenicillium euglaucum anamorph JB201015)分生抱
子产率的影响因素研究，最终确定生产孢子粉的详细生产工艺。具体的方法步骤取斜面菌种一支，在25°C条件下培养活化1-2天；然后用15mL无菌水洗脱孢子，制备成孢子悬浊液，再吸取IOmL孢子悬浊液接种到IOOmL PD培养液的三角瓶中，在26°C条件下，震荡培养(具体的震荡方式可以采用120转/分钟)3-5天，从而获得液体菌种(此时的菌丝体3X107cfu/ml);将液体菌种与熟化谷粒按5% (m/m:重量比)接种到熟化谷粒(优选的谷粒为籼米、粳米、玉米碴(粒径4-5mm))中,在25-27°C条件下，培养3-5天后，每隔2天翻动一次，共培养10-15天。当每个谷粒分生孢子量不少于(或大于)300万个时，可以直接粉碎得到孢子粉；当每个谷粒分生孢子量不足300万时，可以适当延长培养时间，直至每个谷粒分生孢子量不少于300万个为止，整个过程最长的培养时间为15天。另一个可选方式为也可以将上述获得谷粒菌种再次与熟化谷粒I : I (重量比)混合后再培养5-7天，当检测到每个谷粒分生孢子量不少于(或大于)300万个时，粉碎得到孢子粉。将获得的干燥孢子粉分装待售。制备方法的控制要点(I)熟化谷粒含水量要控制在18-20 %，熟化谷粒是功过将谷粒玉米碴(粒径为4-5mm)在60°C的水中浸30-45分钟后，再放入2450MHZ左右的微波中熟化3分钟，从而制成熟化谷粒。对于籼米、粳米则应在60°C的水中浸30-45分钟后，再放入2450MHZ左右的微波中熟化2分钟，从而制成熟化谷粒。
(2)在25_27°C条件下，谷粒菌种培养3-5天后翻动，此后，每隔2天翻动一次。翻动过勤，会损伤分生孢子梗，影响分生孢子产率；翻动过迟，谷粒会因菌丝连接成团，同样影响分生孢子产率。(3)温度通常控制在22_27°C为宜，适宜菌体的培养，但是更为优选的温度是25°C或 26。。。上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的一个可行性实施例的具体说明，但是该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更，例如，等变化的等效性实施例，均应包含于本案的专利范围之内。
权利要求
1.一种土壤溶磷真菌接种剂谷粒孢子粉的制备方法，包括以下步骤 a.以平阳正青霉Eupenicilliumeuglaucum为母本,从其子囊孢子中筛选出一株利于作物根际分泌物生长和产酸能力强的无性系菌株Eupenicillium euglaucum anamorphJB201015 ； b.选出的菌株在22-27°C条件下培养活化1-2天后，用15mL无菌水洗脱孢子，制备孢子悬浊液； c.吸取所述IOmL孢子悬浊液，接种到IOOmLH)培养液的三角瓶中，在22_27°C条件下，震荡培养3-5天以获得液体菌种； d.将所述液体菌种/熟化谷粒比按5%(m/m:体积)接种到熟化谷粒中，然后将谷粒在25-27°C条件下，培养3-5天后，每隔2天翻动一次，共培养10_15天； e.当每个谷粒分生孢子量不少于300万个时，将谷粒直接粉碎得到孢子粉；当每个谷粒分生孢子不足300万时，需适当延长培养时间，直至每个谷粒分生孢子量不少于300万个，将谷粒直接粉碎得到孢子粉，最长培养时间为15天。
2.根据权利要求I中的土壤溶磷真菌接种剂谷粒孢子粉的制备方法，其特征在于还可以进一步包括以下步骤 f.将获得的孢子量不少于300万个的谷粒菌种与熟化谷粒I: I混合培养5-7天，当所有谷粒分生孢子量不少于300万个时，将谷粒直接粉碎得到孢子粉。
3.根据权利要求2中的土壤溶磷真菌接种剂谷粒孢子粉的制备方法，其特征在于 在步骤d中，所述熟化谷粒为軸米、梗米在2450MHZ微波中熟化2分钟制成；或所述熟化谷粒为粒径4-5mm的玉米碴在2450MHZ微波熟化3分钟制成，其中所述熟化谷粒的含水量要控制在18-20%。
4.根据权利要求3中的土壤溶磷真菌接种剂谷粒孢子粉的制备方法，其特征在于在步骤c中，所述震荡为120转/分钟的方式。
5.根据权利要求3中的土壤溶磷真菌接种剂谷粒孢子粉的制备方法，其特征在于将谷粒籼米、粳米和/或玉米碴在60°C的水中浸30-45分钟后，在放入2450MHZ的微波中熟化2-3分钟，从而制成熟化谷粒。
6.根据权利要求3中的土壤溶磷真菌接种剂谷粒孢子粉的制备方法，其特征在于在所述步骤c中，所获得的液体菌种为3X107cfu/ml的菌丝体。
7.一种根据上述权利要求中的制备方法所制成的孢子粉，所述孢子粉采用以下步骤制备 a.以平阳正青霉(Eupenicilliumeuglaucum)为母本,从其子囊孢子中筛选出一株利于作物根际分泌物生长和产酸能力强的无性系菌株(Eupenicillium euglaucum anamorphJB201015)； b.选出的菌株在25°C条件下培养活化1-2天后，用15mL无菌水洗脱孢子，制备孢子悬浊液； c.吸取所述IOmL孢子悬浊液，接种到IOOmLH)培养液的三角瓶中，在26°C条件下，震荡培养3-5天以获得液体菌种； d.将籼米、粳米在2450MHZ微波中熟化2分钟制成熟化谷粒；或将粒径4_5mm的玉米碴在2450MHZ微波熟化3分钟制成熟化谷粒；其中所述熟化谷粒的含水量要控制在18-20% ；再将所述液体囷种/熟化谷粒比按5% (m/m:体积)接种到熟化谷粒中，然后将谷粒在25-27°C条件下，培养3-5天后，每隔2天翻动一次，共培养10-15天； e.当每个谷粒分生孢子量不少于300万个时，将谷粒直接粉碎得到孢子粉；当每个谷粒分生孢子不足300万时，需适当延长培养时间，直至每个谷粒分生孢子量不少于300万个，将谷粒直接粉碎得到孢子粉，最长培养时间为15天； f.将获得的孢子量不少于300万 个的谷粒菌种与熟化谷粒I: I混合培养5-7天，当所有谷粒分生孢子量不少于300万个时，将谷粒直接粉碎得到孢子粉。
8.根据权利要求7中的孢子粉，其特征在于在制备步骤c中，所述震荡为120转/分钟的方式。
9.根据权利要求8中的孢子粉，其特征在于在制备步骤d中，是将谷粒籼米、粳米和/或玉米碴在60°C的水中浸30-45分钟后，在放入2450MHZ的微波中熟化2_3分钟，从而制成熟化谷粒。
10.根据权利要求9中的孢子粉，其特征在于在所述步骤C中，所获得的液体菌种为3X 107cfu/ml的菌丝体。
全文摘要
一种土壤溶磷真菌接种剂谷粒孢子粉及其制备方法。土壤溶磷真菌接种剂谷粒孢子粉的制备方法，是将培养好的液体菌种剂按剂量接种到事先熟化处理过的谷粒上，在一定条件下培养10-15天，当每个谷粒分生孢子量大于300万个时，就可以直接粉碎得到孢子粉；如果此时每个谷粒分生孢子量不足300万时，可以适当延长培养时间，最长培养时间为15天。上述方法不需采用深层液体发酵工艺，投入少、生产周期短、低碳环保，整个的制备过程操作简单、可重复性强。
文档编号C12N3/00GK102618481SQ20121008541
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者崔振 申请人:宋丹丹, 崔振