专利名称：一种检测乌骨鸡纤维黑色素基因纯合或杂合的方法
技术领域：
本发明涉及分子标记检测技术，具体地说，涉及一种检测乌骨鸡纤维黑色素基因纯合或杂合的方法。
背景技术：
随着畜牧业的发展，外貌特征在鸡的育种和保种中占据重要地位，分子标记也在育种和保种中起到了重要作用。但是对于控制外貌特征的分子标记的研究仍然较少，仅有少量的外貌特征能够通过分子标记进行辅助选择育种。乌骨鸡作为中国特有鸡种，具有乌皮、乌骨、乌肉等“十全”特征。其中乌骨鸡的黑色特征主要受到纤维黑色素基因(Fm+/fm_)的影响。乌骨鸡的结缔组织呈黑色(Kuklenski， 1915)，鸡冠、肉髯呈深紫色，耳朵、脚胫及喙呈蓝色。携带Fm基因的鸡种中，黑色素出现的部位包括肌膜、神经、肌腱、血管、性腺、肠系膜、骨膜与皮肤真皮层等。出于对乌骨鸡“乌色”的重视，中国利用乌骨鸡的骨头与肌肉作为传统中药的引药，一些携带Fm基因的改良鸡种，饲养至12-14周龄作为传统料理的食材。Fm基因控制的黑色表型相对于fm基因控制的非黑色表型是一种单位点控制的显性性状，因而在保种和育种的过程中，根据表型无法准确区分显性纯合子和杂合子个体，造成选育效率低下。随着分子数量遗传理论的发展，需找到影响真皮层黑色性状的分子标记， 通过标记辅助选择，可以迅速准确地鉴定候选个体的基因型，从根本上解决这一保种和育种问题。DNA分子标记是以个体间遗传物质中的核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是 DNA水平遗传多态性的直接反映。在鸡基因组中分布有大量的分子标记，携带巨大的遗传信息量，目前已经有多个重要性状得到了定位，可以利用相关的分子标记进行分子标记辅助选择育种，对育种起到了巨大的促进作用。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，是一种十分理想、有效的分子标记。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测乌骨鸡纤维黑色素基因纯合或杂合的方法。为了实现本发明目的，本发明提供一种检测乌骨鸡纤维黑色素基因纯合或杂合的方法，其是对乌骨鸡第20号染色体位于10739109bp位点(基于鸡基因组序列信息版本号 WUGSC 2. l/gaK}a13，2006年5月)的核苷酸进行单核苷酸多态性检测，根据检测结果判定乌骨鸡的纤维黑色素基因为纯合或杂合。单核苷酸多态性检测优选采用的方法为焦磷酸测序。本发明还检测乌骨鸡纤维黑色素基因纯合或杂合的引物，包括F 5' -GCCCCTTCCTGAAGCAATA-3‘和 R:5' -CATGCAGGATCTCTATGAAGAAAA-3‘。本发明还提供检测乌骨鸡纤维黑色素基因纯合或杂合的探针，其核苷酸序列为CN 102534006 A5' -GTATTCTAGAAGCCATTCC-3‘。本发明还提供含有上述引物及探针的检测乌骨鸡纤维黑色素基因纯合或杂合的试齐U盒。本发明进一步提供一种检测乌骨鸡纤维黑色素基因纯合或杂合的方法，其是以乌骨鸡的基因组DNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增，然后用上述探针对扩增产物进行单核苷酸多态性检测，根据检测结果判定乌骨鸡的纤维黑色素基因为纯合或杂合；其中，单核苷酸多态性检测是针对第20号染色体位于10739109bp位点的核苷酸。PCR反应体系为基因组DNA 30ng，Ix扩增缓冲液，Mg2+50mM，dNTPs 5mM，引物F 10 μ M，引物R 10 μ Μ, Taq DNA聚合酶1U，加水补至25 μ 1。PCR 反应条件为95°C 变性 5min ；95°C 变性 15sec，57°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，共 45 循环；72°C延伸 7min ；20°C保存。检测待测鸡第20号染色体位于10739109bp位点的基因型是AG还是GG (A为腺嘌呤核苷酸，G为鸟嘧啶核苷酸)；当基因型是AG时，A G= 1 1，则表示该位点在两条染色体上都存在CNV (基因拷贝数变异)，每条染色体上都有一个拷贝的基因型是AA，一个拷贝的基因型是GG，待测鸡为Fm黑色显性纯合；A G= 1 2时，则表示该位点只在一条染色体上存在CNV，一个拷贝的基因型是AA，一个拷贝的基因型是GG，另一条染色体上不存在 CNV,只有一个拷贝，基因型是GG，待测鸡为Fm黑色显性杂合；如果待测鸡的基因型为GG，则表示该位点在两条染色体上都不存在CNV，每条染色体上都只有一个拷贝，基因型是GG，待测鸡为fm非黑色隐性纯合。其中，单核苷酸多态性检测采用的检测方法为PyroMark ID定量遗传分析系统 (Biotage公司)的Pyrosequencing焦磷酸测序技术。上述方法、引物对和探针、试剂盒可应用于鸡的育种。本发明所提供的方法和产品(引物、探针、试剂盒)，对乌骨鸡的Fm黑色性状纯合 /杂合进行选择，可以直接将Fm黑色性状纯合子个体保留下来，从而大大地提高育种和保种效率。本发明为鸡育种的分子标记辅助选择提供了一个高效准确、简便快速的分子遗传标记，为鸡的Fm黑色性状的选种和保种提供了一种有效的分子标记育种手段。用该遗传标记对鸡的Fm黑色性状进行标记辅助选择，可有效地缓解实际育种和保种中的无法区分Fm 黑色纯合子和杂合子的问题，提供选种保种效率，并为利用该性状进行分子聚合育种奠定基础，将加快育种进程。本发明的检测方法操作简单，费用低廉，准确度高，可实现自动化检测。根据本发明的方法开发出相应的检测试剂盒，可用于选择携带有利基因型(AG，A G =1 1)的个体，为鸡的育种保种工作提供便利。
图1为本发明Pyrosequencing焦磷酸测序方法检测纯合子个体的乌骨鸡第20号染色体位于10739109bp位点的单核苷酸多态性(基因型AG，A G = 1 1)。图2为本发明Pyrosequencing焦磷酸测序方法检测杂合子个体的乌骨鸡第20号染色体位于10739109bp位点的单核苷酸多态性(基因型AG，A G = 1 2)。图3为本发明Pyrosequencing焦磷酸测序方法检测非黑色性状鸡第20号染色体位于10739109bp位点的单核苷酸多态性(基因型GG)。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用试验材料及试剂均为市售商品。实施例中涉及的“ ％ ”，如无特殊说明，均为质量百分数。实施例1 Pyrosequencing焦磷酸测序检测方法的建立及多态位点的确定1基因型分析1. 1家系构建构建专门用于研究定位影响鸡结缔组织黑色素沉积的纤维黑色素基因(Fm)的实验群体，构建方法为F0代亲本为丝羽乌骨鸡公鸡1只和尤溪麻鸡母鸡3只， 采用人工受精的方法，待收集到30枚蛋后同时入孵；Fl代出雏后，所有雏鸡在同一饲养条件下按常规方法饲养，待性成熟后，从中挑选3只皮肤黑色程度深，且黑度相近的公鸡，每只公鸡与10只尤溪麻鸡母鸡组成家系，共组成3个家系，采用人工受精的方法，每收集到 120枚蛋后入孵，共入孵两批；F2代出雏后，所有雏鸡在同一饲养条件下按常规方法饲养至 12周龄。1. 2实验材料本实验选取了 Fm家系的3个家系的F0、F1和F2代个体，共计M5 个。在Fm家系中记录了 F0、Fl和F2代个体的鸡冠、脚胫、各种结缔组织及真皮层皮肤颜色。1. 3基因组DNA的提取鸡12周龄时翅静脉采血，抗凝处理后裂解，经蛋白酶K消化后，用酚仿抽提，TE溶解-20°C保存。1.4 PCR 扩增以提取的基因组DNA为模板，用引物对跨第20号染色体10739109bp位点(基于鸡基因组序列信息版本号WUGSC 2. l/g￡dGal3，2006年5月)的片段(Seq ID No. 4)进行 PCR扩增。 F 5' -GCCCCTTCCTGAAGCAATA-3‘R 5' -biotin-CATGCAGGATCTCTATGAAGAAAA-3‘PCR反应体系05 μ 1)终浓度为基因组DNA 30ng，Ix扩增缓冲液，Mg2+50mM, dNTPs 5mM, F 10 μ Μ, R 10 μ Μ，Taq Gold DNA 聚合酶 1U，加灭菌水补至 25 μ 1。PCR 反应条件95°C变性 5min ；95°C变性 I5Sec, 57O退火 30sec, 72°C延伸 3Osec, 共45循环；72°C延伸7min ；20°C保存。1.5 PCR产物检测取5 μ 1 PCR产物进行2 %琼脂糖凝胶检测。1. 6焦磷酸测序应用PyroMark ID定量遗传分析系统，以PCR产物为模板，用引物对10739109bp 位点进行焦磷酸测序。使用的探针为S 5' -GTATTCTAGAAGCCATTCC-3‘1. 6. 1试样预处理，单链分离纯化操作1)在使用前，保证所有溶液都达到室温；2)在PSQ 96板中预先加入45 μ 1含有0.3 μ M测序引物的退火引物，一般情况下加入IOpM引物2μ 1 ；3)使用 Vertex 混勻 Sepharose beads ；4)将需要使用的s印haroe beads总量(每样本3 μ 1)转移到一个Eppendorf管中；5)在s印harose beads中加入结合缓冲液，使得平均每个样品约有50 μ 1的体积， 将混合物混勻；6)将以上混合物加入PCR产物(50 μ 1反应体积)中，每样本50 μ 1 ；7)将PCR产物在常温下混勻10分钟，使得beads与生物素结合，对于较长片段，可适当延长混勻时间；8)在Vacuum prep workstation中，四个样品板中依次加入180ml高纯水、70%乙醇、洗涤缓冲液和120ml变性缓冲液；9)打开 vacuum prep workstation 的泵，将 vacuum prep tool 在高纯水中清洗 30 秒；然后将 vacuum prep tool 移至Ij PCR 板中，抓取 s印harose beads (请在 beads 与 PCR 产物结合后三分钟内完成此操作，不要让Beads又沉到管底)；拿起PCR板，检查是否大部 ,Jf beads 者vacuum prep tool _t ；10)将 vacuum prep tool 放入 70% 乙醇中 5 秒；11)然后移到变性缓冲液中5秒；12)再移到洗涤缓冲液中清洗5-10秒；13)把吸头放在相应含有测序引物的板孔的上方，不要接触液面，关掉泵；14)将vacuum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放s印harose beads (测序引物也可最后加入)15)使用高纯水清洗 vacuum prep tool ；16)将放有样品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加热到80°C 2分钟，再冷却到室温，艮阿进行Pyrosequencing反应。1.6.2试样上机1)打开 PyroMark ID 主机；2)打开电脑和相应操控软件；3)选择 SNP，SNP Runs 和 New SNP Run (或选择 SQA)；4)填入 Run name,选择 Instrument parameters ；5)选择需要使用的样品孔，并点击Activate ；6)在 Entry 中填入 SNP entry (或 SQA)；7)准备好样品，并加入样品板中；8)准备酶和底物，并将所有试剂在使用前在室温下放置10分钟；9)将酶、底物和dNIPs加入试剂舱中；10)将放有试样的经过试样预处理的PSQ 96 Plate Low放置在仪器上；11)核实仪器参数选择；12)点击Run按钮，运行；13)分析结果产生三种基因型
第一种基因型AG，A G = 1 1，待测鸡为Rn黑色纯合；第二种基因型AG，A G = 1 2，待测鸡为Rn黑色杂合；第三种基因型GG，待测鸡为fm非黑色纯合。2相关性分析结果如表1所示，该结果表明，在所检测的245个个体中，AG(A G = 1 1)基因型有2个，AG(A G=I 2)基因型有106个，GG基因型有137个，AG (A G=I 1) 基因型个体和AG(A G= 1 2)基因型个体均为Fm黑色性状表型，GG基因型个体均为 fm非黑色性状表型。其中AG(A G= 1 1)基因型个体均为显性纯合子，AG(A G = 1 2)基因型个体均为显性杂合子，而GG基因型个体均为隐性纯合子。表1第20号染色体10739109bp位点不同基因型与Fm黑色性状的相关性分析统计
权利要求
1.一种检测乌骨鸡纤维黑色素基因纯合或杂合的方法，其特征在于，对乌骨鸡第20号染色体位于10739109bp位点的核苷酸进行单核苷酸多态性检测，根据检测结果判定乌骨鸡的纤维黑色素基因为纯合或杂合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，单核苷酸多态性检测所采用的方法为焦磷酸测序。
3.检测乌骨鸡纤维黑色素基因纯合或杂合的引物，包括F 5' -GCCCCTTCCTGAAGCAATA-3‘；和R 5' -CATGCAGGATCTCTATGAAGAAAA-3‘。
4.检测乌骨鸡纤维黑色素基因纯合或杂合的探针，其核苷酸序列为 5' -GTATTCTAGAAGCCATTCC-3‘。
5.检测乌骨鸡纤维黑色素基因纯合或杂合的试剂盒，其含有权利要求3所述的引物及权利要求4所述的探针。
6.一种检测乌骨鸡纤维黑色素基因纯合或杂合的方法，其特征在于，以乌骨鸡的基因组DNA为模板，采用权利要求3所述的引物进行PCR扩增，然后用权利要求4所述的探针对扩增产物进行单核苷酸多态性检测，根据检测结果判定乌骨鸡的纤维黑色素基因为纯合或杂合；其中，单核苷酸多态性检测是针对第20号染色体位于10739109bp位点的核苷酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，单核苷酸多态性检测所采用的方法为焦磷酸测序。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应体系为基因组DNA30ng, Ix扩增缓冲液，Mg2+50mM，dNTPs 5mM，引物F 10 μ M，引物R 10 μ Μ, Taq DNA聚合酶1U，加水补至25μ 1。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为95°C变性5min;95°C 变性 15sec，57°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，共 45 循环；72°C延伸 7min ；20°C保存。
全文摘要
本发明提供了一种检测乌骨鸡纤维黑色素基因纯合/杂合的方法，其是对乌骨鸡第20号染色体位于10739109bp位点(基于鸡基因组序列信息版本号WUGSC 2.1/galGal3，2006年5月)的核苷酸进行单核苷酸多态性检测，根据检测结果判定乌骨鸡的纤维黑色素基因为纯合或杂合。通过对乌骨鸡的Fm黑色性状纯合/杂合进行选择，可以直接将Fm黑色性状纯合子个体保留下来，从而大大地提高育种和保种效率。本发明的检测方法操作简单，费用低廉，准确度高，可实现自动化检测。
文档编号C12Q1/68GK102534006SQ201210011338
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者李宁, 田明, 胡晓湘 申请人:中国农业大学