专利名称：稻瘟病抗性基因Pi1功能特异性分子标记Pi1FNP及其方法与应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pil功能特异性分子标记PilFNP及其方法与应用。
背景技术：
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻痕病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻痕病是对水稻生产危害最严重的病害之一,每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。传统的水稻抗性育种依赖于抗性表型的鉴定，这不仅要求育种者必须具备丰富的接种、调查经验，而且还容易受到环境以及人为因素的影响，鉴定结果容易造成误差，目标基因的选择效率往往较低。随着分子标记技术的产生以及利用，其方便、直接、不受环境影响等优点使得该技术的应用价值及前景越来越受到关注。在育种方面，通过开发与目标基因紧密连锁的分子标记，特别是在基因内部开发其功能特异性的分子标记来对目标基因进行选择，不仅选择可靠性高，而且还大大加快了育种步伐。到目前为止，已经有15个水稻稻瘟病抗性基因被分离克隆，其中包括位于第11 染色体长臂端Pik簇上的3个具有不同抗谱以及小种特异性的等位基因Pik-m(Ashikawa et al.2008. Two adjacent nucleotide-binding site-leucine-rich repeat class genes are required to confer pikm—specific rice blast resistance. Genetics 180 2267-2276)、Pik(Zhai et al. 2011. The isolation and characterization of Pik，a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication. New Phytologist 189 :321-334)以及 Pik_p(Yuan et al. 2011.The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NBS-LRR genes. Theor Appl Genet 122:1017-1028)。研究表明，这3个等位基因的稻瘟病抗性须由2个相邻的 NBS-LRR类型的抗病基因共同介导。同时，在水稻群体中，包含这3个等位基因的基因组区域存在着基因型的分化，即当相邻的2个功能性的NBS-LRR基因同时存在时，该基因型定义为K型；当相邻的2个功能性的NBS-LRR基因同时不存在时，该基因型定义为N型(基因型与感病水稻参考品种日本晴的相同)。此外，申请人通过图位克隆方法(Map-based cloning),在水稻供体品种 C101LAC(Inukai et al. 1994. Allelism of blast resistance genes in near-isogenic lines of rice. Phytopathology 84 :1278-1283)中分离、鉴定到了一个具有广谱、持久抗性的稻瘟病抗性基因Pil，在Pil的精细定位过程中发现，稻瘟病抗性基因Pil包括2个编码NBS-LRR类蛋白的基因Pil-I和Pil_2。在包含Pil位点的基因组区域中，PiI供体品种 C101LAC与Pik-m，Pik以及Pik-p的供体品种具有相似的基因组结构，即与参考序列日本晴之间存在着大片段的插入/缺失。进一步的功能互补实验结果证明了 Pil属于第4个分离得到的Pik簇的等位基因。然而，Pil所具有抗谱更广，抗性更持久的特点，使之更适合广泛应用于稻痕病抗性育种计划中(Inukai et al. 1994. Allelism of blast resistance genes in near-isogenic lines of rice. Phytopathology 84:1278-1283)。因此，为了加快Pil在抗病育种工作中的应用，如在大量的水稻种质资源中筛选、 鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、抗性基因Pil与其他功能基因的聚合育种、以及转基因育种等，开发出准确有效的Pil功能特异性分子标记显得尤其重要。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的是提供一种稻瘟病抗性基因 Pil功能特异性分子标记PilFNP。本发明的另一目的在于提供上述特异性分子标记PilFNP的方法。本发明的再一目的在于提供上述特异性分子标记PilFNP的应用。本发明目的通过以下技术方案实现一种稻瘟病抗性基因Pil功能特异性分子标记PilFNP，是通过引物对SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2从水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列，并与稻瘟病抗性基因Pil呈特异性带型，其中，所述引物对核苷酸序列为SEQ ID NO. 1(5，_3，) caatagtccagctaaaacggSEQ ID NO. 2(5，_3，) :cattgcgcctttaccttgt。优选的，所述水稻为稻瘟病抗性品种C101LAC。一种稻瘟病抗性基因Pil功能特异性分子标记PilFNP的方法，包括以下步骤I)通过常规PCR法扩增，获得多个水稻品种的Pil等位基因的编码区DNA序列；2)将步骤I)所获得的序列比对，得到Pil抗性基因所特异的功能特异性单碱基差异(SNP)；3)根据步骤2所得到的SNP，设计出引物对SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2，并用该引物对稻瘟病抗性水稻总DNA进行PCR扩增反应，扩增得到与稻瘟病抗性基因Pil呈特异性带型的核苷酸片段；4)对步骤3)所获得的核苷酸片段在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pil抗性基因的功能特异性的分子标记PilFNP。优选的，步骤I)所述的水稻品种为K型；步骤2)所述的序列比对优选为将核苷酸序列翻译成蛋白质序列后进行比对；步骤3)所述的不同水稻品种包括K型和N型水稻；步骤3)所述核苷酸片段大小为178bp ；步骤3)中所述引物是根据dCAPS标记原理，在SNP处设计带有错配碱基的功能特异性下游引物(SEQ ID NO. 2)，在SNP上游100-200bp处设计功能特异性上游引物(SEQ ID NO. I)；步骤3)所述的PCR扩增反应，其扩增反应体系如下ddH20 14. 3μ I10XPCR buffer (Mg2+Plus) :2 μ IdNTPs (2. 5mM each) I. 6 μ I
SEQ ID NO. I (10 μ Μ) :0. 5 μ ISEQ ID NO. 2 (10 μ Μ) :0· 5 μ ITaKaRa Taq (5U/μ I) 0. I μ IDNA 模版(20ng/ μ I) : I μ I温度循环条件如下94°C 3分钟；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C I分钟，35个循环；72°C 5分钟；10°C保存。一种稻瘟病抗性基因Pil功能特异性分子标记PilFNP的应用，包括如在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的应用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明的Pil功能特异性选择标记以PCR技术为基础，不仅能区分水稻品种的基因型，而且能够方便、快捷、直接地实现了目标基因Pii在大量的水稻种质资源以及育种后代中的鉴定，不受环境以及人为因素的影响，能得到广泛应用，对降低劳动成本，提高工作效率起到积极重要的作用。
图I是具有功能特异性SNP的水稻稻瘟病抗性基因Pil的组成基因之一 Pi 1-2与 Pik簇等位基因的多蛋白质序列比对图。图2是Pil功能特异性分子标记PilFNP在13个水稻品种中的验证图，其中，泳道I :抗性基因供体品种ClOlLAC(Pil)；泳道2 感病品种C039 ；泳道3 JRBLl-CL (PiI 单基因系)；泳道4 LTH(PiI单基因系的轮回亲本)；泳道5 :抗性品种 Tetep (Pil);泳道6 : IRBLks-S (Pik-s 单基因系);泳道7 =IRBLk-Ka (Pik 单基因系);泳道8 : IRBLkp-K6O (Pik 单基因系);泳道9 IRBLkh-K3 (Pik_h 单基因系);泳道10 : IRBLKM-TS (Pik-m 单基因系);泳道11 IRBLz-CA (Ρ 2 单基因系)；泳道12 IRBL7-M(Pi7 单基因系)；泳道13 IRBL9-ff(Pi9 单基因系)；M DNA ladder。图3A是Pil功能特异性分子标记PilFNP在基因型为K型受体品种的转基因后代群体中的验证图，其中泳道I为水稻ClOlIAC的DNA扩增结果；泳道2为水稻Q1063的DNA扩增结果；泳道3-7为水稻Q1063高抗性转化子(R型)的扩增结果；泳道8-9为水稻Q1063中度抗性转化子(MR型)的扩增结果；
泳道10-12为水稻Q1063感病转化子(S型)的扩增结果；M DNA ladder。图3B是Pil功能特异性分子标记之PilFNP在基因型为N型受体品种的转基因后代群体中的验证图，其中泳道I为以水作为对照的扩增结果；泳道2为水稻日本晴的DNA扩增结果；泳道3为水稻C1011AC的DNA扩增结果；泳道4，5，8，10为水稻日本晴感病转化子(S型)的扩增结果；泳道6，7，9为水稻日本晴高抗性转化子(R型)的扩增结果；M DNA ladder。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例I :Pil功能特异性分子标记及其引物设计与检测通过常规的PCR扩增(Yuanet al. 2011. The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NBS-LRR genes. Theor Appl Genet 122 :1017-1028 ;Zhai et al. 2011. The isolation and characterization of Pik，a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication. New Phytologist 189 :321-334)、测序(上海英骏生物技术有限公司，广州分公司)，从5个水稻品种C101LAC(Pil供体品种；Inukai et al. 1994. Allelism of blast resistance genes in near-isogenic lines of rice. Phytopathology 84 :1278-1283)、Tsuyuake (Pik_m 供体品种；Ashikawa et al. 2008. Two adjacent nucleotide-binding site-leucine-rich repeat class genes are required to confer Pikm—specific rice blast resistance. Genetics 180 :2267-2276)、Kusabue (Pik供体品种；Zhai et al. 2011. The isolation and characterization of Pik, a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication. New Phytologist 189 :321-334)、K60 (Pik-p供体品种；Yuan et al. 2011. The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NBS-LRR genes. Theor Appl Genet 122:1017-1028)以及 Q1063(感病品种；Zhai et al. 2011. The isolation and characterization of Pik, a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication. New Phytologist 189 321-334)中获得相应的Pil等位基因编码区DNA序列(其中，基因Pik-m、Pik，Pik-p 序列已经公开于 http://www. ncbi. nlm. nih. rov,基因编号分别为 AB462256、HM048900、 HM035369;感病品种Q1063的序列如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示);利用多序列比对软件工具(http://multalin. toulouse. inra. fr/multalin/)，通过对这些序列翻译后的蛋白质序列比对分析，鉴定到在Pil-2部分具有的功能特异性单碱基差异(SNP)，比对结果如图I所示，其中，方框标记内的内容表示由该SNP造成的功能特异性氨基酸的改变。根据dCAPS标记(DerivedCleaved Amplified Polymorphic Sequences ；Neff et al.2002. Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis.Trends in Genetics 18:613-615)的设计原理，利用 Primer Premier 5.0 软件工具 (http://www. premierbiosoft. com),在该SNP上游100_200bp处设计功能特异性上游引物，在该SNP处设计带有错配碱基的功能特异性下游引物。引物对碱基序列如SEQ ID NO. I 和SEQ ID NO. 2所示。通过该引物对对携带有Pil基因以及其他等位基因的品种DNA模板进行扩增，扩增出的核苷酸片段即为PilFNP。PilFNP的PCR扩增反应体系如下ddH20 14. 3μ I10XPCR buffer (Mg2+Plus) :2 μ IdNTPs (2. 5mM each) I. 6 μ ISEQ ID NO. I (10 μ Μ) :0. 5 μ ISEQ ID NO. 2 (10 μ Μ) :0. 5 μ ITaKaRa Taq (5U/ μ I) :0. I μ IDNA 模版(20ng/ μ I) : I μ IPilFNP的PCR扩增反应温度循环条件如下94°C 3分钟；94°C 30秒、58°C 30秒、 72°C I分钟，35个循环；72°C 5分钟；10°C保存。PCR反应结束后，利用限制性内切酶Rsa I对所获得的PCR产物进行酶切，反应体系如下ddH20 3. 7μ IIOXbuffer I I μ IPCR 产物5 μ IRsa I 0. 3μ I在37°C条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在6%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为80V，2小时30分钟。实施例2 :抗性基因Pil功能特异性分子标记在鉴别不同稻瘟病抗性基因中的应用采集含有不同的稻瘟病抗性基因的13个水稻品种，分别为C101LAC、C039、 IRBLl-CL、LTH、Tet印、IRBLks-S、IRBLk-Ka,IRBLkp_K60、IRBLkh_K3、IRBLKM-TS,IRBLz-CA、 IRBL7-M、IRBL9-W(13 个水稻品种皆在非专利文献“Kobayashi et al. 2007. Development of new sets of international standard differential varieties for blast resistance in rice (Oryza sativa L.). JARQ 41 :31_37”中公开)的基因组DNA,并以此为模板，利用实施例I中描述的PilFNP的PCR扩增反应体系和反应条件，对抗性基因Pil功能特异性的分子标记进行PCR扩增、酶切及电泳检测(扩增所得到的PCR产物大小为178bp， 酶切后所得到的产物大小为159bp)。电泳结果如图2所示，其中，低带代表含有Pil基因， 高带为不含Pil基因，而泳道表现杂合带型说明该品种在目标基因位点呈现杂合状态(未纯合)。如
的那样，试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pil功能特异性分子标记可在鉴别Pil基因与其他稻瘟病抗性基因，包括Pik等位基因等方面得到应用。实施例3 :抗性基因Pil功能特异性分子标记在鉴别不同受体品种转基因后代植株中的应用
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I):采集 10 个以基因型为 K 型受体品种 Q1063(Yuan et al. 2011. The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NBS-LRR genes. Theor Appl Genet 122 :1017-1028 ;Zhai et al. 2011. The isolation and characterization of Pik, a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication. New Phytologist 189 :321-334)的转化子后代的基因组DNA,并以此为模板，利用实施例I中描述的PilFNP的PCR扩增反应体系和反应条件，对抗性基因Pil 功能特异性的分子标记进行PCR扩增、酶切及电泳检测。根据多态性的PCR产物(条带)， 可以把含有目标基因Pil与不含有目标基因Pil的转基因个体区分开来。如图3A所示，在表型为高抗性(R型)或者中度抗性(MR型)的个体中能检测到Pil功能特异性分子标记的存在(有高、低两条带)，而表型为感病(S型)的个体则不能(只有高条带)。2):米集8个以基因型为N型受体品种日本晴(Nipponbare) (Ashikawa et al.2008.Two adjacent nucleotide-binding site-leucine-rich repeat class genes are required to confer Pikm-specific rice blast resistance. Genetics 180 2267-2276)的转基因后代的基因组DNA，并以此为模板，利用实施例I中描述的PilFNP的 PCR扩增反应体系和反应条件，对抗性基因Pil功能特异性的分子标记进行PCR扩增、酶切及电泳检测。根据PCR产物(条带)的有无，可以把含有目标基因Pil与不含有目标基因 Pil的转基因个体区分开来。如图3B所示，在表型为高抗性(R型)的个体中能检测到Pil 功能特异性分子标记的存在，而表型为感病(S型)的个体则不能检测到该分子标记。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种稻瘟病抗性基因Pil功能特异性分子标记Pi 1FNP，其特征在于通过引物对SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2从水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列，并与稻瘟病抗性基因Pil 呈特异性带型，其中，所述引物对核苷酸序列为SEQ ID NO. 1(5，_3，) caatagtccagctaaaacggSEQ ID NO. 2(5，-3，) :cattgcgcctttaccttgt。
2.根据权利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pil功能特异性分子标记PilFNP，其特征在于所述水稻为稻瘟病抗性品种C101LAC。
3.根据权利要求I所述的稻瘟病抗性基因Pil功能特异性分子标记PilFNP的方法，其特征在于包括以下步骤1)通过常规PCR法扩增，获得多个水稻品种的Pil等位基因的编码区DNA序列；2)将步骤I)所获得的序列比对，得到Pil抗性基因所特异的功能特异性单碱基差异；3)根据步骤2所得到的SNP，设计出引物对SEQID NO. I和SEQ ID NO. 2，并用该引物对稻瘟病抗性水稻总DNA进行PCR扩增反应，扩增得到与稻瘟病抗性基因Pil呈特异性带型的核苷酸片段；4)对步骤3)所获得的核苷酸片段在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pil抗性基因的功能特异性的分子标记PilFNP。
4.根据权利要求3所述的稻瘟病抗性基因Pil功能特异性分子标记PilFNP的方法，其特征在于步骤I)所述的水稻品种为K型。
5.根据权利要求3所述的稻瘟病抗性基因Pil功能特异性分子标记PilFNP的方法，其特征在于步骤2)所述的序列比对优选为将核苷酸序列翻译成蛋白质序列后进行比对。
6.根据权利要求3所述的稻瘟病抗性基因Pil功能特异性分子标记PilFNP的方法，其特征在于步骤3)所述的不同水稻品种包括K型和N型水稻。
7.根据权利要求3所述的稻瘟病抗性基因Pil功能特异性分子标记PilFNP的方法，其特征在于步骤3)所述核苷酸片段大小为178bp。
8.根据权利要求3所述的稻瘟病抗性基因Pil功能特异性分子标记PilFNP的方法，其特征在于步骤3)中所述引物是根据dCAPS标记原理，在SNP处设计带有错配碱基的功能特异性下游引物SEQ ID NO. 2，在SNP上游100-200bp处设计功能特异性上游引物SEQ ID NO. I。
9.根据权利要求3所述的稻瘟病抗性基因Pil功能特异性分子标记PilFNP的方法，其特征在于步骤3)所述的PCR扩增反应，其扩增反应体系如下ddH20 14. 3u I含 Mg2+ 的 10XPCR buffer 2u I2.5mM dNTPs 1. 6u IIOiiM 弓丨物 I 0. 5u IIOiiM 弓丨物 2 0. 5u I5U/u I TaKaRa Taq 0. I U I20ng/ u I DNA 模板I u I ;温度循环条件如下94°C 3分钟；94°C 30秒、58°C 30秒、72°C I分钟，35个循环； 72°C 5分钟；10°C保存。
10.根据权利要求I或2所述的稻瘟病抗性基因Pil功能特异性分子标记PilFNP在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种稻瘟病抗性基因Pil功能特异性分子标记PilFNP及其方法与应用。该分子标记为引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列。本发明通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pil的等位基因序列与水稻稻瘟病抗性基因Pil序列做比对的方法，分析得到能区别于其感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pil功能特异性的单碱基差异(SNP)，再通过设计得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物，对水稻DNA扩增得到Pil功能特异性分子标记PilFNP。本发明可在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中得到应用。
文档编号C12N15/11GK102586238SQ201210039960
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月21日 优先权日2012年2月21日
发明者华丽霞, 林菲, 潘庆华, 王玲 申请人:华南农业大学