专利名称：一株产果聚糖蔗糖酶的菌株及用该酶生产果聚糖的方法
技术领域：
本发明涉及能够生产果聚糖蔗糖酶的一种新微生物菌株及其培养发酵生产果聚糖蔗糖酶，并将该酶用于生物制备果聚糖的方法，属于食品生物技术领域。更具体的说本发明涉及来源于土壤的甲基营养芽孢杆菌(也<^77心methylotrophicus) SK 21. 002,它能够产生果聚糖蔗糖酶，并利用该酶催化蔗糖合成果聚糖(levan)。
背景技术：
近年来，功能食品成为广大消费者关注的热点，更是广大食品从业者研发的焦点。 糖尿病、肥胖和心血管疾病人群的逐年增加和低龄化，使得低热量、具有更多功能营养特性的功能食品配料成为关注的热点。
果聚糖，是由D-果糖经P (2 — 6)键连接而成的线性直链多糖，聚合度(DP)为 2 90，平均在14 20，聚合度较低时(DP=2 9)则称为低果聚糖。果聚糖可用作水溶性的膳食纤维，胶体稳定剂等，它能减少胆固醇和猪油、脂肪等动植物脂肪在人体中的吸收，加快人体对金属离子的吸收，并能调理肠道，比如肠道双歧杆菌的增生和限制食品工业中有毒微生物的生长，也能用作清洁剂的软化剂，血浆添加物和化妆品的保湿剂。2001年3月， 使用果聚糖作为食品的国家有美国(FDA )、欧洲(SCF )、日本、澳大利亚和新西兰(ANZFA )。 大多数发达国家批准果聚糖为食品原料。在日本，果聚糖被用作乳酸菌食品的原料。
因此，果聚糖作为一种功能性食品添加剂广泛应用于低脂食品、糖果、糕点等食品。
酶法合成是工业化生产果聚糖的主要途径。酶法合成果聚糖的产率受多种因素影响，酶的来源直接影响酶法合成的果聚糖的结构和产率。迄今为止，已发现多种微生物可以产生此酶，其中主要集中在解淀粉芽孢杆菌{Bacillus amyIoIiquefaciens、、'运_另]发_ 酵单胞菌QZytnotnonas mobi/is )、枯草芽抱杆菌iBaciIlus sub )、多粘类芽抱杆菌 {PaenibadIlus polymyxa^{Actinomyces iscosus、。
本发明人深入调查和研究了现有技术并对各种高收率生产果聚糖的方法进行了研究，最终我们筛选到一株能产生果聚糖蔗糖酶的新微生物，证明了通过此酶与高浓度的蔗糖反应能得到高转化率的果聚糖，并通过浓缩干燥等手段得到果聚糖的糖浆或粉末。基于上述发现提出了本发明。发明内容
本发明的目的是提供一种新的微生物，它能够生产高酶活的果聚糖蔗糖酶。
本发明的另一个目的是提供一种该果聚糖蔗糖酶与高浓度蔗糖溶液反应的方法， 以得到高转化率的果聚糖。
本发明的再一个目的是提供一种果聚糖提纯与精制的方法，以得到高浓度果聚糖糖浆或粉末。
为了实现上述目的，本发明提供一株来源于土壤的甲基营养芽孢杆菌me thyIo trophi cus ) SK21. 002,其为能够产生果聚糖鹿糖酶的菌株,并利用该果聚糖鹿糖酶转化蔗糖生成果聚糖。
本发明的技术方案一株产果聚糖蔗糖酶的菌株，其分类命名为甲基营养芽孢杆菌{Bacillus me thyIo trophi cus ) SK21. 002,已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC NO M 2011476。
用所述的微生物甲基营养芽孢杆菌CCTCC NO M 2011476，发酵生产果聚糖蔗糖酶的方法，步骤为(1)种子培养种子培养基酵母膏l-10g/L，蛋白胨l-20g/L，葡萄糖l-40g/L，pH6. 0-8. 0，去离子水配制；种子培养条件菌株于30-37 °C、150-250rpm的振荡速度下在种子培养基中培养 10-20h活化该菌株；(2)发酵培养发酵培养基酵母膏l_20g/L，蛋白胨l-20g/L，蔗糖l-30g/L，pH6. 0-8. 0，去离子水配制；发酵条件接种量1%_10%，30-37°C、搅拌速度100-700rpm、空气流量0. 1-1. Ovvm的条件下在发酵培养基中发酵10-48h生产果聚糖蔗糖酶；(3)发酵后处理发酵液经冷冻离心后收集上清液即为粗酶液，经检测酶活达到l_50U/mL ；所得粗酶液进一步超滤浓缩，或用硫酸铵沉淀蛋白质，离心和冷冻干燥得到果聚糖蔗糖酶的粗酶粉。
用制备的果聚糖蔗糖酶转化蔗糖生产果聚糖的方法，向底物蔗糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶进行催化转化生产果聚糖，转化条件为蔗糖溶液的蔗糖质量浓度为10%-50%，果聚糖蔗糖酶添加量0. 5-50U/g蔗糖，pH4. 0-8.0，转化反应温度为40_60°C，转化反应时间 24-72h，转化率可达10%以上，得到含有果聚糖的酶反应液，进一步加工处理用来制备果聚糖糖浆或果聚糖粉末。
果聚糖糖浆的制备方法，步骤为(1)脱色在含有果聚糖的酶反应液中添加酶反应液固形物质量含量0. 2%-2. 0%的活性炭,在 50-80°C下温育10-60min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；(2)浓缩将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为10%-70%，即得果聚糖糖浆。
果聚糖粉末的制备方法，步骤为(1)脱色同果聚糖糖浆制备所述的脱色步骤；(2)浓缩将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为10%-70%的浓缩液；(3)喷雾干燥控制进风温度150-200°C、出风温度50-100°C，将果聚糖浓缩液喷雾干燥，得到果聚糖粉末。
本发明的有益效果本发明涉及一株从土壤中筛选而来的甲基营养芽孢杆菌 {Bad Ilus me thy I o trophi cus) SK 21. 002,以此甲基营养芽孢杆菌为发酵菌株，以鹿糖为碳源、酵母浸出物和蛋白胨为氮源等组成发酵培养基，发酵生产果聚糖蔗糖酶，发酵后经检测，在发酵液中酶活达到l_50U/mL。将该果聚糖蔗糖酶添加到质量浓度10%-50%蔗糖溶液中催化合成果聚糖，转化24-72h，转化率达10%以上。本发明方法生产的果聚糖产品安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性食品配料。
生物材料样品保藏一株产果聚糖蔗糖酶的菌株，其分类命名为甲基营养芽孢杆儀{Bacillus me thy I o trophi cus) SK 21. 002,已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称 CCTCC，地址中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO M 2011476，保藏日期2011年12月 23日。
具体实施方式
以下是甲基营养芽孢杆菌SK21. 002进行发酵生产果聚糖蔗糖酶及酶法转化生产果聚糖的实施实例，但本发明并不限于所列出的几个实例。
实施例I微生物发酵产酶用SK21. 002进行培养发酵，按说明书所述的发酵条件，通过对不同发酵时间产酶的检测，发现发酵20h后酶活已经趋于平稳，故确定发酵时间为20h左右。发酵时间对产果聚糖蔗糖酶的影响如表I所示。酶活力定义为每分钟转移I U mol果糖所需的酶量为一个果聚糖蔗糖酶活力单位。
酶活的测定方法HPLC法测定果聚糖的生成量。
表I发酵时间对产果聚糖蔗糖酶的影响时间(h)691215182022果聚糖蔗糖酶酶活(U/mL)0. 56I. 26I. 49I. 62I. 902. 892. 62实施例2酶法转化蔗糖生成果聚糖向质量浓度20%蔗糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶催化转化，转化条件为底物蔗糖质量浓度为20%，pH7. 0，果聚糖蔗糖酶添加量0. 5-50U/g蔗糖，转化反应温度为50°C，转化反应时间48h。
实施例3果聚糖糖浆的制备(1)脱色在含有果聚糖的酶反应液中添加酶反应液固形物质量含量0. 2%-2. 0%的活性炭,在 50-80°C下温育10-60min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；(2)浓缩将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为20%-70%，即得果聚糖糖浆。
实施例4果聚糖粉末的制备(I)脱色同实施例3的脱色条件。
(2)浓缩将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为10%-70%的浓缩液；(3)喷雾干燥控制进风温度150-200°C、出风温度50-100°C，将果聚糖浓缩液喷雾干燥，得到果聚糖粉末。
权利要求
1.一株产果聚糖蔗糖酶的菌株，其分类命名为甲基营养芽孢杆菌 methylotrophicus)^ 21. 002，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M 2011476。
2.用权利要求I所述的CCTCCNO M 2011476菌株发酵生产果聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于步骤为(1)种子培养种子培养基酵母膏l-10g/L，蛋白胨l-20g/L，葡萄糖l-40g/L，pH6. 0-8. 0，去离子水配制；种子培养条件CCTCC NO M 2011476菌株于30-37°C、150-250rpm的振荡速度下在种子培养基中培养10-20h活化该菌株；(2)发酵培养发酵培养基酵母膏l_20g/L，蛋白胨l-20g/L，蔗糖l-30g/L，pH6. 0-8. 0，去离子水配制；发酵条件接种量1%_10%，30-37°C、搅拌速度100-700rpm、空气流量0. 1-1. Ovvm的条件下在发酵培养基中发酵10-48h生产果聚糖蔗糖酶；(3)发酵后处理发酵液经冷冻离心后收集上清液即为粗酶液，经检测酶活达到1-50 U/mL ；所得粗酶液进一步超滤浓缩，或用硫酸铵沉淀蛋白质，离心和冷冻干燥得到果聚糖蔗糖酶的粗酶粉。
3.用权利要求2所述方法制备的果聚糖蔗糖酶转化蔗糖生产果聚糖的方法，其特征在于向底物蔗糖溶液中添加果聚糖蔗糖酶进行催化转化生产果聚糖，转化条件为蔗糖溶液的蔗糖质量浓度为10%-50%，果聚糖蔗糖酶添加量0. 5-50U/g蔗糖，pH4. 0-8. 0，转化反应温度为40-60°C，转化反应时间24-72h，转化率达10%以上，得到含有果聚糖的酶反应液，进一步加工处理用来制备果聚糖糖浆或果聚糖粉末。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于果聚糖糖浆的制备方法，步骤为(1)脱色在含有果聚糖的酶反应液中添加酶反应液固形物质量含量0. 2%-2. 0%的活性炭,在 50-80°C下温育10-60min，然后进行硅藻土过滤，取脱色液；(2)浓缩将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为10%-70%，即得果聚糖糖浆。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于果聚糖粉末的制备方法，步骤为(1)脱色同果聚糖糖浆制备所述的脱色步骤；(2)浓缩将脱色液真空蒸发浓缩至固形物质量含量为10%-70%的浓缩液；(3)喷雾干燥控制进风温度150-200°C、出风温度50-100°C，将果聚糖浓缩液喷雾干燥，得到果聚糖粉末。
全文摘要
一株产果聚糖蔗糖酶的菌株及用该酶生产果聚糖的方法，属于食品生物技术领域。本发明涉及一株从土壤中筛选而来的甲基营养芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)SK21.002，以此甲基营养芽孢杆菌为发酵菌株，以蔗糖为碳源、酵母浸出物和蛋白胨为氮源等组成发酵培养基，发酵生产果聚糖蔗糖酶，发酵后经检测，在发酵液中酶活达到1-50U/mL。将该果聚糖蔗糖酶添加到质量浓度10%-50%蔗糖溶液中催化合成果聚糖，转化24-72h，转化率达10%以上。本发明方法生产的果聚糖产品安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性食品配料。
文档编号C12N1/20GK102533605SQ20121001200
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者张涛, 李润静, 江波, 沐万孟, 缪铭 申请人:江南大学