专利名称：籽粒特异性启动子及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种籽粒特异性启动子及其应用。
背景技术：
启动子是RNA聚合酶能够识别并与之结合，从而起始基因转录的一段DNA序列，通常位于基因上游。一个典型的启动子包括CAAT-box和TATA-box，它们分别是RNA聚合酶的识别和结合位点，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处。在核心启动子上游通常会有一些特殊的DNA序列，即顺式作用元件，转录因子与之结合从而激活或抑制基因的转录。一旦RNA聚合酶定位并结合在启动子上即可启动基因转录，因此启动子是基因表达调控的重要元件，它与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子的相互作用是启动子调控基因转录的实质。根据启动子的转录模式可将其分为三类组成型启动子、特异性启动子(组织或器官特异性启动子)和诱导型启动子。在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异， 因而称之为组成型启动子。双子叶植物中最常使用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒 (CaMV)35S启动子，单子叶植物中常用的组成型启动子是玉米的泛素蛋白(ubiquitin)启动子，水稻的肌动蛋白(actin)启动子等。由于组成型启动子驱动的基因在植物各组织中均有不同程度表达，在应用中逐渐暴露出一些问题。例如外源基因在整株植物中表达，产生的大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡，有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了植物的正常生长，甚至导致死亡。另外，重复使用同一种启动子驱动两个或两个以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象。因此，人们寻找更为有效的特异性启动子代替组成型启动子，以便更好地调控植物基因表达。特异性启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中，如根、茎、 叶、果实和种子特异性启动子。目前，已发现这类启动子中一般同时存在几种控制组织特异性表达的元件，其表达特异性由这些元件的种类、数目及相对位置等共同决定。禾谷类作物是人类主要的食物来源，种子是其可以食用的部分。随着基因工程的发展，人们从禾谷类作物中克隆了许多种子特异性启动子，并将它们应用于禾谷类籽粒品质的改良之中。应用较多的是来源于普通小麦的高分子量麦谷蛋白亚基1Dx5、Bxl7、水稻的Glt等。但这些启动子的启动外源基因表达活性存在差异，其表达活性不能满足基因工程的需要，而且在需要多基因串联时，如果利用同一启动子驱动不同的基因表达，很容易导致基因沉默。因此，多途径寻找转录效率更高的种子特异性启动子，对于提高目标基因的表达，改良禾谷类植物的加工和营养品质具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种籽粒特异性启动子及其应用。本发明提供的启动子，获自燕麦品种冀张燕1号，是序列表中序列1所示的DNA分子。
含有所述启动子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。可用现有的表达载体构建含有所述启动子的重组表达载体。为了便于鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。所述重组表达载体具体可为将所述DNA分子插入质粒PCAMBIA3301的多克隆位点得到的重组质粒。本发明还保护一种在植物籽粒中特异表达外源基因的方法，是将DNA片段甲导入植物中，从而在植物籽粒中特异表达所述外源基因；所述DNA片段甲中由所述启动子启动所述外源基因的表达。所述DNA片段甲具体可通过重组表达载体导入所述植物；所述重组表达载体可为将所述DNA分子和所述外源基因插入质粒pCAMBIA3301的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、 显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。本发明还保护一种在植物籽粒中特异表达基因的方法，是将含有所述启动子的重组表达载体导入植物中，由所述启动子启动其下游基因在植物籽粒中特异表达。所述重组表达载体具体可为将所述DNA分子插入质粒pCAMBIA3301的多克隆位点得到的重组质粒。 所述基因具体可为Gus基因。所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。以上任一所述的方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦，如小麦K35。本发明提供的启动子具有高效的启动活性和高度的组织特异性表达，为利用转基因技术改良小麦的籽粒性状提供了良好的基础材料。
图1为新克隆启动子(序列1)与已有序列(序列2)的比对图。图2为启动子发现过程中的PCR电泳图；1-6为PCR产物，M为分子量标记。图3为构建重组质粒甲过程中的PCR鉴定电泳图；M为分子量标记，其它泳道均为连接产物。图4为构建重组质粒甲过程中的酶切鉴定电泳图；M为分子量标记，其它泳道均为连接产物。图5为用重组质粒甲制备的再生苗的PCR鉴定电泳图；M为分子量标记；CK+为重组质粒甲，CK-为小麦K35 ；其它泳道均为再生苗。图6为三种转基因植株的根和叶Gus染色后的照片；1 为转基因植株甲；2为转基因植株乙；3为转基因植株丙。图7为三种转基因植株的籽粒Gus染色后的照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。质粒PGEM-iTeasy、质粒pCAMBIA3301和质粒pCAMBIA1381xb均购自长沙赢润生物技术有限公司(http://WWW. yrbio. com)。用于质粒DNA和基因组DNA提取的试剂盒购自天根生化科技有限公司(http://www.tiangen.com/)。金粉及基因枪转化过程中所需的耗材均购自北京元业伯乐科技发展有限公司(http://www. ybr. com, cn)。各种无机盐、维生素、抗生素、激素，以及Gus染色所需的试剂均购自Sigma-Aldrich中国公司(http://www. sigmaaldrich. com/china-mainland, html)。燕麦品种冀张燕1号公众可从中国农业科学院作物科学研究所和山东省农业科学院作物研究所获得；参考文献利用核不育莜麦ZY基因育成优质高蛋白燕麦新品种.杨才，张新军，杨晓虹，李天亮.河北北方学院学报(自然科学版)，2009，25(1)39-41。小麦K35 是山东省农科院作物所自行选育的具有良好幼胚培养能力的新种质； 公众可从中国农业科学院作物科学研究所和山东省农业科学院作物研究所获得；参考文献隋新霞，黄承彦，楚秀生，李根英，樊庆琦.易花药培养的早熟小麦新种质K35.山东农业科学，2007年第一期，116-117页。脱分化培养基按照如下方法制备将2，4-D、特美汀和MS培养基混合，得到脱分化培养基；2，4-D在所述脱分化培养基中的浓度为ang/L，特美汀在所述脱分化培养基中的浓度为 150mg/L。渗透培养基按照如下方法制备将2，4_D、特美汀、山梨醇、甘露醇和MS培养基混合，得到渗透培养基；2，4-D在所述渗透培养基中的浓度为ang/L，特美汀在所述渗透培养基中的浓度为150mg/L，山梨醇在所述渗透培养基中的浓度为0. 2M，甘露醇在所述渗透培养基中的浓度为0. 2M。诱导筛选培养基按照如下方法制备将2，4-D、Biolaphos和MS培养基混合，得到诱导筛选培养基；2，4-D在诱导筛选培养基中的浓度为ang/L，Biolaphos在诱导筛选培养基中的浓度为5mg/L。再生筛选培养基按照如下方法制备将KT、Bi0laph0S和MS培养基混合，得到再生筛选培养基；KT在所述再生筛选培养基中的浓度为ang/L，Biolaphos在所述再生筛选培养基中的浓度为5mg/L。后期筛选培养基将Biolaphos和MS培养基混合，得到后期筛选培养基，所述 Biolaphos在所述后期筛选培养基中的浓度为5mg/L。实验例1、特异性启动子的发现和序列分析一、启动子序列的发现1、用DNA提取试剂盒(天根)从燕麦品种冀张燕1号在黑暗中萌发的幼苗中提取基因组DNA。2、根据现有启动子(GENBANKACCESSION NO. AY795082，见序列表的序列2)的保守区设计一对引物如下Fl (上游弓丨物)5，-cgaagctttggaaagtcattttgcctc-3‘；
Rl (下游弓丨物)5，-gcccatgggagattgtagaaggtggattgg-3‘。3、以步骤1的基因组DNA为模板，用步骤2设计的引物对进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物。PCR体系(20 μ 1)含50ng基因组DNAUOpmol上游引物、IOpmol下游引物、dNTPs 各 250μΜ、2μ1 10Xbuffer(50mM KClUOmM Tris-HCl U. 5mM MgCl2, pH 8. 3)和 2. OU pfu
聚合酶(大连宝生物)，其余为水。PCR 程序:94°C 3 分钟；94°C 45 秒、60°C 45 秒、72°C 1 分钟，36 个循环；72°C 10 分钟。4、将PCR扩增产物进行1. 2%琼脂糖胶电泳，EB染色后进行紫外观察照相，电泳图见图2。5、从步骤4的电泳胶中回收约961bp的目的片段，与质粒pGEM-Teasy连接后进行测序，测序结果表明，目的片段如序列表的序列1所示，将在质粒PGEM-Teasy中插入序列表的序列1所示DNA得到的重组质粒命名为重组质粒pTglo (也可人工合成序列1所示DNA 并与质粒pGEM-Teasy连接)。二、启动子的序列分析将序列1与序列2进行比对，见图1，相似性达到99%，存在8个SNP。将序列2作为基础序列，序列1与基础序列的差异如下自5’末端第85位核苷酸由A突变为G，第364 位核苷酸由T变为A，第369位核苷酸由A突变为T，第619位核苷酸和第620位核苷酸之间插入了 A，第639位核苷酸由T突变为C，第700位核苷酸和第787位核苷酸由G突变为 A，第857位核苷酸由T突变为C。实验例2、重组质粒的构建一、重组质粒甲的构建(1)以重组质粒pTglo为模板，用Fl和Rl组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR
扩增产物。(2)用限制性内切酶HindIII和NcoI双酶切步骤(1)的PCR扩增产物，回收酶切产物。(3)用限制性内切酶HindIII和NcoI双酶切质粒pCAMBIA3301，回收载体骨架(约 11076bp)。(4)将步骤O)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到连接产物。(5)将步骤(4)的连接产物依次进行PCR鉴定(采用Fl和Rl组成的引物对)、酶切鉴定(采用HindIII和NcoI双酶切)和测序鉴定，得到重组质粒甲。PCR鉴定电泳图见图3，具有约961bp的目的条带的为阳性。酶切鉴定电泳图见图4，具有约961bp的目的条带的为阳性。根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如下用序列表的序列1所示的DNA取代了质粒PCAMBIA3301的HindIII和NcoI酶切位点之间的小片段(CaMV35S启动子)，由序列1所示的DNA启动Gus基因的表达。二、重组质粒乙的构建(1)合成序列表的序列2所示的DNA分子。(2)以步骤1合成的DNA分子为模板，用Fl和Rl组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。(3)用限制性内切酶HindIII和NcoI双酶切步骤⑵的PCR扩增产物，回收酶切产物。(4)用限制性内切酶HindIII和NcoI双酶切质粒pCAMBIA3301，回收载体骨架(约 11076bp)。(5)将步骤(3)的酶切产物和步骤⑷的载体骨架连接，得到重组质粒乙。根据测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下用序列表的序列2所示的DNA取代了质粒 PCAMBIA3301的HindIII和NcoI酶切位点之间的小片段(CaMV35S启动子)，由序列2所示的DNA启动Gus基因的表达。三、重组质粒丙的构建将质粒pCAMBIA1381xb (—种植物表达载体，含有Gus基因，但没有启动Gus基因表达的启动子)作为阴性对照(重组质粒丙)。实施例3、转基因植物的获得分别用重组质粒甲、重组质粒乙和重组质粒丙制备转基因植株(每种质粒转化 2000个盾片)一、小麦盾片的分离与预处理采集授粉14天的未成熟小麦K35种子(盾片大小Imm)，用75% (体积比)乙醇水溶液处理30秒，0. 1% (g/100mL)升汞(HgCl2)水溶液处理10分钟，在无菌操作台中用解剖针取下幼胚，胚轴朝下接种于脱分化培养基。次日，在显微镜下用15号刀片从种子的胚轴和盾片接触处切除胚轴，得到盾片。将去除胚轴的盾片分别放回脱分化培养基上，保持相同的方向(切面接触培养基)，26°C暗培养3天。然后将盾片集中于内有渗透培养基的培养皿中心约2. 5cm的范围内(每皿约40个)J6°C、暗培养4小时。二、子弹的制备1、金粉母液的制备取1. O μ m的金粉10mg，用70 % (体积比)乙醇水溶液洗3次(每次IOOOOrpm离心1分钟)，加Iml灭菌水振荡2分钟，得到金粉贮藏液。2、子弹的制备将金粉贮藏液充分涡旋，取100 μ 1放入硅化的1. 5ml离心管中，14000rpm离心30 秒，弃上清。加入50 μ 1水将金粉悬浮，在震荡器上边轻微震荡边往里加入10 μ 1 lug/μι 的质粒(重组质粒甲、重组质粒乙或重组质粒丙)，再加入新配制的20 μ 1 0. IM亚精胺水溶液，再加入50 μ 1 2. 5Μ CaCl2水溶液，高速蜗旋3分钟，将离心管放在冰上约2分钟让金粉自动沉淀一会儿，IOOOOrpm离心10秒，弃上清。加750 μ 1无水乙醇，高速蜗旋，然后将离心管放在冰上约2分钟让金粉自动沉淀，IOOOOrpm离心10秒，弃上清，用100 μ 1无水乙醇悬浮，插到冰上或放入-20°C冰箱暂时保存，准备打枪。3、采用基因枪法将步骤二制备的子弹轰击步骤一处理后的盾片，参数如下金粉用量为IOOug/枪、质粒用量为lug/μ 1、轰击距离为9cm，基因枪压力为28，金粉粒度为 1. 0 μ m。三、转基因小麦的获得将基因枪转化后的盾片置于诱导筛选培养基上，26°C暗培养10天。在显微镜下将
7愈伤组织切割成约Imm左右的小块，来源于同一块愈伤组织的小块排在一起，放在诱导筛选培养基上，26°C暗培养20天。选择愈伤组织选择油光发亮的愈伤，转移到再生筛选培养基上，在^TC、光照强度lOOOLux的条件下培养7天。选择5cm左右的苗转移到后期筛选培养基上，在^TC、光照强度lOOOLux的条件下培养20天，得到再生苗(TO代)。将再生苗转移到草炭(KLASMAN)中，在人工气候室中培养(白天20°C、夜晚16°C ；光照16小时/黑暗 8小时)直至收获。实验例4、转基因植株不同部位的Gus基因表达活性分析一、再生苗的PCR鉴定分别将实施例3得到的各个再生苗进行如下鉴定剪取约3cm长的叶尖，提取基因组DNA，用F2和R2组成的引物对(靶序列为Gus基因)进行PCR鉴定，目标片段约为617bp。F2(上游引物)5，-GGTCACTCATTACGGCAAAGT-3，；R2 (下游引物)5，-GACGACCAAAGCCAGTAAAGT-3，。PCR体系(20 μ 1)含50ng基因组DNAUOpmol上游引物、IOpmol下游引物、dNTPs 各 250μΜ、2μ1 10Xbuffer(50mM KClUOmM Tris-HClU. 5mM MgCl2, pH 8.3)禾口 2. OU rTaq聚合酶(大连宝生物)，其余为水。PCR 程序94°C 3 分钟；94 V 30 秒、58 V 30 秒、72 °C 45 秒，36 个循环；72 °C 8 分钟。用重组质粒甲制备的再生苗的部分结果见图5，得到12株阳性植株(转基因植株甲)。采用重组质粒乙得到8株阳性植株(转基因植株乙)。采用重组质粒丙得到5株阳性植株(转基因植株丙)。2、Gus 染色将PCR鉴定为阳性的植株分别进行如下Gus染色⑶S染色液使用液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为pH 7. 0,0. 2M的磷酸钠缓冲液； 所述溶质及其⑶S染色液中的浓度如下0. 5M铁氰化钾、0.5M亚铁氰化钾、10 μ M EDTA, 0. 6mg/L Triton、0. 5mg/ml X-gluc。植株开花两周后，取其部分籽粒、叶和根分别装入5ml离心管中，用Gus染色液完全浸没，37°C震荡过夜，次日用70%乙醇水溶液冲洗3次，观察Gus基因表达强度。三种转基因植株的根和叶中均没有蓝色信号出现，部分植株根和叶的照片见图6。所有转基因植株甲的籽粒中都有蓝色信号出现，所有转基因植株乙的籽粒中都有蓝色信号出现，且转基因甲的籽粒的颜色比转基因植株乙的籽粒的颜色深的多。所有转基因植株丙的籽粒中均没有蓝色信号出现。部分植株籽粒的照片见图7。结果表明，本发明提供的启动子具有良好的籽粒组织特异性，且启动活性优于现有的启动子。
权利要求
1.序列表中序列1所示的DNA分子。
2.含有权利要求1所述DNA分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是将所述DNA 分子插入质粒PCAMBIA3301的多克隆位点得到的重组质粒。
4.一种在植物籽粒中特异表达外源基因的方法，是将DNA片段甲导入植物中，从而在植物籽粒中特异表达所述外源基因；所述DNA片段甲中由权利要求1所述DNA分子启动所述外源基因的表达。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述DNA片段甲通过重组表达载体导入所述植物；所述重组表达载体为将所述DNA分子和所述外源基因插入质粒pCAMBIA3301的多克隆位点得到的重组质粒。
6.一种在植物籽粒中特异表达基因的方法，是将含有权利要求1所述DNA分子的重组表达载体导入植物中，由所述DNA分子启动其下游基因在植物籽粒中特异表达。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述重组表达载体是将所述DNA分子插入质粒pCAMBIA3301的多克隆位点得到的重组质粒。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述基因为Gus基因。
9.如权利要求4或8中任一所述的方法，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述单子叶植物为小麦。
全文摘要
本发明公开了一种籽粒特异性启动子及其应用。本发明提供的启动子为序列表中序列1所示的DNA分子。本发明还提供了一种在植物籽粒中特异表达基因的方法，是将含有所述DNA分子的重组表达载体导入植物中，由所述DNA分子启动其下游基因在植物籽粒中特异表达。本发明提供的启动子具有高效的启动活性和高度的组织特异性表达，为利用转基因技术改良小麦的籽粒性状提供了良好的基础材料。
文档编号C12N1/15GK102533766SQ20121000724
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者何中虎, 夏先春, 宋华东, 宋国琦, 李根英, 李玉莲, 高洁, 黄承彦 申请人:中国农业科学院作物科学研究所, 山东省农业科学院作物研究所