专利名称：一种基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物技术和分析技术领域，具体的说是ー种基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统及其在木糖快速检测中的应用。
背景技术：
木糖是ー种重要的碳水化合物，在人们的生产生活中具有非常重要的作用。在自然界中，天然D-木糖是以多糖的形态存在于植物中，它们在农产品的废弃部分中(例如玉米的穗轴、秸杆、棉桃的外皮)含量很高，木糖是其自然降解和人为降解中的重要产物。利用木糖发酵生产こ醇可以提高原料的利用率和燃料こ醇的产量，降低燃料こ醇的生产成本，因此目前已经受到越来越多的关注。在细菌中有的能利用D-木糖作为碳源生长，在动物中羊几乎能完全地利用木糖。在动物的蛋白多糖中D-木糖与多肽链的丝氨酸残基以糖苷键连接，成为多糖侧链与蛋白质的桥接结构。木糖醇是木糖通过加氢制得的，其用途非常广泛。在发达国家木糖已应用于宠物饲料。木糖可以作为糖尿病人的耐受性好的无热量甜味剂、营养剂和治疗剂。它还可以作为加热食品增香剂，用于焙烤食品、火腿、香肠、腊肉、人造肉等。木糖还被广泛应用于肉食加工、肉类香料以及制备食品抗氧剂等方面。另外，木糖已作为软化剂、离子表面活性剤、增塑剂、水分调节剂等用于油漆、牙膏、卷烟、制革、鋳造、火药等多种行业。因此，快速、高灵敏度、高选择性、实时的木糖检测对遗传、人类营养、食品技术、医药以及包括生物燃料在内的生物过程等领域极其重要。目前，木糖的检测方法有还原法、酶学方法、色谱法、拉曼光谱法和红外光谱法等。但是这些方法存在各种各样的问题，例如，采用还原法检测时，其灵敏度较低，而且易受到其他有顔色和还原性物质的干扰；在酶学方法中，酶的来源和纯化是个至关重要的问题；色谱法包括气相色谱法、液相色谱法和离子色谱法，存在的主要问题是样品制备过程复杂、操作费时、误差较大、需要昂贵设备等。因此，建立ー种快速、灵敏、特异的木糖实时检测方法，势在必行。 酶学方法的优点是灵敏度高、特异性好，但是酶的纯化和稳定性是难以解决的问题。木糖脱氢酶(XDH) (EC 1.1.1.175)是ー些微生物中木糖代谢途径的关键酶。木糖在木糖脱氢酶的催化下，借助于辅酶NAD+，被氧化成木糖酸内酷，辅酶NAD+则被还原为NADH。细菌表面呈现系统是微生物表面呈现系统的ー个重要分支，其基本策略也是将外源蛋白或多肽与细菌表面蛋白融合或嵌合并活性表达于细菌表面。自从发现大肠杆菌外膜蛋白LamB、OmpA和PhoE能够作为外源蛋白的表面呈现载体以来，该技术得到了迅猛发展，现已成为研究的热点，在微生物学、分子生物学、疫苗学等多个领域的基础和应用研究中得到了广泛应用。冰核蛋白(ice-nucleation protein, INP))是丁香假单胞菌等菌株的外膜蛋白，可加速纯水的冰晶形成。INP通过糖基磷脂酰肌醇而锚定在细菌表面，利于大分子蛋白的表面呈现。冰核蛋白细菌包括假单胞菌属、欧文氏菌属和黄单胞菌等。目前，利用全长的冰核蛋白、去掉中间重复序列的串连N端、C端结构域的蛋白或只用N端结构域的蛋白均在大肠杆菌表面成功展示了外源蛋白，例如:绿色荧光蛋白、几丁质酶和磷酸盐结合蛋白等。近年来,在Pseudomonas borealis菌株中发现一种新的冰核蛋白基因inaPb,它与已熟知的冰核蛋白只有 66 %的同源性。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于冰核蛋白的细菌表面展示系统及其在木糖检测中的应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:ー种基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统:细菌表面展示系统为编码目标蛋白木糖脱氢酶的基因序列xylB和负责跨膜定位和转运的冰核蛋白N端结构域的基因序列 inaPb-N。编码目标蛋白木糖脱氢酶的基因序列XylB和负责跨膜定位和转运的冰核蛋白N端结构域的基因序列inaPb-N融合，表达于宿主细胞表面，得到基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统。基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统的应用:所述细菌表面展示系统用于木糖的高特异性、高灵敏度检测。所述细菌表面展示系统用于D-木糖的高特异性、高灵敏度检測。检测原理是木糖在菌体表面的木糖脱氢酶的催化下，借助于辅酶烟酰胺腺嘌呤ニ核苷酸(NAD+)被氧化成木糖酸内酷，辅酶NAD+则被还原为还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。NADH在340nm处有特征吸收峰，因此可以根据340nm处的吸光值来求得木糖的含 量。本发明的效果是:1.本发明利用冰核蛋白表面展示系统将木糖脱氢酶稳定地展示在细菌的表面，从而解决了胞内酶提取过程复杂和稳定性低的难题。2.本发明细菌表面展示的木糖脱氢酶酶活高，与原始菌株中胞内的木糖脱氢酶相比，稳定性好。3.本发明细菌表面展示的木糖脱氢酶特异性好，其他糖类，如D-葡萄糖、纤维ニ糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-核糖、D-果糖、D-蔗糖、D-木糖醇、D-麦芽糖和L-阿拉伯糖对D-木糖的测定均无干扰。4.本发明构建的基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统灵敏度高，具有较宽的木糖检测范围(5-900 PM)和较低的检测限(2 PM)。5.本发明构建的木糖脱氢酶展示菌株可以固定在电极上，构建电化学生物传感器，实现木糖的检测，而且此菌体可以重复多次使用，稳定性好。6.本发明构建的木糖脱氢酶展示菌株可开发成ー种生物催化剂，用于生物燃料电池等领域。7.通过本发明提供的细菌表面展示系统建立了木糖快速检测的方法。此方法灵敏度高、特异性好、操作简单、成本低，可用于食品、果蔬、糖酒饮料、肉食、食品添加剤、保健品、医药，和化妆品、牙膏、卷烟等エ业领域，以及发酵、生物转化、生物能源等生物过程领域中木糖的监测。
图1为本发明实施例提供的木糖脱氢酶基因xdh的PCR产物胶回收图。A是DL2000分子量标准是基因xdh的PCR产物胶回收条帯。图2为本发明实施例提供的木糖脱氢酶基因inaPb-N的PCR产物胶回收图。A是DL2000分子量标准；B是基因inaPb-N的PCR产物胶回收条带。图3为本发明实施例提供的木糖脱氢酶细菌表面展示系统的载体构建流程图。图4为本发明实施例提供的紫外分光光度计检测D-木糖的标准曲线图。本发明目的、功能及优点将结合实施例，參照附图做进ー步说明。
具体实施例方式本发明构建基于木糖脱氢酶细菌表面展示系统，利用紫外分光光度计检测信号，从而得到木糖的含量，进而用于木糖的快速检测，具体为:1.构建基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统；2.制作木糖检测的标准曲线；3.測定实际样品中的木糖，根据标准曲线计算得出木糖的含量。实施例1细胞表面展示木糖脱氢酶菌体的获得:1.培养木糖脱氢酶的新月柄杆菌株(Caulobacter crescentus NA1000)(市购产品):将上述菌株接种于培养基中置30°C，200rpm，摇床培养24小时。培养基成分:植物蛋白胨5.0g，酵母提取物2.5g，K2HPO4 3.7g, KH2PO4L 3g,MgSO4 7H20 0.5g，NaCl 1.0g,蒸馏水 1.0L, pH 7.2-7.5，高温灭菌，待用；2.培养冰核蛋白细菌Pseudomonas borealis (市购产品):将上述菌株于培养基中置22°C，200rpm，摇床培养16小时。培养基成分是:胰蛋白胨1.5% (g/100ml)，大豆蛋白胨0.5% (g/100ml)，氯化钠
0.5% (g/100ml)，用蒸馏水配制而成，调节pH为7.2±0.2，经121 °C压カ蒸汽灭菌后，待用。3.重组表达载体的构建。I)以新月柄杆菌(C.crescentus NA1000)基因组DNA为模板,设计并合成引物,进行PCR扩增，得到编码木糖脱氢酶的基因xylB。引物是Pl (5，— 3，):CGGGATCCATGTCCTCAGCCATCTATCCCAGCC 和 P2 (5，— 3，):CCCAAGCTTACGCCAGCCGGCGTCGATCCAGT。PCR 反应体系为:ddH20 34.7 y L，模板DNA 1 u L, IOXPCR Buffer (Mg2+Free) 5 u L,MgCl2(25mmol/L)3u L,引物 Pl (20pmol/y L) I y L，引物 P2 (20pmol/μL) I y L，dNTPMixture (各 2.5mmol/L)4u L, TaKaRa Taq (5U/u L) 0.3 u L0 反应參数为:95°C 预变性 5min，94°C 30s，59°C 30s, 72°C 60s，30 个循环，最后 72°C延伸 lOmin。将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化回收(參见图1)，连接于PMD-19Tsimple载体,构建重组质粒,命名为pMDXdh。2)以冰核蛋白细菌Pseudomonas borealis菌株基因组DNA为模板,设计并合成引物，进行PCR扩增，得到编码冰核蛋白N端结构域的基因inaPb-N。
弓丨物是 P3 (5，— 3，):CATGCCATGGGCATGAACGATGACAAAGTTTTGGTC 和 P4 (5，— 3，):CGGGATCCCACCGCTGTCTCCAGCGTTTGTG。PCR 反应体系为:ddH20 34.7 y L，模板DNA I u L, 10XPCR Buffer (Mg2+Free) 5 u L,MgCl2(25mmol/L)3u L,引物 P3 (20pmol/y L) I y L，引物 P4 (20pmol/y L) I y L，dNTPMixture (各 2.5mmol/L)4u L, TaKaRa Taq (5U/u L) 0.3 u L0 反应參数为:95°C 预变性 5min，94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 60s，30 个循环，最后 72°C延伸 lOmin。将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化回收(參见图2)，连接于pMD-19Tsimple载体。得到的重组载体用限制性内切酶Nco I和BamH I双酶切，然后连接到经同样双酶切的载体pET28a(+)上，得到的重组载体命名为pTInaPb-N。3)将上述载体pMDXdh用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切，然后与同样双酶切的载体PTInaPb-N连接，得到xylB和inaPb-N的融合基因；4.重组载体的表达。将重组载体转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),即得到细胞表面展示木糖脱氢酶的菌体(參见图3)。酶切鉴定正确后接种于新鮮的含卡那霉素(30ii g/ml)的LB液体培养基中，振荡培养至吸光度(OD6J为 0.4时，加入IPTG (异丙基-0-D-硫代吡喃半乳糖苷)使其终浓度为lmmol/L，25°C诱导培养24h，待用。大肠杆菌E.coli BL21(DE3)在LB培养基中培养，LB培养基成分为:5g/L酵母膏，10g/L 蛋白胨，10g/L NaCl。实施例2利用构建的木糖脱氢酶细菌表面展示系统，借助紫外分光光度计进行木糖的快速检测:
1.标准曲线的绘制:将上述实施例所得细胞表面展示木糖脱氢酶菌体进行诱导表达，24h后收获菌体，用50mM PBS缓冲液(pH 8.0)洗涤三次，将菌体密度调整至OD6tltl =
1.0。向Iml反应液(50mM PBS缓冲液，pH 8.0)中加入上述100 u L的菌液、NAD+(终浓度为ImM)和不同浓度的D-木糖溶液(终浓度为0-1000 u M)，进行平行操作，混匀，在30°C水浴锅中放置，10分钟后取出，12000rpm/min，离心I分钟，取上清液，移入微量比色皿中，波长340nm处进行光谱測定，以50mMPBS缓冲液(pH 8.0)调零。最后以木糖浓度为横坐标，波长340nm处的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，可得一条直线，求出其斜率，即为D-木糖的工作标准曲线斜率(參见图4)。D-木糖的工作标准曲线如图4所示，由图可知，该工作标准曲线的R2值达到
0.999，线性拟合度很好，其斜率为0.0029。2.D-木糖的检测过程。向反应液中加入上述IOOii L的菌液、NA+(最终浓度为ImM)和经稀释过的含有D-木糖的待测样品，进行平行操作，混匀，在30°C水浴锅中放置，10分钟后取出，离心，取上清液于分光光度计波长340nm处测量其吸光度，以50mM PBS缓冲液(pH8.0)调零。根据测得的吸光度，利用D-木糖工作标准曲线计算出D-木糖的含量。实施例3秸杆经过物理化学处理之后的降解产物中D-木糖含量的测定:1.样品处理:将秸杆经物理化学处理之后的降解液用0.22 Pm的一次性滤膜进行过滤处理，用50mM PBS缓冲液(pH 8.0)进行稀释(稀释比例分别是10倍、100倍、1000
倍)，备用。
2.制备展示有木糖脱氢酶的菌体:将上述实施例所得细胞表面展示木糖脱氢酶菌体接种于新鲜的含卡那霉素(30iig/ml)的LB液体培养基中，振荡培养至吸光度(0D_)为 0.4时，加入IPTG使其终浓度为lmmol/L，25°C诱导培养24h，收获菌体，洗涤，用50mMPBS缓冲液(pH 8.0)将菌体密度调整至OD600 = 1.0。3.D-木糖检测过程:具体步骤见实施例2。4.D-木糖浓度的计算:取吸光值在标准曲线范围内的稀释比例的吸光值来进行计算，代入标准曲线得出的计算公式，最后乘以相应的稀释倍数，从而得到原秸杆降解液中D-木糖的浓度为84.87 ± 1.45mM。D-木糖浓度计算公式为:
权利要求
1.一种基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统，其特征在于:细菌表面展示系统为编码目标蛋白木糖脱氢酶的基因序列xylB和负责跨膜定位和转运的冰核蛋白N端结构域的基因序列inaPb-N。
2.按权利要求1所述的基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统，其特征在于:编码目标蛋白木糖脱氢酶的基因序列xylB和负责跨膜定位和转运的冰核蛋白N端结构域的基因序列inaPb-N融合，表达于宿主细胞表面，得到基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统。
3.一种权利要求1所述的基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统的应用，其特征在于:所述细菌表面展示系统用于木糖的高特异性、高灵敏度检测。
4.权利要求3所述的基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统的应用，其特征在于:所述细菌表面展示系统用于D-木糖的高特异性、高灵敏度检测。
全文摘要
本发明涉及生物技术和分析技术领域，具体的说是一种基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统及其应用。细菌表面展示系统为编码目标蛋白木糖脱氢酶的基因序列xylB和负责跨膜定位和转运的冰核蛋白N端结构域的基因序列inaPb-N。将所述细菌表面展示系统用于木糖检测。本发明对木糖检测的方法灵敏度高、特异性好、方法简单，适用于食品、果蔬、糖酒、饮料、肉食、食品添加剂、保健品、医药，和化妆品、牙膏、卷烟等工业领域，以及发酵、生物转化、生物能源等生物过程领域中木糖的监测。
文档编号C12N1/21GK103087969SQ201210007398
公开日2013年5月8日 申请日期2012年1月11日 优先权日2011年10月28日
发明者刘爱骅, 梁波 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所