专利名称：一种用于从孢子捕捉器的捕捉带上提取小麦白粉菌dna的方法
技术领域：
本发明“一种用于从孢子捕捉器的捕捉带上提取小麦白粉菌DNA的方法”可用于提取经孢子捕捉器收集到的白粉菌分生孢子的DNA，属于植物病害领域。
背景技术：
由专性寄生真菌Blumeria graminis f.sp.tritici引起的小麦白粉病是我国小麦生产上的重要病害之一，提高此病害的预测水平可以有效地控制病害流行和减少农药的使用。小麦白粉病作为一种典型的气传性真菌病害，空气中白粉菌分生孢子的数量或密度是该病害发生和流行的一个重要驱动变量，病原菌的侵染能力、生存力、传播能力与病害的流行速度、流行长短及分布有很重要的关系。小麦白粉病春季一般可发生再侵染5 6代，白粉菌分生孢子的传播是引起该病害再侵染的基础，明确病害发生的初侵染菌量或再侵染菌量，对于认识病害的流行规律和提高病害的预测预报水平有十分重要的作用。种植抗病品种和使用化学农药是防治小麦白粉病的的两个主要措施，了解病原菌的抗药性现状可以有效地指导农药的合理使用，所有这些都需要实现对病原菌的采样。利用孢子捕捉器可以实现对空气中病原菌孢子的连续采样，收集到的病原菌孢子不仅可以用来明确病害发生的初侵染菌量或再侵染菌量，预测病害的发生和流行，而且还可用于病原菌的抗药性监测。但常规的病菌孢子种类鉴定和计数方法是在显微镜下根据孢子的形态特征来判 断，仅根据形态特征来判断容易产生误判，不能满足病害监测中准确和快速的要求。加上小麦白粉病菌是一种专性寄生真菌，只能在活体小麦上保存和培养，因此通过孢子捕捉器收集的小麦白粉菌分生孢子不能用于白粉菌的抗药性监测。Real-timePCR定量技术可以较好地解决这些问题，并且在病原菌定量和抗药性监测等方面已经应用比较广泛，在该技术体系中，如何从样本中提取靶标生物的DNA是基础，而利用孢子捕捉器搜集到的孢子往往被吸附在捕捉带上，首先需要将其从捕捉带上洗脱和破壁后才能进行DNA的提取。目前还未见有从孢子捕捉器的捕捉带上提取小麦白粉菌分生孢子DNA的研究报道。
发明内容
技术问题利用孢子捕捉器可以连续收集空气中小麦白粉菌的分生孢子，但是如何准确、快速的实现对病原菌孢子的识别和定量检测及扩大该类仪器在病害研究中的应用，本研究发明的目的是提供用于从孢子捕捉器的捕捉带上提取白粉菌孢子DNA的方法，从而为利用分子生物学技术明确病害发生的初侵染菌量或再侵染菌量及抗药性监测提供基础。技术方案一种用于从孢子捕捉器的捕捉带上提取白粉菌DNA的方法，包括:I)样品制备
将至于田间的孢子捕捉器捕捉带剪成48mm长的片段，每段代表I天。2)捕捉带上白粉菌分生孢子的洗脱和破壁将捕捉带剪成6段，放入2ml离心管中，加入400 μ I Nonidet Ρ-40和0.2g直径为400-600 μ m的玻璃珠，在65°C下温育30min。在Fast-Prep 仪器上以6m/s震荡40s 2次后在冰上放置2min，然后再以6m/s震荡40s 2次，可把捕捉带洗脱白粉菌分生孢子洗脱下来，并得到破壁的病菌孢子悬浮液。3) DNA的提取和纯化将洗脱和破壁的孢子悬浮液转入另一离心管中，按常规方法加提取缓冲液进行DNA提取和纯化或按试剂盒的提取方法进行DNA的提取和纯化。4)提取结果评价以纯化好的DNA为模板，以小麦白粉菌的特异性引物5’ -AAGCTATGCGGAACTTCGITT-3’ ；5’ -TAAGGAGITTTGGCAAGTCCC-3’ 进行 PCR 扩增，根据扩增产物的大小和有无来判定结果。有益效果本发明一种用于从孢子捕捉器的捕捉带上提取白粉菌DNA的方法，可用来提取由孢子捕捉器收集到的小麦白粉菌分生孢子的DNA，与国内外现有方法相比，本发明具有以下的技术优势:I)结果准确。和传统的病原菌识别方法相比，PCR技术根据扩增产物的有无来直接判断病原菌是否属于本种，结果客观，不代表任何主观性，也不会因病原菌形态特征相似发生误判。由于时间限制，传统的在显微镜下只能对捕捉带的部分区域进行观察，只能获得观察部分的信息，而本发明可以获得捕捉带上的全部信息。2)效率高。本发明一次可以同时对多台仪器和多个时间段的样本进行处理，提高了效率。3)用途广。利用本发明提取小麦白粉菌分生孢子的DNA后，不仅可用于病害识别和病害发生和流行定量监测，还可直接用于病原菌群体的抗药性监测等研究工作。因此本方法实用性强，可满足病害检测、监测及研究的需要。
图1:CTAB法提取孢子捕捉器捕捉带上小麦白粉菌DNA后的PCR扩增结果M:分子量标准DGL100 ；1:阳性对照；2:捕捉带上分生孢子数78 ；3:捕捉带上分生孢子数8 ；4:捕捉带上分生孢子数54 ；5:捕捉带上分生孢子数108 ；6:捕捉带上分生孢子数83 ；7:捕捉带上分生孢子数14 ；8:阴性对照图2:试剂盒法提取孢子捕捉器捕捉带上小麦白粉菌DNA后的PCR扩增结果M:分子量标准DGL100 ；1:阳性对照；2:捕捉带上分生孢子数58 ；3:捕捉带上分生孢子数6 ；4:捕捉带上分生孢子数16 ；5:捕捉带上分生孢子数94 ；6:捕捉带上分生孢子数76 ；7:阴性对照
具体实施例方式实施例1:传统C TAB法提取孢子捕捉器捕捉带上小麦白粉菌DNA
I)样品制备将从田间孢子捕捉器上取回的捕捉带剪成长为48mm的片段。2)捕捉带上白粉菌孢子的洗脱和破壁将捕捉带剪成6段，放入2ml离心管中，加入400 μ I Nonidet Ρ-40和0.2g直径为400-600 μ m的玻璃珠，在65°C下温育30min。在Fast-Prep 仪器上以6m/s震荡40s 2次后在冰上放置2min，然后再以6m/s震荡40s 2次，可把捕捉带洗脱白粉菌分生孢子洗脱下来，并得到破壁的病菌孢子悬浮液。3) DNA的提取和纯化将洗脱和破壁孢子悬浮液转入另一离心管中，按传统的CTAB法进行白粉菌分生孢子DNA的提取和纯化。4)提取结果评价以纯化好的DNA为模板，以小麦白粉菌的特异性引物5’ -AAGCTATGCGGAACTTCGITT-3’ ；5’ -TAAGGAGITTTGGCAAGTCCC-3’ 进行 PCR 扩增，根据扩增产物的大小和有无来判定结果。实施结果以利用CTAB法对破壁后小麦白粉菌分生孢子悬浮液进行提取纯化好的DNA为模板，以已经报道的小麦 白粉菌特异性引物进行PCR扩增后，在部分样品中扩增出了与阳性对照大小一致的目的条带(图1)，说明DNA已成功提取出来。实施例2 =DNA提取试剂盒法提取孢子捕捉器捕捉带上小麦白粉菌DNAI)样品制备将从田间孢子捕捉器上取回的捕捉带剪成长为48mm的片段。2)捕捉带上白粉菌分生孢子的洗脱和破壁将捕捉带剪成6段，放入2ml离心管中，加入400 μ I Nonidet Ρ-40和0.2g直径为400-600 μ m的玻璃珠，在65°C下温育30min。在Fast-Prep 仪器上以6m/s震荡40s 2次后在冰上放置2min，然后再以6m/s震荡40s 2次，可把捕捉带洗脱白粉菌分生孢子洗脱下来，并得到破壁的病菌孢子悬浮液。3) DNA的提取和纯化将洗脱和破壁的孢子悬浮液转入另一离心管中，按试剂盒法伤的描述进行白粉菌分生孢子DNA的提取和纯化。4)提取结果评价以纯化好的DNA为模板，以小麦白粉菌的特异性引物5’ -AAGCTATGCGGAACTTCGITT-3’ ；5’ -TAAGGAGITTTGGCAAGTCCC-3’ 进行 PCR 扩增，根据扩增产物的大小和有无来判定结果。实施结果以利用试剂盒法对破壁后小麦白粉菌分生孢子悬浮液进行提取纯化好的DNA为模板，以已经报道的小麦白粉菌特异性引物进行PCR扩增后，在部分样品中扩增出了与阳性对照大小一致的目的条带(图2)，说明DNA已成功提取出来。
权利要求
1.在一种用于从孢子捕捉器的捕捉带上提取小麦白粉菌DNA的方法发明中，主要涉及一种对孢子捕捉器捕捉带上所收集的小麦白粉菌分生孢子洗脱和破壁的合适方法为将捕捉带剪成6段，放入2ml离心管中，加入400 μ I Nonidet Ρ-40和O. 2g直径为400-600 μ m的玻璃珠，在65°C下温育30min。在Fast-Prep 仪器上以6m/s震荡40s 2次后在冰上放置2min,然后再以6m/s震荡40s 2次，可把捕捉带洗脱白粉菌分生孢子洗脱下来，并得到破壁的病菌孢子悬浮液，然后用常规方法或试剂盒的提取方法进行DNA的提取和纯化。
全文摘要
本发明“一种用于从孢子捕捉器的捕捉带上提取小麦白粉菌DNA的方法”可用于提取经孢子捕捉器收集到的白粉菌分生孢子的DNA，属于植物病害流行监测领域。该发明首先通过对孢子捕捉器捕捉带上收集到的小麦白粉菌的分生孢子进行洗脱和破壁，然后对破壁后分生孢子的DNA进行提取和纯化，从而为利用分子生物学定量研究技术开展病害的发生流行监测服务。该发明提取的DNA不仅可用用来准确定量检测孢子捕捉器收集到的小麦白粉菌分生孢子，而且还可直接用于抗药性监测。此技术可作为病害监测技术在各地推广应用。
文档编号C12R1/645GK103255129SQ201210039038
公开日2013年8月21日 申请日期2012年2月21日 优先权日2012年2月21日
发明者曹学仁, 周益林, 骆勇, 段霞瑜, 陈万权 申请人:中国农业科学院植物保护研究所